骨碎补总黄酮联合纳米骨材料促进MC3T3-E1细胞的增殖分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2034

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (7): 1030-1036.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2034

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骨碎补总黄酮联合纳米骨材料促进MC3T3-E1细胞的增殖分化

李晋玉¹，俞兴¹，姜俊杰²，徐林¹，赵学千¹，孙旗¹，郑晨颖¹，白春晓¹，刘楚吟¹，贾育松¹

¹北京中医药大学东直门医院，北京市 100700；²中国中医科学院中医临床基础医学研究所，北京市 100700

收稿日期:2019-07-23 修回日期:2019-07-27 接受日期:2019-09-02 出版日期:2020-03-08 发布日期:2020-01-19
通讯作者: 贾育松，主任医师，北京中医药大学东直门医院，北京市 100700
作者简介:李晋玉，男，1984年生，山西省晋城市人，汉族，2018年北京中医药大学毕业，博士，副主任医师，主要从事中医药在骨组织工程中的应用。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81503601)；国家自然科学基金项目(81603517)；北京中医药大学东直门医院青苗人才项目(DZMYS-201802)

Promoting effect of osteopractic total flavone combined with nano-bone materials on proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells

Li Jinyu¹, Yu Xing¹, Jiang Junjie², Xu Lin¹, Zhao Xueqian¹, Sun Qi¹, Zheng Chenying¹, Bai Chunxiao¹, Liu Chuyin¹, Jia Yusong¹

¹Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China; ²Institute of Basic Research in Clinical Medicine, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China

Received:2019-07-23 Revised:2019-07-27 Accepted:2019-09-02 Online:2020-03-08 Published:2020-01-19
Contact: Jia Yusong, Chief physician, Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China
About author:Li Jinyu, MD, Associate chief physician, Dongzhimen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100700, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81503601 and 81603517; the Young Talent Project of Dongzhimen Hospital of Beijing University of Chinese Medicine, No. DZMYS-201802

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

骨碎补总黄酮：是由水龙骨科植物槲蕨的干燥根茎中提取的有效成分，骨碎补总黄酮能够促进成骨细胞增殖，抑制破骨细胞成熟分化。

Wnt/β-catenin信号通路：是一类高度保守的信号通路，广泛存在于多细胞真核生物中，是皮肤发育过程中出现最早的分子信号，调控毛囊的生长发育和毛囊干细胞的迁移分化。β-catenin作为细胞内信号传导蛋白，是Wnt信号通路激活的一种重要的上皮细胞表面黏附分子，能够进入细胞核内传递Wnt信号，进一步激活靶基因开始转录，启动细胞增殖周期。

背景：前期研究发现，骨碎补总黄酮可促进纳米骨材料表面MC3T3-E1细胞的成骨分化，其作用机制有待进一步研究。

目的：探究骨碎补总黄酮联合纳米骨材料对MC3T3-E1细胞发挥作用的机制。

方法：将MC3T3-E1细胞与纳米骨材料共培养，选取100 mg/L和250 mg/L骨碎补总黄酮进行药物干预，以10 μg/L转化生长因子β刺激为阳性对照组。分组如下：①正常组；②DKK1组：Wnt通路抑制剂DKK1 (0.1 mg/L)阻断Wnt/β-catenin信号通路；③DKK1+转化生长因子β组；④DKK1+100 mg/L骨碎补总黄酮组；⑤DKK1+250 mg/L骨碎补总黄酮组；⑥DKK1+纳米骨+转化生长因子β组；⑦DKK1+纳米骨+100 mg/L骨碎补总黄酮组；⑧DKK1+纳米骨+250 mg/L骨碎补总黄酮组。在干预24，48 h后收获细胞，免疫荧光双染法观察Wnt/β-catenin通路中Wnt与LRP结合情况，Real-time PCR和Western blot检测β-catenin、LRP5、Gsk-3β、Cyclin D1、RUNX2的表达。

结果与结论：①激光共聚焦扫描显微镜下显示DKK1+转化生长因子β组、DKK1+250 mg/L骨碎补总黄酮组、DKK1+纳米骨+转化生长因子β组、DKK1+纳米骨+250 mg/L骨碎补总黄酮组棕黄色染色较明显，表明Wnt与LRP结合较其他组更好；②Real-time PCR和Western blot结果显示，骨碎补总黄酮可促进β-catenin、LRP5、RUNX2的表达，下调GSK-3β的表达，说明骨碎补总黄酮通过激活经典Wnt/β-catenin 信号通路促进成骨细胞增殖分化，且骨碎补总黄酮诱导的基因活化呈剂量依赖性。

ORCID: 0000-0002-2031-8644(李晋玉)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨碎补总黄酮, 纳米骨, Wnt/β-catenin信号通路, 成骨细胞, MC3T3-E1细胞

Abstract:

BACKGROUND: Preliminary study has found that osteopractic total flavone can promote osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells on the surface of nano-bone material, but the underlying mechanism needs to be studied in depth.

