新型复合磷酸钙镁基水门汀的生物相容性

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0013

摘要/Abstract

摘要：

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文题释义：

复合磷酸钙镁基水门汀：磷酸钙水泥是一种新型的自固化非陶瓷羟基磷灰石材料，在生理条件下具有原位固化能力、反应温和、生物相容性好，但抗压强度较低、固化时间过长；磷酸镁水泥是一种无机反应型胶黏剂，在人体生理环境下能自行固化形成磷酸镁类生物矿石，具有固化速度快、早期强度高、胶黏性好的特点。以磷酸钙、磷酸镁水泥为主基的复合磷酸钙镁基水门汀具有固化速度较快、固化反应较温和、抗压强度高、生物相容性好等特点，载入其他具有特殊性能的材料可提高复合磷酸钙镁基水门汀材料的相关性能，但其生物相容性与安全性还需要深入探究。

生物相容性：材料在宿主特定部位应用时所产生的一种合乎要求的性能。所谓“合乎要求的性能”应包括2个方面的内容：一方面是指用于人体的生物材料在应用过程中对生物体组织或器官不产生不良反应(如毒性、刺激性、致敏性、致突变性、致癌性、溶血或凝血性等)，即不存在生物危害性；另一方面是生物体环境对被接触的材料也应没有不良作用存在。

背景：课题组将磷酸钙、磷酸镁、硅酸钙、碳酸铋多种材料复合，研制出一种新型的无机复合材料用作修复髓室底穿孔，前期研究显示该复合材料具有良好的理化机械性能。

目的：分析磷酸钙-磷酸镁-硅酸钙-碳酸铋材料的生物相容性。

方法：①细胞毒性实验：通过CCK-8比色法测定磷酸钙-磷酸镁-硅酸钙-碳酸铋材料对L929细胞增殖的影响，评价材料的细胞毒性；②溶血实验：在兔抗凝血中分别加入受试样品浸提液、生理盐水与蒸馏水，检测溶血率；③急性全身毒性实验：将受试样品浸提液、生理盐水分别经小鼠尾静脉注入实验组、对照组动物，观察 24，48，72 h小鼠一般情况，并记录各个时间段的体质量；④Ames实验：采用标准平板掺入法，计数组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97，TA98，TA100，TA102 标准测试菌株在受试样品浸提液下培养72 h的回变菌落数。加S-9混合液作为体外代谢活化系统。

结果与结论：新型无机复合磷酸钙-磷酸镁-硅酸钙-碳酸铋材料的体外细胞毒性为0级，急性溶血、急性全身毒性和Ames实验结果均为阴性，该材料具有良好生物相容性与安全性。

ORCID: 0000-0003-1279-2212(沈晴昳)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 口腔生物材料, 生物相容性, 磷酸钙, 磷酸镁, 体外细胞毒性试验, 急性溶血性试验, 急性全身毒性试验, Ames试验, 国家自然科学基金

Abstract:

BACKGROUND: In our preliminary experiments, calcium phosphate cement, magnesium phosphate cement, calcium silicate and bismuth were mixed to manufacture a novel inorganic composite material, which would be used to repair furcal perforation. This novel composite cement has been confirmed to have excellent physiochemical and mechanical properties.

OBJECTIVE: To study the biocompatibility of calcium phosphate-magnesium phosphate-calcium silicate-bismuth cement (CMSBC).

METHODS: Cytotoxicity test: Relative growth rate of L929 cells cultured in CMSBC extract was analyzed using cell counting kit-8 assay. Acute hemolysis test: The leaching solution of test samples, saline and distilled water were added into the rabbit anti-clotting, to detect the rate of hemolysis. Acute systemic toxicity test: CMSBC lead liquor and normal saline were respectively injected via the tail vein into the mice in experimental group and control group, respectively. The general situation of mice was observed at 24, 48, 72 hours respectively and body weight change was valued. Ames test: In the flat-plate incorporation test of Salmonella typhimurium, the average number of spontaneous revertants of TA97, TA98, TA100 and TA102 of CMSBC leaching liquor was calculated after incubation at 37 ℃ for 72 hours. S-9 mixture was added to the plates as an in vitro activation system.

