体外培养人体脂肪基质细胞和骨髓基质细胞的成骨活性对比

doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.23.006

摘要/Abstract

摘要：

背景：目前组织工程骨构建研究中的种子细胞主要来源于骨、骨膜、骨髓及骨外组织，近年来的研究多集中于骨髓基质细胞。而脂肪中基质细胞的发现，有望取代骨髓基质细胞。
目的：观察体外培养脂肪基质细胞与骨髓基质细胞的生物学特性，并比较二者成骨诱导后的碱性磷酸酶活性，从成骨活性方面来评价脂肪基质细胞能否取代骨髓基质细胞。
方法：手术中收集同一人体的脂肪组织与骨髓组织。脂肪组织经机械切割后以Ⅰ型胶原酶消化获得脂肪基质细胞，骨髓组织以淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离骨髓基质细胞；体外培养、传代后以诱导培养液行成骨诱导培养。诱导后第2，3周各检测1次细胞中的碱性磷酸酶活性，并行Von Kossa钙结节染色鉴定成骨细胞。
结果与结论：共获得15例患者的脂肪与骨髓组织，其中10例完成实验。与骨髓基质细胞相比，脂肪基质细胞更易培养成活，扩增速度快；二者细胞形态相似，诱导培养后细胞外基质中均有黑色的钙结节形成；碱性磷酸酶活性二者差异无显著性意义(P > 0.05)。结果提示脂肪组织来源丰富，脂肪基质细胞成活容易，具有与骨髓基质细胞相似的生物学性能，且易培养、增殖快，二者的成骨活性相似，脂肪基质细胞比骨髓基质细胞更具有优势。

关键词: 脂肪基质细胞, 骨髓基质细胞, 成骨细胞, 碱性磷酸酶, 成骨活性

Abstract:

BACKGROUND: In present research of tissue engineered bone construction, seed cells are mainly harvested from bone, periosteum, bone marrow and non-osseous tissue. Present studies mainly focused on bone marrow stromal cells (BMSCs), but the discovery of adipose-derived stromal cells (ADSCs) can replace bone marrow stromal cells.
OBJECTIVE: To study the biological characteristic of ADSCs and BMSCs cultured in vitro and to compare alkaline phosphatase activities following osteogenesis so as to evaluate whether ADSCs could be a better seed cells to replace BMSCs.
METHODS: Adipose tissue and bone marrow from the same body were collected during operation. Adipose tissues were digested with collagenase type Ⅰ to gain ADSCs, and BMSCs were isolated by centrifugation on lymphocyte separation medium. Following in vitro culture and passage, cells were induced to differentiate into osteoblasts. At the second and third weeks after induction, alkaline phosphatase activity in cells was measured for comparison and Von Kossa calcium nodus staining was used to detect osteoblasts.

RESULTS AND CONCLUSION: Adipose tissue and bone marrow were gained from 15 patients and 10 of them brought off a successful experiment. Compared with BMSCs, ADSCs can be cultured more easily and proliferate faster. Their morphological characteristics were similar. Black calcium noduses were seen in extracellular matrix. No significant difference was determined in alkaline phosphatase activity between ADSCs and BMSCs (P > 0.05). The results proved that adipose tissue is abundant. ADSCs can be cultured more easily, and have similar biological characteristics with BMSCs, and they can be easily cultured, proliferate faster, and can be induced to osteoblasts. ADSCs should be a more ideal seed cells than BMSCs

中图分类号:

R394.2

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参考文献

引言

材料方法

讨论

近年来，在骨缺损治疗方面随着ADSC的发现及其向成骨细胞诱导成功，并对其特性研究的深入，发现ADSC比BMSC更具优势：具有高增殖的特点，采集效率高，又不涉及伦理道德问题，不仅人自体内脂肪细胞库极大，ADSC来源广，而且随肥胖增多、人们生活水平提高，要求去除多余脂肪者越来越多，这些吸脂术抽出的细胞为废弃细胞，具有巨大的临床及社会效益。本实验培养了同一个体的ADSC和BMSC，并检测两者在成骨诱导后分泌的碱性磷酸酶活性，比较二者的成骨活性。 3.1 研究背景 脂肪组织与骨髓均来自胚胎中胚层，并且都含有支持成熟组织的基质成分，在这些基质中存在着具有自我更新和一定的多能分化潜能、处于全能细胞和成熟细胞之间的成体干细胞。ADSC虽然来源于中胚层，但具有跨胚层向神经细胞分化的能力，故许多学者将这种分化形式称为“横向分化”^[6-7]。横向分化的发现打破了干细胞只能来源于胚胎或受精卵的限制，但由于对横向分化的机制尚不清楚，大多数学者将其归因于培养过程中暴露在不同微环境下所致^[8]。然而，最近有些学者认为“横向分化”的说法并不科学^[9]，提出是由于在成体组织中仍然残存着胚胎发育过程中包括各胚层定向的、组织定向的各类干细胞所致。有学者发现，在加VitD不加地塞米松成骨培养基中，ADSC有更强的碱性磷酸酶活性，而BMSC有更强的基质矿化能力^[10]。有文献报道对二者的细胞表面分子标志及免疫性进行比较，结果提示二者相似^[11]；李宾公等^[12]经混合淋巴细胞反应及淋巴细胞转化实验研究得出结论，ADSC具有弱免疫原性的特点，提示可以利用ADSC进行同种异体移植。 3.2 细胞生物活性比较 脂肪组织经机械切割后以Ⅰ型胶原酶消化获得ADSC的方法可靠，获得的细胞量充足，而且胶原酶对于细胞损伤性极小，尽可能地保持了分离获得细胞的活性，原代培养的成活率高。 BMSC的分离方法主要有贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪法及免疫磁珠法^[13]。贴壁筛选法所得细胞杂质较多；BMSC缺乏具有特征性的表面抗原，故影响流式细胞仪和免疫磁珠法，且二者对细胞有损伤。Pittenger等^[14]的研究发现密度梯度离心法分离BMSC第1代纯度可达95%，第2代超过98%。本实验中选择密度梯度离心法来分离获得BMSC。本实验中发现ADSC与BMSC在细胞形态学上并无明显差异，但ADSC比BMSC贴壁快，增殖速度也快，ADSC贴壁时间为2~4 d，平均7~10 d长满瓶底，而BMSC贴壁时间为5~8 d，10~25 d长满瓶底，但传代后二者均可于24 h内完全贴壁，增殖速度均加快，传代培养均较原代培养容易得多，且再次传代时间二者相差较小：ADSC为5~7 d，BMSC为7~10 d。从细胞增殖方面来说，ADSC比BMSC有明显的优越性。 3.3 鉴定方法 细胞形态学、Ⅰ型胶原、碱性磷酸酶阳性、钙结节形成及骨钙素的含量是目前鉴定成骨细胞的公认标准。虽然众多研究以碱性磷酸酶、钙结节染色呈阳性及检测出Ⅰ型胶原、骨钙素来鉴定成骨细胞，但这些指标仅能说明具有成骨能力的成骨细胞存在，无法说明成骨细胞的数量，不能反应出细胞诱导效率——有百分之几的基质细胞被诱导成为成骨细胞？组织工技术构建的组织虽然初步具备了正常骨组织结构的基本特性，但是新生组织仅是编织样骨，结构不规则，骨小梁紊乱，新生组织还夹杂有纤维结缔组织。人们对这种骨组织的骨强度了解还甚少。碱性磷酸酶是成熟成骨细胞的标志性酶之一。作为成骨细胞表型特征之一^[15]，在体外钙化中起关键作用，随着碱性磷酸酶升高的同时出现大量钙盐的沉积，碱性磷酸酶活性越高，说明成骨前体细胞向成骨细胞分化越明显，也就是说可以反映成骨活性。因而本实验对两种基质细胞诱导后对碱性磷酸酶做定量检测，以比较二者的成骨活性，也是从其中一个角度比较了二者的成骨诱导效率。为了使碱性磷酸酶检测结果更加准确，实验中采取了以下方法对误差进行控制：①为了消除性别、年龄、身体素质等个体差异，本实验选取了同一个体脂肪组织与骨髓组织，形成配对设计的实验。②本实验对BMSC及ADSC均应用同样的诱导条件，加入10 mmol/L的β-甘油磷酸钠、10^-8 mol/L的地塞米松及50 mg/L的维生素C诱导成骨，分别于诱导后的相同时间测定碱性磷酸酶活性来评价二者的成骨活性。③有研究表明细胞换液和传代过程中可以起到纯化细胞的作用，传代到第二三代的ADSC细胞已经基本没有杂质细胞。本实验在传代后换液和传代过程中可见到少量不贴壁细胞被换掉，故本实验选择第二三代的细胞进行诱导。诱导后的第2，3周分别测定碱性磷酸酶含量。因碱性磷酸酶主要存在于细胞内，将细胞以超声波细胞破碎仪破碎使酶溢出胞外后测定。实验中碱性磷酸酶测定采用AMP法，以配对t 检验做统计学处理比较二者活性，为进一步证实所得细胞的成骨活性，行钙结节染色以加强成骨细胞存在的确认。实验结果所有细胞钙结节染色均为阳性，于诱导后第2，3周碱性磷酸酶配对t 检验结果的P值均大于0.05，差异无显著性意义，说明两种种子细胞的成骨活性相近，ADSC可以取代BMSC。总之，脂肪组织比骨髓组织来源广泛，取材方便，可获得的基质细胞数量大，易于培养与扩增，成骨能力相近，ADSC是一个比BMSC更有优势的骨组织工程种子细胞。当然，尚有许多问题需要解决：ADSC没有特异性表面标志，尚未建立ADSC的鉴定筛选标准；ADSC的弱免疫原性对移植能否构成危害？如何才能去除其免疫原性？移植后有无致瘤性，其安全性如何？所得组织工程骨仅是编织样骨，还混杂有纤维结缔组织，结构不规则，骨小梁紊乱，新生骨的塑形能力、力学强度即骨的功能，也是个未知数。如果这些问题相继得到解决，组织工程骨进入临床应用，将使组织工程迈上一个新的台阶。

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