富血小板纤维蛋白复合牙齿煅烧颗粒修复骨缺损

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.0007

中国组织工程研究 ›› 2018, Vol. 22 ›› Issue (2): 204-209.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.0007

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富血小板纤维蛋白复合牙齿煅烧颗粒修复骨缺损

王得利¹，徐文秀²，林娜²，王海艳²，石屹²，于学刚²，栗巧玲²，周洋²，栾海蓉¹

¹黑龙江省牡丹江医学院，黑龙江省牡丹江市 157011； ²黑龙江省牡丹江红旗医院口腔科，黑龙江省牡丹江市 157011

收稿日期:2017-08-29 出版日期:2018-01-18 发布日期:2018-01-18
通讯作者: 栾海蓉，副教授，牡丹江医学院，黑龙江省牡丹江市 157011
作者简介:王得利，男，1979年生，黑龙江省牡丹江市人，汉族，硕士，副教授，主要从事口腔基础医学研究工作。
基金资助:
牡丹江市科学技术计划项目(Z2016s0077)：PRF结合牙齿煅烧颗粒用于兔骨缺损的实验研究；牡丹江市科学计划项目(G2007d2368)；2017年度黑龙江省属高校基本科研业务费项目

Platelet-rich fibrin combined with tooth ash promotes bone repair

Wang De-li¹, Xu Wen-xiu², Lin Na², Wang Hai-yan², Shi Yi², Yu Xue-gang², Li Qiao-ling², Zhou Yang²,Luan Hai-rong¹

¹Mudanjiang Medical University, Mudanjiang 157011, Heilongjiang Province, China; ²Department of Stomatology, Hongqi Hospital of Mudanjiang, Mudanjiang 157011, Heilongjiang Province, China

Received:2017-08-29 Online:2018-01-18 Published:2018-01-18
Contact: Luan Hai-rong, Associate professor, Mudanjiang Medical University, Mudanjiang 157011, Heilongjiang Province, China
About author:Wang De-li, Master, Associate professor, Mudanjiang Medical University, Mudanjiang 157011, Heilongjiang Province, China
Supported by:
the Scientific and Technological Plan Project of Mudanjiang City, No. Z2016s0077; the Scientific Plan of Mudanjiang City, No. G2007d2368; the Fundamental Rearch Foundation for Heilongjiang Provincial Universities in 2017

摘要/Abstract

摘要：

文章快速阅读：

文题释义：

富血小板纤维蛋白：是一种富含细胞因子和生长因子的自体来源的新型生物材料，被誉为新一代血小板浓缩物，其分子结构类似天然血凝块，为组织细胞提供迁移、增殖和分化的场所。近来，许多学者将富血小板纤维蛋白作为移植材料应用于口腔种植前上颌窦底提升术后的骨移植中，获得了良好效果。

牙齿煅烧颗粒的特性：作为天然矿化物，其成分中富含矿化产物，其中无机成分羟基磷灰石(Hydroxyapatite, HA)在经过高温处理后可获得粉末状的颗粒，该颗粒因其优良的组织相容性，可作为骨性支架为骨组织的生长提供空间支持，但经过高温处理后的羟基磷灰石不具有生物活性，仅具有骨传导性，并且粉末状的羟基磷灰石颗粒流动性强、易变形、缺乏黏附性，材料不易被固定在正确位置。

背景：牙齿煅烧颗粒可作为骨性支架为骨组织的生长提供空间支持，而且在骨再生过程中够提供钙和磷等成分；富血小板血浆具有促进软、硬组织再生的作用，两者单独应用均有不足。

目的：探讨富血小板纤维蛋白复合牙齿煅烧颗粒修复颅骨缺损的效果。

方法：取新西兰大白兔9只，在大耳白兔颅骨中缝两侧各制备标准一致的骨缺损，选择左侧植入兔自体富血小板纤维蛋白膜与人牙齿煅烧颗粒混合物，作为实验组；右侧植入兔自体富血小板纤维蛋白膜，作为对照组。植入后4，6，8周分别取颅骨标本，进行软X射线摄片、苏木精-伊红及改良Gomori染色观察。