OBJECTIVE: To investigate the actin mechanism of osteopractic total flavone combined with nano-bone material on MC3T3-E1 cells.

METHODS: MC3T3-E1 cells were co-cultured with nano-bone material, and 100 mg/L and 250 mg/L osteopractic total flavone were treated as drug intervention, including 10 μg/L transforming growth factor-β as positive control. The samples were divided into eight groups: (1) Normal group; (2) DKK1 group: Wnt pathway inhibitor DKK1 (0.1 mg/L) blocks Wnt/β-catenin signaling pathway; (3) DKK1+transforming growth factor-β group; (4) DKK1+100 mg/L osteopractic total flavone group; (5) DKK1+250 mg/L osteopractic total flavone group; (6) DKK1+ nano-hydroxyapatite/collagen+transforming growth factor-β group; (7) DKK1+nano-hydroxyapatite/collagen+100 mg/L osteopractic total flavone group; (8) DKK1+nano-hydroxyapatite/collagen+250 mg/L osteopractic total flavone group. Cells in each group were harvested after 24 and 48 hours of intervention. Immunofluorescence labeling was used to observe the binding of Wnt and LRP in osteoblasts in the Wnt/β-catenin pathway. The expression of β-catenin, LRP 5, GSK-3β, Cyclin D1, and RUNX2 was detected by real-time polymerase chain reaction and western blot assay.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) Confocal laser scanning microscope showed that obvious brown and yellow staining was shown in the DKK1+transforming growth factor-β group, DKK1+250 mg/L osteopractic total flavone group, DKK1+nano-hydroxyapatite/ collagen+transforming growth factor-β group, and DKK1+nano-hydroxyapatite/collagen+250 mg/L osteopractic total flavone group, indicating that Wnt and LRP combined better than other groups. (2) Real-time polymerase chain reaction and western blot assay results showed that osteopractic total flavone could promote the expression of β-catenin, LRP5 and RUNX2, and downregulated GSK3β expression. These findings confirm that osteopractic total flavone can promote the differentiation and proliferation of osteoblasts by activating the Wnt/β-catenin signaling pathway. Gene activation induced by osteopractic total flavone was dose-dependent.

Key words: osteopractic total flavone, nano bone, Wnt/β-catenin signaling pathway, osteoblasts, MC3T3-E1 cells

中图分类号:

李晋玉, 俞兴, 姜俊杰, 徐林, 赵学千, 孙旗, 郑晨颖, 白春晓, 刘楚吟, 贾育松.

骨碎补总黄酮联合纳米骨材料促进MC3T3-E1细胞的增殖分化 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(7): 1030-1036.

Li Jinyu, Yu Xing, Jiang Junjie, Xu Lin, Zhao Xueqian, Sun Qi, Zheng Chenying, Bai Chunxiao, Liu Chuyin, Jia Yusong. Promoting effect of osteopractic total flavone combined with nano-bone materials on proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells [J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(7): 1030-1036.

图/表（结果） 8

2.1 免疫荧光双染检测MC3T3-E1成骨细胞内Wnt与LRP结合情况在40倍和100倍的激光共聚焦显微镜下观察LRP呈绿色，Wnt1呈红色，DAPI染色的细胞核呈现蓝色，Wnt与LRP相结合呈现棕黄色。干预24 h时，激光共聚焦显微镜下观察(×40)显示，DKK1+转化生长因子β组、DKK1+250 mg/L骨碎补总黄酮组棕黄色染色较其他组明显，DKK1+纳米骨+250 mg/L骨碎补总黄酮组LRP5和Wnt1染色较其他含有纳米骨材料组更为明显，见图1。干预24 h时，激光共聚焦显微镜下观察(×100)显示，DKK1+纳米骨+100 mg/L骨碎补总黄酮组、DKK1+纳米骨+转化生长因子β组较其他组色棕黄色更明显，见图2；干预48 h激光共聚焦显微镜下观察结果与24 h一致，见图3，4。