RESULTS AND CONCLUSION: The cytotoxicity of CMSBC in vitro was grade 0. Negative results from the acute hemolytic test, acute systemic toxicity test and Ames test of CMSBC indicate that this novel inorganic composite material has good biocompatibility and biosecurity.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Calcium Phosphates, Biocompatible Materials, Materials Testing, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

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图/表（结果） 4

2.1 体外细胞毒性分级倒置显微镜下观察CMSBC实验组与阴性对照组无明显差异，细胞形态正常，胞内结构清晰，无空泡变性，并随着培养时间延长细胞大量增殖。阳性对照组细胞数量明显减少，细胞变圆漂浮，随着培养时间的延长，细胞形态完整性破坏，最终形成大量细胞碎片。细胞相对增殖率及细胞毒性分级见表3。

2.2 溶血实验结果见表4。阴性对照管的吸光度小于0.03，阳性对照管的吸光度值在0.8±0.3范围内，符合国家标准。CMSBC实验组的平均吸光度值为0.018 6，溶血率为1.17%，低于5%，溶血实验结果为阴性。

2.3 急性全身毒性实验动物体质量变化在72 h观察期内，CMSBC实验组和对照组小鼠活动如常，均未观察到运动功能减退、步态失稳、震颤、呼吸困难、腹泻等异常表现。各组小鼠的体质量变化见表5，CMSBC实验组与对照组相比差异无显著性意义(P > 0.05)；对照组各时间段的体质量比较，差异无显著性意义(P > 0.05)；CMSBC实验组各个时间段的体质量比较，差异也无显著性意义(P > 0.05)。

2.4 Ames实验回复突变菌落数根据YY/T 0127.10标准，检测样品的回复突变菌落数超过阴性对照2倍，有剂量-效应关系或某一个或某几个剂量点的可重复性，并有统计学意义的阳性反应，则判为诱变阳性。由表6可见，无论在活化(+S9)还是非活化(-S9)条件下，CMSBC试样均未引起测试菌株回复突变菌落数的明显增加，而阳性对照组引起测试菌株的回复突变菌落数明显增加，并超过阴性对照组2倍以上，显示CMSBC材料的回复突变实验结果为阴性。

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引言

牙齿髓室底穿孔后髓腔和牙周组织连通，如修补不及时或修补不当，极易导致牙周组织炎症，牙槽骨吸收，最终造成患牙被拔除。因此，髓室底穿孔治疗的关键在于修复穿孔，才能有效消除炎症，促进牙周组织再生^[1]。国内外学者对髓室底穿孔修复进行了多方面的研究，认为患牙的治疗效果与穿孔大小、穿孔原因以及修复材料的性能密切相关^[2-3]。

目前已应用或报道的髓底穿孔修复材料种类繁多，临床上曾使用或正在使用的有银汞合金、复合树脂、Super-EBA、钙盐类、MTA等，但这些材料都具有一定局限性，迄今尚未有性能理想的材料问世，故髓底穿孔患牙保存率很低。为了提高髓室底穿孔患牙的保存率，许多研究者都致力于研制具有良好物理机械性能和生物学性能的髓底穿修复材料。理想的髓室底穿孔修复材料应具有良好的生物相容性，无毒、无免疫原性，对组织无刺激，能促进牙周组织修复再生，诱导骨或牙骨质形成，封闭性能好，并有杀菌、抑菌作用，价格低廉，操作简便^[4]。由于单一组分材料的性能具有一定局限性，因此，研制既有良好的理化机械性能，又具有生物活性的复合材料是牙科材料发展的方向之一^[5]。

为了提高髓室底穿孔患牙的保存率，课题组研制了一种新型的自固化复合无机材料——磷酸钙-磷酸镁-硅酸钙-碳酸铋复合材料(calcium phosphate/ magnesium phosphate/ calcium silicate/bismuth subcarbonate cement，CMSBC)，用于修补髓室底穿孔。该复合材料各组成成分的某些特性符合理想髓底穿孔修复材料的要求。磷酸钙骨水泥(calcium phosphate ，CPC)在生理环境下可形成与天然骨化学组成、结晶度接近的低结晶度类骨磷灰石^[6]；磷酸镁骨水泥(magnesium phosphate，MPC)固化速度快，固化早期即可获得较高的抗压强度，并具有适度的生物降解性和良好的骨传导性^[7]；硅酸钙水合反应生产的Si-OH凝胶有助于早期形成纳米级磷灰石晶体，具有优良的体外生物活性^[8]，并能促进人骨髓间充质干细胞增殖^[9]；铋剂具有良好的阻射性，而且对细菌、病毒、螺旋体等具有良好的消炎抑菌作用^[10]。