结果与结论：①软X射线检查：实验组植入后6，8周的骨小梁面积大于对照组(P < 0.05或P < 0.01)；②苏木精-伊红染色：随着植入时间的延长，两组骨缺损处新形成骨结构纤维成分逐渐减少，骨结构趋向于有序的层状排列，钙化程度增高，但与对照组比较，实验组新骨成熟度更高，骨小梁排列更规则，成骨细胞也更多；③改良Gomori染色：随着植入时间的延长，两组骨缺损处新生骨逐渐成熟，实验组骨成熟度高于对照组；④结果表明：富血小板纤维蛋白结合牙齿煅烧颗粒具有更明显的促进骨缺损修复作用。

ORCID: 0000-0002-9685-8129(栾海蓉)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 生物材料, 口腔材料, 富血小板纤维蛋白, 牙齿煅烧颗粒, 骨再生, 骨缺损

Abstract:

BACKGROUND: The tooth ash can be used as a scaffold for bone tissue growth and provide calcium and phosphorus components during bone regeneration. Platelet-rich plasma can promote the soft and hard tissue regeneration. However, either of them has its shortcomings.

OBJECTIVE: To investigate the effect of platelet-rich plasma combined with tooth ash in repairing skull bone defects.

METHODS: Nine healthy rabbits were selected to make bone defects on both sides of the skull. Rabbit platelet-rich plasma combined with tooth ash was implanted into the skull defect on the left side as experimental group, while rabbit platelet-rich plasma was implanted into the skull defect on the right side as control group. Skull samples were taken out at 4, 6, 8 weeks after implantation for soft X-ray detection, hematoxylin-eosin staining and modified Gomori staining.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Soft X-ray: The trabecular bone area of the experimental group was larger than that of the control group at 6 and 8 weeks after implantation (P < 0.05 or P < 0.01). (2) Hematoxylin-eosin staining: With the duration of implantation, newly formed fibers with bone structure gradually reduced at the defect sites in both groups, and there was a orderly layered arrangement in the bone structure and increased calcification. Compared with the control group, relatively higher new bone maturity, better bone trabecular arrangement and more osteoblasts were observed in the experimental group. (3) Modified Gomori staining: With the prolongation of implantation time, the new bone became mature gradually in the two groups, and the bone maturity in the experimental group was higher than that in the control group. To conclude, platelet-rich fibrin combined with tooth ash is better to promote bone defect repair.

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

Key words: Dental Implantation, Bone Degeneration, Tissue Engineering

中图分类号:

R318

王得利，徐文秀，林娜，王海艳，石屹，于学刚，栗巧玲，周洋，栾海蓉. 富血小板纤维蛋白复合牙齿煅烧颗粒修复骨缺损[J]. 中国组织工程研究, 2018, 22(2): 204-209.

Wang De-li, Xu Wen-xiu, Lin Na, Wang Hai-yan, Shi Yi, Yu Xue-gang, Li Qiao-ling, Zhou Yang,Luan Hai-rong.

Platelet-rich fibrin combined with tooth ash promotes bone repair

[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2018, 22(2): 204-209.

图/表（结果） 5

2.1 实验动物数量分析 9只新西兰兔造模后全部成活，进入结果分析，中途无脱失。

2.2 影像学检查结果见图2。

植入后4周，实验组(上方箭头)与对照组(下方箭头)缺损区无明显变化，只是边缘有散在不透射影，缺损区中部暗影均明显，实验组略小，实验组骨小梁面积较对照组稍大，但差异无显著性意义(P > 0.05)。植入后6周，实验组颅骨缺损周缘可见较多不透射影，缺损中央暗影明显缩小；对照组暗影略缩小，骨小梁面积较实验组明显减少(P < 0.05)。植入后8周时，实验组骨缺损边缘及中央出现大量不透射影，骨缺损边缘与基骨无明显差别；对照组缺损中部不透射影不明显，骨小梁面积较实验组小(P < 0.05)，见表1，2。

2.3 苏木精-伊红染色结果见图3。

植入后4周：两组缺损处中心部位大部分未长合，实验组缺损处可见牙齿煅烧颗粒分散在缺损区，骨小梁形态不规则，但较对照侧骨小梁粗大、致密(箭头所示)，纤维成分相对较少；对照组骨小梁相对稀疏细小。

植入后6周：与对照组相比，实验侧骨缺损处中心部位牙齿煅烧颗粒被大部分保留在缺损区，围绕在牙齿煅烧颗粒周围有更多的新骨长成；对照组缺隙处有纤维组织长入，新骨形成较少(箭头所示)，未长合。两组缺损区表面新骨均不连续，但实验组骨小梁形态趋于规则，骨小梁更粗大、致密，骨结构出现层次，缺损区边缘及中央均有大量新骨形成；对照组相对无序，新骨形成较少；实验组成骨细胞含量较多，数量明显多于对照组。