2.2 骨碎补总黄酮对MC3T3-E1细胞相关基因的影响各组在干预24，48 h分别检测β-catenin、GSK-3β、RUNX2及Cyclin D1 mRNA表达水平的变化。与正常组、DKK1组比较，DKK1+转化生长因子β组、DKK1+100 mg/L骨碎补总黄酮组、DKK1+250 mg/L骨碎补总黄酮组β-catenin、RUNX2及Cyclin D1 mRNA表达较明显增加，GSK-3β mRNA表达明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05或P < 0.01)，见图5，6。

2.3 骨碎补总黄酮对MC3T3-E1细胞相关蛋白表达的影响各组在干预24，48 h分别检测β-catenin、LRP5、GSK-3β、RUNX2及Cyclin D1蛋白表达水平的变化。与正常组、DKK1组比较，DKK1+转化生长因子β组、DKK1+ 100 mg/L骨碎补总黄酮组、DKK1+250 mg/L骨碎补总黄酮组β-catenin、LRP5、RUNX2及Cyclin D1蛋白表达明显增加，GSK-3β蛋白表达明显降低，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图7，8。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点实验于2018年1至6月在北京中医药大学教育部中医内科学重点实验室完成。

1.3 材料小鼠MC3T3-E1成骨细胞株(中国北京协和医院细胞生物中心)；骨碎补总黄酮(北京岐黄医药股份有限公司)；纳米骨材料由清华大学材料科学与工程系提供，是在仿生思路和既有胶原-钙磷盐复合材料的基础上制备的一种新型纳米复合骨材料，以胶原分子为模板，通过生物自组装，钙磷盐沉积到有序排列的胶原纤维上，合成过程保持常温，具有与天然骨相似的分级结构和特性，具有均一的孔隙和孔间连接，单个晶体尺寸4-6 nm，孔径集中在 50-300 µm，孔隙率为70%-80%^[6]。

实验用试剂及仪器：Anti-LRP5 antibody(ab36121)、Anti-Wnt1 antibody(ab15251)、Donkey Anti-Goat IgG H&L(Alexa Fluor®647,ab150131)、Goat Anti-Rabbit IgG H&L(Alexa Fluor®488,ab150077)(美国eBiosecince公司)；GSK-3β(27C10) Rabbit mAb、RUNX2(D1L7F) Rabbit mAb、Cyclin D1(92G2) Rabbit mAb、β-Catenin (D10A8) XP^® Rabbit mAb(美国Cell Signaling Technology公司)；Thorlabs共聚焦显微镜(美国Thorlabs公司)；Wnt通路抑制剂DKK1(57248-M08H)(美国Sino Biological公司)；转化生长因子β(PGH9204)(美国Gibco公司)；α-MEM培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Sciencell公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 骨碎补总黄酮溶液的配制用含体积分数3%胎牛血清的α-MEM培养基，将骨碎补总黄酮配成500 g/L的溶液，4 ℃保存；用含体积分数3%胎牛血清的α-MEM培养基，将骨碎补总黄酮溶液浓度稀释成250，100，0 mg/L，现用现配。

1.4.2 小鼠MC3T3-E1细胞与纳米骨材料共培养将纳米骨材料切成厚度均匀的薄片，铺满培养皿的底部，尽量保持骨材料完整性；MC3T3-E1细胞吹打均匀制成密度为2.0×10⁶的细胞悬液，吸取50 µL接种于纳米骨材料上，30 min后翻转继续接种等量细胞悬液；1 h后移入直径 10 mm的培养皿内，加入含体积分数3%胎牛血清的α-MEM培养液10 mL，置于37 ℃，体积分数5%CO₂培养箱中培养。

1.4.3 实验分组根据前期研究结果选取100 mg/L和 250 mg/L骨碎补总黄酮进行药物干预^[6]，以10 μg/L转化生长因子β刺激为阳性对照组，干预24，48 h后收获细胞。分组如下：①正常组；②DKK1组：Wnt通路抑制剂DKK1 (0.1 mg/L)阻断Wnt/β-catenin信号通路；③DKK1+转化生长因子β组；④DKK1+100 mg/L骨碎补总黄酮组；⑤DKK1+ 250 mg/L骨碎补总黄酮组；⑥DKK1+纳米骨+转化生长因子β组；⑦DKK1+纳米骨+100 mg/L骨碎补总黄酮组；⑧DKK1+纳米骨+250 mg/L骨碎补总黄酮组。