前期实验结果显示，CMSBC材料具有优秀的临床操作性能和良好的理化机械性能^[11-12]。但修补穿孔的材料与牙体、牙周、骨组织都有接触，要求材料必须具有良好的生物相容性和安全性。因此，根据生物材料的生物学评价基本原则、国内外相关标准对CMSBC材料的生物相容性进行初步评价^[13-14]，从而为该材料的进一步研究提供基础。

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材料方法

1.1 设计体外与体内观察实验。

1.2 时间及地点实验于2015年1至10月在浙江大学医学院动物实验中心完成。

1.3 材料

1.3.1 研究材料磷酸钙-磷酸镁-硅酸钙-碳酸铋复合材料(CMSBC)由中国科学院上海硅酸盐研究所制备，由粉剂和液剂组成，使用时按照粉液比1 g/mL调和均匀固化。

1.3.2 实验动物实验用昆明小鼠20只(雌雄各半，3周龄，体质量18-25 g)，新西兰兔1只(雄性，体质量2.46 kg)，成年雄性SD大鼠5只(体质量160-190 g)，全部由浙江大学医学院实验动物中心提供。实验过程中动物处置符合科技部《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.3.3 实验用主要试剂与仪器 L929细胞(中科院上海细胞研究所)；组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102(Molecular Toxicology公司，美国)；CCK-8试剂盒(南京凯基生物科技发展有限公司，中国)；DMEM培养基及胎牛血清(Hyclone公司，美国)；胰蛋白酶及青/链霉素(Gibco公司，美国)。

CO₂恒温培养箱(Heraeus公司，德国)；超净工作台(上海力申公司，中国)；酶联免疫分析仪(Human公司，德国)；显微镜及照相系统(Olympus 公司，日本)；YQ-3型匀浆机(常州诺基仪器有限公司，中国)；TOMYRD-20型全自动冷冻离心机(国华仪器有限公司，中国)；RS-35型超低温冷藏箱(Hitachi，日本)。

1.4 实验方法

1.4.1 体外细胞毒性实验 CMSBC材料按照粉液比 1 g/mL均匀调和呈糊状充填于模具中制成5 mm×1 mm× 30 mm 的样本。固化后的CMSBC样本采用环氧乙烷消毒，按照标准表面积与浸提液体积比例为3 cm²/mL的要求置于DMEM培养基中，37 ℃静置浸泡24 h，获得CMSBC材料浸提液。

取对数生长期的L929细胞制备成为细胞浓度为5.0×10⁷ L^-1的细胞悬液，以每孔0.1 mL接种于96孔板(即每孔5 000个细胞)，37 ℃、体积分数为5% CO₂保温培养箱培养24 h。待细胞贴壁后弃去原培养液，实验组用CMSBC浸提液置换，阴性对照组用100%新鲜培养液置换，阳性对照组用体积分数为0.64%苯酚置换。按1，3，7 d设置3块平行板，37 ℃、体积分数为5%CO₂保温培养箱培养，每组重复6孔。终止培养前倒置相差显微镜观察细胞形态，换液后每孔加入10 μL CCK-8溶液，继续培养2 h，酶标仪读取波长450 nm处吸光度值。以阴性对照的吸光度均值为100%细胞增殖率，计算各组细胞相对增殖率。相对增殖率(%)=各组吸光度值/阴性对照组吸光度值×100%。根据细胞增殖率评价材料的细胞毒性，细胞毒性评级标准见表1。

1.4.2 溶血实验抽取检疫合格的新西兰兔血20 mL，加入1 mL 2%草酸钾生理盐水溶液，制备新鲜抗凝兔全血。生理盐水稀释新鲜抗凝兔全血，直至0.2 mL稀释抗凝兔血溶于10 mL蒸馏水后545 nm波长的吸光度值在0.8±0.3范围内，随后将稀释抗凝兔血4 ℃贮存。

根据ISO10993标准规定，制备形状规则的CMSBC试样，消毒后按照浸提介质生理盐水与试样表面积比例为 6 cm²/mL在37 ℃摇床恒温箱内浸提72 h。设立CMSBC实验组、阴性对照组、阳性对照组，每组各制备3个平行样。CMSBC实验组中加入10 mL CMSBC材料浸提液，阴性对照组和阳性对照组分别加入10 mL生理盐水和蒸馏水。所有试管均放置于37 ℃水浴30 min，分别加入稀释抗凝兔血0.1 mL，混匀后37 ℃水浴60 min，750×g离心5 min，吸取上清液，545 nm测定吸光度值，并计算溶血率。