植入后8周：实验组骨缺损中央部位基本完全愈合(箭头所示)，对照侧尚未完全长合；实验组有较多的牙齿煅烧颗粒保留，颗粒周围新骨形成较多，矿化程度也较高，成骨细胞较对照组偏多，新骨形成较厚，表面也较对照组光滑，骨小梁排列更规则、粗大，骨质更致密；对照组新骨虽有形成，但较薄不连续，骨小梁细小、稀疏。

随着观察时间的延长，两组骨缺损处新形成骨结构纤维成分逐渐减少，骨结构趋向于有序的层状排列，钙化程度增高，但实验组较对照组新骨成熟度相对较高，骨小梁排列更规则，成骨细胞也较多。如果延长实验动物观察时间，实验组与对照组的骨缺损修复程度相差会越来越小，直至最终完全愈合。

2.4 改良Gomori染色结果见图4。

植入后4周，两组新生骨成熟程度均较低、形态不规则，实验组较对照组纤维成分相对较少、骨基质偏多，对照组纤维成分较多，类骨质偏多(箭头所示)。植入后6周，两组骨成熟程度均较4周组高，实验组骨形态更趋于规则，并含有丰富的新生血管(箭头所示)，红染区域面积即新骨形成量较4周时显著增多，并且显著多于对照组。植入后8周，骨成熟程度较6周时高，实验组新骨层状结构相对明显(箭头所示)，骨结构较对照组规则，骨成熟程度相对较高。

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引言

材料方法

1.1 设计动物自体对照观察实验。

1.2 时间及地点实验于2016年6月至2017年1月在牡丹江医学院动物实验中心完成。

1.3 材料

实验动物：3月龄新西兰大白兔9只，雌雄不拘，平均体质量2.8 kg，由哈尔滨医科大学动物繁育中心提供，许可证号：SYXK(黑)2016-033，随机编号分为3组，每组3只，在颅骨中缝两侧各制备一个骨缺损，做左右自身对照，左侧为实验侧，右侧为对照侧。实验过程中对动物的处置参照国家科学技术部2006年发布的《关于善待实验动物的指导性意见》^[7]。

实验用主要仪器：OPLYMPUS光学显微镜(牡丹江医学院病理实验室)；钼靶软X射线(意大利Giotto MD)；800型沉淀离心机(上海手术器械厂)。

1.4 实验方法

制备牙齿煅烧颗粒：前期收集临床废弃的人健康牙、无功能牙或阻生齿，将牙齿置于茂福炉内1 200 ℃煅烧 30 min，研磨成大小约0.15 mm的小颗粒，消毒备用。

制备富血小板纤维蛋白与牙齿煅烧颗粒复合物：麻醉9只新西兰大白兔，待全麻后肌注0.08 mL/kg硫酸庆大霉素预防术后感染。显露右侧兔颈部皮肤，切开皮肤并分离皮下组织，显露兔右侧颈静脉(图1A)，注射器采血5 mL并立即将血液转入无菌采血管，经3 000 r/min离心20 min，可见无菌采血管中央有一层淡黄色的纤维蛋白凝胶——富血小板纤维蛋白，取出中间层淡黄色的纤维蛋白凝胶，用纱布压成富血小板纤维蛋白膜(图1B)，并与牙齿煅烧颗粒 1∶1混合，备用。

动物造模：切开9只兔颅顶部显露颅骨，使用骨钻于颅顶骨两侧分别制备7 mm×4 mm×2 mm大小骨缺损2个(图1C)，左侧植入自体富血小板纤维蛋白与牙齿煅烧颗粒复合物(实验组)，右侧植入自体富血小板纤维蛋白膜(对照组)，术后严密缝合，避免移植材料变形。定期观察动物创口愈合情况。

1.5 主要观察指标

影像及组织学观察：材料植入后4，6，8周，分别选取3只动物处死，切取颅骨标本，置于体积分数10%中性甲醛固定液中固定，利用软X射线、苏木精-伊红染色、改良Gomori染色进行观察。软X射线投照条件：23 kV，6 mA，15 s，与X射线球管距离35 cm。

图像分析：使用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件进行软X射线图像分析，观察每个时间段骨缺损区新生骨的情况^[4，8]。

1.6 统计学分析使用SPSS 13.0软件进行配对t 检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