1.4.4 免疫荧光双染观察细胞生长情况将MC3T3-E1细胞接种至纳米骨材料铺满玻底的培养皿中，激光共聚焦显微镜观察并拍照，观察Wnt与LRP在MC3T3-E1细胞内分布与结合情况。将细胞分别以1.5×10⁵/孔、0.75×10⁵/孔接种至激光共聚焦专用培养皿中，加液量为500 μL，放置于37 ℃，体积分数为5%CO₂饱和湿度培养箱中培养；细胞贴壁4 h，同步化12 h后加入各组含药α-MEM培养基培养24，48 h；将Anti-LRP5 antibody，Anti-Wnt1 antibody用5%BSA以1∶200的比例稀释后加入培养皿中，4 ℃过夜；将Donkey Anti-Goat IgG H&L，Goat Anti-Rabbit IgG H&L用5%BSA以1∶200的比例稀释培养，避光孵育30 min；激光共聚焦显微镜观察(激发波长为488 nm和647 nm)，40倍和100倍镜下记录荧光图像。

1.4.5 Real-Time PCR检测MC3T3-E1细胞中β-catenin、GSK-3β、Cyclin D1、RUNX2 mRNA的表达各组干预24，48 h取MC3T3-E1细胞样品，加入Trizol试剂吹打，收集细胞置于离心管内，提取总RNA，用电泳鉴定RNA无降解及DNA污染，通过紫外分光光度计测定浓度及纯度。取反转录试剂盒进行PCR实验，提取出cDNA进行实时定量PCR，反应体系包含250 mg/L的cDNA模板2 μL，SYBR GreenⅠ荧光染料10 μL，上下游引物各0.5 μL，双蒸水7 μL，共20 μL，加入定量PCR仪专用毛细管内，按如下条件进行PCR反应：95 ℃变性4 min，58 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，76 ℃ 2 s，共40个循环，同时做53-95 ℃范围内的熔解曲线。目的基因和内参基因β-actin表达量根据2^-ΔΔCt法获得，记录实验组中各目的基因表达水平的变化。PCR引物由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成，引物序列见表1。

1.4.6 Western blot检测MC3T3-E1细胞中β-catenin、LRP5、GSK-3β、Cyclin D1、RUNX2蛋白表达各组干预24，48 h提取MC3T3-E1细胞总蛋白，BCA法测定蛋白质含量后进行凝胶电泳，每孔上样40 μg，电转至聚偏氟乙烯薄膜上，3%脱脂奶封闭2 h，分别孵育β-catenin、LRP5、GSK-3β、Cyclin D1、RUNX2和GAPDH(内参蛋白)一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜，孵育二抗后显影，采用 Quantityone软件对条带亮度进行分析。

1.5 主要观察指标 ①免疫荧光染色观察MC3T3-E1细胞中Wnt与LRP结合情况；②Real-time PCR检测MC3T3-E1细胞中β-catenin、GSK-3β、Cyclin D1、RUNX2 mRNA表达；③Western blot检测MC3T3-E1细胞中β-catenin、LRP5、GSK-3β、Cyclin D1、RUNX2蛋白表达。

1.6 统计学分析实验数据运用SPSS 20.0软件进行统计和分析，结果用x(_)±s表示，对数据先做正态和方差齐检验，符合者用单因素方差分析比较，组间比较用LSD分析法；若不符合正态分布或方差不齐者，用非参数检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨缺损常因创伤、感染、畸形、骨坏死等多种因素所致，文献报道其发生率可高达5%-10%^[7]，传统的治疗手段往往需要牺牲自体骨进行移植修复，自体骨移植安全性高，有良好的骨诱导性，因而被认为是治疗骨缺损的金标准^[8-9]，是目前临床最常用的治疗骨缺损的材料，但取自体骨时将会增加创伤，且术后供骨区有可能出现感染、失血、血肿、神经损伤、畸形、慢性持续性疼痛等诸多并发症，同时受到供“量”不足影响^[10]。骨组织工程技术是近年来研究的热点，研究各类人工植骨替代材料的关键是克服自体骨或异体骨固有的缺点，这正是临床迫切需要解决的问题。组织工程骨具有可修复大面积骨缺损、无免疫排斥反应、无致病性等一系列优点，是较为理想的骨移植材料^[11]。纳米羟基磷灰石/胶原基骨材料是清华大学材料系应用仿生学原理通过生物自组装常温合成的具有与天然骨相似微结构的人工骨材料，临床骨修复效果确切^[10]。体外实验证实，骨碎补总黄酮能促进大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞增殖、分化^[12-17]。动物实验研究显示，骨碎补总黄酮能增加去卵巢大鼠股骨密度和机械强度，改善骨小梁微结构^[18]。临床研究表明，骨碎补总黄酮可以治疗骨质疏松^[19]、骨缺损^[20]、骨折^[21-23]、股骨头坏死等^[24-26]。因此，实验研究采用骨碎补总黄酮作为促进细胞增殖、分化的研究对象。