溶血率=(A_样品-A_阴性) / (A_阳性-A_阴性)×100%。

1.4.3 急性全身毒性实验清洁级昆明小鼠20只，随机分为实验组和对照组，每组雌雄各5只，实验期间给予实验室标准饮食。按50 mL/kg的剂量标准，无菌条件下经小鼠尾静脉缓慢注入相应的液体，实验组为CMSBC材料浸提液(浸提液方法制备同溶血实验)，对照组为生理盐水。注射后即刻，24，48，72 h观察小鼠的一般情况，称量并记录体质量变化。观察指标及毒性分级见表2。

1.4.4 Ames实验实验菌株组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102，在实验前进行下列鉴定：①组氨酸需求(his^-)实验；②脂多糖屏障缺陷鉴定(rfa突变)；③对紫外线损伤修复缺陷鉴定(uvrB修复缺陷型的鉴定)；④抗氨苄青霉素(PKM101)实验(菌株R因子丢失鉴定)；⑤四环素(PAQI)抗性的鉴定；⑥自发回复突变(his⁺)实验；⑦对阳性突变剂的敏感性鉴定。各实验菌株经遗传性状鉴定符合生物学要求后，37 ℃振荡培养，使增菌液浓度达到(1-3)×10¹² L^-1。

活化系统：S-9及S-9mix均按Ames原法要求制作、使用和保存。

S-9：用多氯联苯1254(Aroclor 1254)诱导成年雄性SD大鼠(将多氯联苯溶于玉米油中，质量浓度为200 g/L，腹腔一次性注射500 mg/kg)，5 d后处死，处死前禁食1 d，饮水不限。无菌条件下取大鼠肝脏，无菌冰浴条件下采用匀浆机制作大鼠肝匀浆，4 ℃ 9 000×g低温离心15 min，取上清液。经无菌及酶活性检验合格后，-80 ℃超低温保存备用。

S-9mix：在S-9基础上添加辅助因子NADP及相关盐溶液，用时即配。

测试样品浸提液制备：CMSBC试样消毒灭菌后，以生理盐水作为浸提介质，参照GB/T16886.12所规定的浸提液制备方法，制备浸提液。浸提温度(37±1)℃，浸提时间72 h，浸提比例为6 cm²/mL(材料表面积/浸提介质)。

阴性对照：生理盐水。

阳性对照：非活化(-S9)系统阳性药物敌克松终质量浓度50 μg/皿，叠氮钠终质量浓度2 μg/皿；活化(+S9)系统阳性药物环磷酰胺的终质量浓度200 μg/皿，2-氨基芴终质量浓度20 μg/皿，1，8-二羟基蒽醌终质量浓度50 μg/皿。

非活化试验中，向保温的2.0 mL顶层培养基中加入样品浸提液或阴性/阳性对照品0.1 mL，增菌液0.1 mL及 0.5 mL磷酸盐缓冲液混匀，迅速倾入底层培养基上，使其均匀分布。

活化试验中，于顶层培养基中分别加入样品浸提液或阴性/阳性对照品0.1 mL，增菌液0.1 mL和0.5 mL S-9 mix混匀，迅速倾入底层培养基上，使其均匀分布。每组均设6个平行皿，待顶层凝固翻转平板，置37 ℃培养72 h，计数各皿回复突变菌落数。

1.5 主要观察指标 ①细胞相对增殖率及细胞毒性分级；②溶血率；③急性全身毒性实验动物体质量；④Ames实验回复突变菌落数。

1.6 统计学分析采用SPSS 11.0软件对小鼠体质量进行方差分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

磷酸钙骨水泥是一种新型的自固化的非陶瓷羟基磷灰石材料，当固相粉末与液相溶液按照一定比例调和后可在人体生理环境下自行固化。磷酸钙骨水泥固化产物的化学成分通常为羟基磷灰石或缺钙羟基磷灰石，与人体硬组织的无机成分类似^[15]，具有良好的生物相容性和骨传导性，已作为骨修复材料应用于临床^[16]。但由于磷酸钙骨水泥存在固化时间过长、早期压缩强度低等局限性^[17]，较难单独用作齿科充填修复材料。