讨论

随着义齿修复技术的不断进步，人民生活水平的不断提高，患者对于义齿修复的要求越来越高，普通义齿修复难以满足现实需要，种植义齿修复无论是舒适性还是美观性都是理想选择，但在种植修复中往往存在牙槽嵴骨量不足的问题。随着近年来生物工程的迅速发展，种植修复骨量不足的问题得到了有效解决，此次实验为牙齿煅烧颗粒复合富血小板纤维蛋白为移植材料，促进骨缺损处骨组织再生，探讨牙齿煅烧颗粒复合富血小板纤维蛋白作为移植材料的可行性。

区别于传统富血小板血浆制作技术的富含血小板生物材料的富血小板纤维蛋白为自体全血离心的产物，可作为自体移植物^[9]。自体血经离心机离心的过程中，促发自体血凝血，自体血中的纤维蛋白原缓慢聚合成为富血小板纤维蛋白。富血小板纤维蛋白制备过程简单，无需添加抗凝剂，消除了富血小板血浆中使用抗凝血制剂所带来的潜在危险，富血小板纤维蛋白制作过程中无需对血液进行任何生物化学上的处理，富血小板纤维蛋白在制取过程中富含血小板内的细胞活性物质和糖原合并链入纤维蛋白网，使富血小板纤维蛋白形成过程中渐进性的释放细胞活性物质，这一结构特点使富血小板纤维蛋白具有了愈合特征^[10]。

富血小板纤维蛋白制备过程中血液中的纤维蛋白原缓慢聚合而成的纤维蛋白为三分子网状结构，三分子网状结构不但可以滞纳循环血中的血小板及各种细胞因子，而且可以使富血小板纤维蛋白中各种细胞因子与循环血中的葡

萄糖胺聚糖发生化学联系，使得在富血小板纤维蛋白的降解过程中这些细胞因子能逐步缓慢释放，并通过纤维蛋白的支架作用与细胞因子的调节作用促进软、硬组织修复。细胞因子促进了组织修复过程，富血小板纤维蛋白三分子网状结构有效募集了与组织修复相关的细胞，为组织修复相关的细胞提供了增殖分化的场所，富血小板纤维蛋白三分子网状结构能为骨组织修复提供细胞支架作用^[11]。此外，富血小板纤维蛋白三分子网状结构中滞纳了大量免疫细胞，在降解过程中持续释放免疫调节相关的细胞因子，增强了抗感染能力^[12-13]。

富血小板纤维蛋白中的生长因子对细胞的生长、增殖、分化都有着很重要的作用^[14-16]，它对伤口的愈合，骨组织再生起到了很好的促进作用。富血小板纤维蛋白能释放许多种细胞因子，包括：①表皮细胞生长因子，参与骨折的愈合过程，还可以促进多种类型细胞的增殖和生长；②胰岛素样生长因子，它可以促进软骨基质、骨基质和胶原的合成；③转化生长因子β，它能介导部分炎症反应，促进骨与软骨的修复；④血小板衍生生长因子，它在创伤骨组织中高效表达，增加胶原蛋白的合成能力，主要促进细胞的分化，使成骨细胞趋化、增殖。由此可见，富血小板纤维蛋白对于多种细胞都有促进增殖和分化的作用，是一种很有前景的生长促进因子。富血小板纤维蛋白还有许多优势：①富血小板纤维蛋白克服了免疫排斥的问题，完全是从自体的全血中提取^[17]；②富血小板纤维蛋白的制取过程对患者的损伤最小；③富血小板纤维蛋白制作简单，不存在一系列的伦理学问题，省时省力，而且价格便宜、成本低。

目前，骨缺损的修复研究从最初的各种骨替代材料及各种复合材料移植，到目前的基因工程治疗、骨组织工程、生物活性材料，由于各种材料自身性能的不同和缺损区骨组织局部反应的复杂性，时常引起免疫排斥反应，最终导致骨缺损修复失败。因此能够寻找到一种理想骨移植材料是所有研究者的迫切需求，这种骨移植材料要有良好的生物活性和生物相容性，还要与人体组织结构相类似，使其能够与自体骨组织之间形成骨结合^[18]。

在此次实验中，将富血小板纤维蛋白膜与人牙齿煅烧颗粒复合，通过软X射线摄片、苏木精-伊红染色及改良Gomori染色观察，发现植入后4，6，8周时，实验组骨缺损区比对照组有较成熟骨小梁影像，骨密度较高，提示实验组骨缺损区骨形成较对照组活跃，这可能与富血小板纤维蛋白中的细胞因子加快骨缺损的修复速度有关。实验组骨密度高，这可能也与富血小板纤维蛋白中含有的大量纤维蛋白原有关，纤维蛋白原增加了移植物之间的黏附性，使更多的牙齿煅烧颗粒被保留固定在骨缺损区域，增加了骨移植材料早期愈合的稳定性。