目前研究表明，Wnt/β-catenin信号通路能够调控成骨细胞增殖和分化^[27-29]，调节成骨细胞的活性和功能^[30]。通路蛋白主要有Wnt、β-catenin、GSK-3β，下游靶基因有cylinD1、Runx2等。β-catenin在成骨细胞中有广泛的表达，说明Wnt/β-catenin通路的功能活跃。LRP5是低密度脂蛋白受体相关蛋白家族成员，研究表明LRP5基因能影响骨量和骨密度的变化，对成骨细胞的分化有促进作用^[31-32]。RUNX2的表达可以调节成骨细胞的活性和功能^[33]。Cyclin D1是经典Wnt/β-catenin通路的下游基因，又是重要的核内转录因子，对细胞周期调控至关重要。Wnt蛋白与Frizzled receptor以及LRP5辅助受体在细胞膜表面结合后而激活，可通过CK诱导Dvl磷酸化，进而抑制GSK-3β活性，β-catenin在细胞核内积累，进而激活TCF/LEF介导的靶基因转录^[34-35]。因此β-catenin、LRP5和GSK-3β因子跟其他Wnt信号通路相关因子一起调节Wnt/β-catenin信号通路功能状态，共同影响成骨细胞的分化和成熟。李佩芳^[36]发现骨碎补总黄酮诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化早期可以提高β-catenin、LEF-1、cyclin D mRNA的表达，分化晚期抑制其表达，由此可以得出骨碎补总黄酮发挥促进成骨细胞分化的作用主要是在分化早期。史岩等^[12]研究发现，骨碎补总黄酮对骨髓间充质干细胞的成骨分化有一定促进作用，其机制可能与上调Wnt/β-catenin信号通路相关因子表达有关，暂未发现其对骨髓间充质干细胞成脂分化有直接作用。MA等^[37]研究表明，柚皮苷可治疗失用性骨质疏松，促进成骨细胞分化并抑制破骨细胞分化，在活化Wnt/β-catenin信号通路的同时也使Sema3A的表达增加。通过以上研究，可以得出骨碎补总黄酮通过激活Wnt/β-catenin信号通路从而激活成骨细胞的增殖、分化。

激光共聚焦显微镜下观察Wnt与LRP在成骨细胞内分布与结合情况，干预24 h时，激光共聚焦显微镜下观察(×40)显示，DKK1+转化生长因子β组、DKK1+250 mg/L骨碎补总黄酮组棕黄色染色较其他组明显，DKK1+纳米骨+ 250 mg/L骨碎补总黄酮组LRP5和Wnt1染色较其他含有纳米骨材料组更为明显。干预24 h时，激光共聚焦显微镜下观察(×100)显示，DKK1+纳米骨+100 mg/L骨碎补总黄酮组、DKK1+纳米骨+转化生长因子β组较其他组色棕黄色更明显。干预48 h激光共聚焦显微镜下观察结果与24 h一致，由此可知，骨碎补总黄酮可以促进Wnt与LRP在成骨细胞内的表达。

Real-time PCR和Western blot检测骨碎补总黄酮对MC3T3-E1细胞相关因子表达的影响。DKK1+转化生长因子β组、DKK1+100 mg/L骨碎补总黄酮组、DKK1+ 250 mg/L骨碎补总黄酮组的β-catenin、LRP5、RUNX2及Cyclin D1基因及蛋白表达较正常组、模型组明显增加，GSK-3β基因及蛋白表达明显降低；DKK1+转化生长因子β组、DKK1+250 mg/L骨碎补总黄酮组的β-catenin、LRP5、RUNX2及Cyclin D1基因及蛋白表达水平明显高于DKK1+ 100 mg/L骨碎补总黄酮组，表明骨碎补总黄酮可能激活了经典Wnt/β-catenin信号通路，其中250 mg/L骨碎补总黄酮优于100 mg/L，表明骨碎补总黄酮诱导的基因活化呈剂量依赖性。

综上所述，实验发现骨碎补总黄酮可促进β-catenin、LRP5、RUNX2的表达，下调GSK-3β的表达，可以推测骨碎补总黄酮通过激活经典Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞增殖分化，对于骨碎补总黄酮促进骨愈合的具体机制还有待于进一步的深入研究与总结。另外，还发现 250 mg/L骨碎补总黄酮实验结果要优于100 mg/L，表明骨碎补总黄酮诱导的基因活化呈剂量依赖性。

骨碎补总黄酮联合纳米骨材料促进MC3T3-E1细胞的增殖分化

Promoting effect of osteopractic total flavone combined with nano-bone materials on proliferation and differentiation of MC3T3-E1 cells

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