磷酸镁水泥是一种无机反应型胶黏剂，在人体生理环境下能自行固化形成磷酸镁类生物矿石，具有固化速度快、早期强度高、胶黏性好的特点^[18]。磷酸镁水泥在动物实验中用作骨粘合剂粘接骨折已取得良好效果^[19]，但目前尚未在口腔领域得到研究应用。

硅酸钙具有很高的生物活性，在模拟体液中其表面类骨磷灰石的形成速度比其他生物玻璃和玻璃陶瓷更快^[20]。将Ti-6Al-4V合金表面喷涂有硅酸钙的材料植入犬皮质骨和肌肉组织内，1个月后发现皮质骨内硅酸钙涂层表面形成羟基磷灰石并与骨组织形成牢固键合，在肌肉组织内硅酸钙表面也诱导出类骨磷灰石沉积，表明硅酸钙具有优良的生物活性和生物相容性^[21]。硅酸钙的细胞相容性好，无明显细胞毒性，其溶出产物钙、硅离子对牙髓干细胞的增殖有促进作用^[22]。

铋剂具有收敛、止泻、防腐作用，可以吸附毒素，对细菌、病毒乃至锥虫及螺旋体等有很好的抑制与杀灭活作用^[23]。目前对铋剂杀菌作用的研究较多集中于幽门螺旋杆菌方面。电子显微镜的形态学观察表明，铋能形成电子密集体沉积于细菌表面和细胞质内，使细菌胞体肿胀形成空泡，最终因多糖包被细胞壁破裂、细胞内容物凝集而导致细菌死亡^[24]。铋离子不仅能通过与细菌酶系统中的巯基结合产生抑菌作用，还能抑制细菌产生蛋白酶、脂酶、糖甙酶，减弱细菌毒性物质的致损伤作用^[25]。

因此，作者希望能利用磷酸钙骨水泥、磷酸镁水泥、硅酸钙、碳酸铋等材料各自的优势，研制一种具有良好理化机械性能和生物性能的复合齿科材料修复髓室底穿孔。作为一种与牙体组织、骨组织直接接触的生物材料，首先必须具有良好的生物相容性，对人体无毒、无刺激，对人体组织、血液等系统没有不良反应。目前，评价生物材料生物相容性及安全性的手段通常包括体外和体内两种实验途径。体外实验是将材料或其浸提液在体外环境下与细胞或组织接触，观察材料对细胞数量、形态及分化的影响。体内实验则是将材料直接与动物体接触，观察植入体周围组织反应的情况，这类实验模拟了人体的生理环境，与材料的最终应用状况接近。实验依据ISO10993和GB/T16886相关的生物学评价标准，选择了细胞毒性实验、溶血性实验、急性全身毒性实验和Ames实验4种较为常见的生物学实验方法对新型复合材料CMSBC的生物相容性及安全性进行初步评价。

细胞毒性实验是用来评价齿科材料造成细胞损伤的潜在可能性，并预测最终应用于生物体时的组织细胞反应。通过体外细胞培养技术，可检测材料接触细胞后细胞发生生长抑制、功能改变、溶解、死亡或其他毒性反应。实验选择的CCK-8比色法是细胞毒性实验中应用较广泛的一种，其中所含的WST-8(2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3- (4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H)在电子载体(1-Methoxy PMS)的作用下能被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲臢物(Formazan dye)，且所生成的甲臢物的数量与活细胞的数量成正比，因此可直接通过酶标仪测量细胞液的吸光度值，检测出待测细胞样品的存活细胞数量的多少及细胞代谢活性的强弱。与MTT法不同，使用CCK-8检测细胞毒性时既不需要使用裂解液溶解沉淀，也不需要吸取上清。该方法有助于减少因为不同裂解液溶解能力的差异，背景信号对吸光度值所产生的系统误差，以及吸取上清液过程中可能带走部分细胞所导致的偶然误差。因此，与传统的MTT比色法相比，CCK-8法具有操作更简便省时，重复性好，灵敏度更高等优点^[26-28]。实验采用CCK-8法将CMSBC浸提液与L929细胞共培养，通过一系列连续时间点监测能反映时间变化对细胞相对增殖率的影响。实验结果显示CMSBC材料不影响L929细胞的正常增殖，对细胞的生长无明显毒性，且随着培养时间的延长，测试材料的相对增殖率逐渐增大。CMSBC材料的细胞毒性分级为0级。