苏木精-伊红染色及改良Gomori染色组织学观察显示，在植入4，6，8周，实验组较对照组骨小梁粗大、致密，纤维成分相对较少，骨基质偏多；对照组纤维成分较多，类骨质偏多，这可能与富血小板纤维蛋白中含有的高浓度生长因子有关，这些生长因子在植入缺损部位刺激骨髓基质细胞的有丝分裂，促进成骨细胞的趋化、增殖，加速了新骨生成。

在动物实验中颗粒状的牙齿煅烧颗粒与富血小板纤维蛋白混合后表现出了良好的成骨效果和组织相容性，无免疫原性，而且随着时间的延长，移植物与自体骨之间逐渐形成了良好的骨结合，且随着时间的变化，颗粒状牙齿煅烧颗粒可逐渐吸收而被新骨所替代。牙齿煅烧颗粒由于来源广泛、制作简单，所以在临床应用中价格便宜，更容易被患者所接受。但同时缺点也很显著，牙齿煅烧颗粒呈粉末状单独植入时难以附着成型，在植入后也容易移位变形。而且牙齿经过煅烧后不具有骨诱导性，间充质干细胞无法被直接诱导分化为骨原细胞或成骨细胞，因此临床上需要具有生物活性的试剂与其联用才能获得更好的成骨效果。

法国科学家Choukroun于2000年提取制备了富血小板纤维蛋白并应用于临床，富血小板纤维蛋白可为骨缺损修复提供大量的细胞因子，加快骨缺损的修复再生速度，同时可降低周围组织的炎性反应^[19-20]。Lee^[21]、Marrelli等^[22]通过研究发现，即使富血小板纤维蛋白单独应用也可促进新骨再生，使缺损区获得良好恢复。也有研究者通过动物实验验证同种异体骨或人工骨粉复合富血小板纤维蛋白与单独应用富血小板纤维蛋白或其他人工生物膜进行比较^[23-29]，实验发现富血小板纤维蛋白复合人工骨粉或同种异体骨修复效果要更显著。在此次实验中对照组单独填充富血小板纤维蛋白膜后虽然修复效果较理想，但实验组新生骨骨小梁排列更规则紧密，新生骨量更多，并且矿化程度更高，在骨缺损边缘与中央都有大量新骨形成。同种异体骨或人工骨粉复合富血小板纤维蛋白与牙齿煅烧颗粒复合富血小板纤维蛋白相比，哪一种修复效果更理想，有待进一步研究。此次实验中植入后4，6，8周，实验组较对照组显示出良好的成骨效应，显示富血小板纤维蛋白膜与人牙齿煅烧颗粒复合较富血小板纤维蛋白膜单独应用可更好地促进兔颅骨骨缺损区新骨的形成，是一种良好生物移植材料，其中富血小板纤维蛋白具有骨诱导和骨传导双重作用，是发挥促进作用的重要因素，但其在骨形成过程中的作用持续时间、具体作用机制，以及浓度与效应的关系仍有待进一步研究。另外富血小板纤维蛋白中的大量纤维蛋白原在骨缺损修复中起到了网织作用^[30]，使牙齿煅烧颗粒被固定在骨缺损区，防止牙齿煅烧颗粒丧失，增加了移植物彼此之间的黏附性和稳定性。

此次实验的不足之处在于由于实验条件限制，实验动物数量有限，实验结果检测指标相对较少，时间节点只依据临床缺牙后修复的最少时间2个月设定，缺少3，6，8个月的相应对照。

在临床上，种植义齿修复缺失牙经常遇到的突出问题是种植体周围骨量不足，而牙齿煅烧颗粒取自无功能牙或阻生齿，来源丰富、制备简单，具有良好的生物相容性，缺点是成骨效果有限，无骨诱导作用。富血小板纤维蛋白是新一代血小板浓缩制品，完全取自于自体血、避免了排斥反应或交叉感染的风险，富含的生长因子可增强早期成骨效果，在口腔种植领域可操作性强，具有广阔的应用前景。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

富血小板纤维蛋白复合牙齿煅烧颗粒修复骨缺损

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