血液相容性是生物材料与血液接触时对血液破坏作用的量度^[29]，其中溶血实验用于评价与骨组织或软组织接触的材料在体外条件下的急性溶血活性^[30-31]。溶血实验能够敏感反映生物材料对红细胞的影响，急性溶血实验通过测定材料与血细胞在体外接触过程中所致红细胞溶解和血红蛋白游离程度，评价材料的体外溶血性。生物材料表面的粗糙结构所导致的机械损伤，材料内部残留分子物质的化学损伤等都可能导致溶血现象^[32-33]。通常具有毒性物质的材料所造成的溶血反应程度要较该材料在细胞培养时所表现的细胞毒性程度更明显^[34]，因此，在溶血实验中测得溶血率大于5%时提示该材料有毒性。实验按照标准建议的方法对CMSBC材料的溶血活性进行测试，溶血率仅为1.17%，远远低于5%的安全标准，故可认为CMSBC材料溶血活性阴性。

急性全身毒性实验是常用的生物学性能检测方法^[35]。它是指一次或多次大剂量给药后观察动物一般活动情况和体质量变化等指标，评价受试材料有无急性毒性作用。常用的给药方式有静脉给药、腹腔注射、经口灌胃等^[36-37]，虽然有学者认为在标准浓度下这几种途径给药的结果无统计学差异^[38]，但静脉给药具有快速起效的优点^[39-40]。因此，参照GB/T 16886.11、ISO10993-11标准，选用小鼠作为实验对象，静脉注入50 mL/kg材料浸提液，结果显示，给药前2组小鼠体质量差异无显著性意义(P > 0.05)，说明给药前的小鼠符合标准；给药24，48，72 h后实验组与对照组体质量差异也无显著性意义(P > 0.05)，72 h内CMSBC实验组与对照组动物均无中毒症状出现，且体质量无明显下降，说明CMSBC浸提液没有引起全身毒性反应，该材料无急性毒性作用。

Ames实验是目前世界范围内应用最广泛的短期内检测化合物致突变方法之一，是由美国学者B.N. Ames于1975年建立并不断发展完善的。Ames实验是利用鼠伤寒沙门氏菌(Salmonlla typhimurium)组氨酸营养缺陷型突变(his-)菌株在缺乏组氨酸的培养基中，只有极少数自发回复突变的细菌才能生长，其余细菌仅能分裂几次，故所生成的微菌落仅在显微镜下才可见。当受到诱变剂作用后，大量his-菌株回复突变为可自行合成组氨酸的his+菌株，发育成肉眼可见的菌落^[41]。由于某些化学物质需要经过代谢活化才具有致突变作用，人体内存在这种具有间接诱变作用的肝细胞微粒体酶系(S-9)，而体外细菌内没有这种具有代谢活化作用的羟化酶系统。为了使体外实验条件更接近体内环境，在测试系统中加入S-9以增加检测的灵敏度，使实验结果更具科学性^[42]。实验选用平板掺入法进行Ames实验，将CMSBC材料与TA97、TA98、TA100 和TA102 标准菌株混合培养，依据出现的回变菌落数来判断CMSBC材料中是否存在诱变成分。根据标准，当测试样本的回复突变菌落数大于或等于阴性对照组2倍，且能显示剂量-反应关系时就可认为受试样本具有致突变作用或致癌作用^[43-44]。实验结果显示，全部实验组都产生回复突变菌落，由此说明所有测试菌种都有自发突变的菌落数。CMSBC材料无论是活化、非活化系统，TA97，TA98，TA100及TA102各菌株细菌回复突变数均小于阴性对照组细菌回复突变数的2倍；而阳性对照组引起测试菌株的回复突变菌落数明显增加，并远超过阴性对照组的2倍以上。根据Ames实验评价标准，各菌株组无论代谢活化与否，皆为阴性结果。因此，CMBSC材料未见潜在致突变性。

结论：初步研究证实CMSBC材料具有良好的生物相容性、生物安全性，但作为与人体组织直接接触的牙科修复材料，该材料是否有生殖毒性、是否干扰免疫系统、具体的降解过程以及长期对机体的影响等，这些都需要进一步深入研究探讨。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程