体外联合应用CD80和CD28/CpG ODN共刺激活化人外周血单个核细胞
对胃癌细胞株MKN45有靶向杀伤作用吗？

doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.01.021

摘要/Abstract

摘要：

背景：启动维持并调节活化级联反应，决定了T细胞是活化增殖或转变为无反应状态甚至凋亡。B7分子与CD28的结合能有效协同T细胞受体途径活化T细胞，增强T细胞的增殖活性。

目的：初步分析CD80和CD28/含CpG的寡脱氧核苷酸(CpG containing oligodeoxynucleotides，CpG ODN)共刺激活化的人外周血单个核细胞对胃癌细胞株MKN45的杀伤作用。

方法：Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞，加入白细胞介素2及CD28，CpG ODN共刺激活化培养1~5 d。取MKN45细胞，设立4组：CD28/CpG ODN共刺激组、CD80联合CD28/CpG ODN共刺激组、单纯CD80组、空白对照组。以MTT法检测细胞杀伤率，电镜观察凋亡的MKN45细胞超微结构，流式细胞仪检测MKN45细胞凋亡率。

结果与结论：单纯CD80组对MKN45细胞无明显杀伤作用；与CD28/CpG ODN共刺激组比较，CD80联合CD28/CpG ODN共刺激组对MKN45细胞的杀伤作用显著增强(P < 0.05)，效应细胞与靶细胞之比达15︰1时即可达到半数杀伤率。电镜下效应细胞作用24 h，MKN45细胞就部分发生坏死，部分细胞可见凋亡。与空白对照组比较，单纯CD80组MKN45细胞凋亡率显著升高(P < 0.01)。提示CD80与共刺激活化的外周血单个核细胞合用，可提高活化的外周血单个核细胞对MKN45细胞的靶向性杀伤作用。

关键词: 外周血单核细胞, 共刺激, 胃癌细胞, 凋亡, 靶向杀伤

Abstract:

BACKGROUND: Maintenance and activation of cascade reaction influence T cell proliferation or transformation into nonreactive state even apoptosis. B7 binding to CD28 effectively activates T cells in combination with T cell receptor pathway, and enhances T cell proliferative activity.

OBJECTIVE: To investigate the costimulated activation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) with CD28 and CpG containing oligodeoxynucleotides (CpGODN) MoAb combined with CD80, and its killing effect on human gastric cancerous cell line MKN45 in vitro.

METHODS: PBMCs were isolated by Ficoll density gradient centrifugation method, and cocultured with interleukin-2, CD28 and CpGODN MoAb for 1-5 days. MKN45 cells were divided into 4 culture conditions: CD28/CpGODN, CD80 plus CD28/CpG ODN, CD80 alone, and blank control．The killing efficiency was measured by MTT method．The ultramicrostructure of cells was observed by electron microscope. Apoptosis was verified by a flow cytometery.

RESULTS AND CONCLUSION: CD80 alone did not display killing effect on MKN45 cells. By MTT method, combination of costimulated activation of PBMC with CD28/CpGODN and CD80 showed enhanced killing effect compared with single therapy (P < 0.05), and the ratio of effector cell and target cell at 15: 1 resulted in half killing efficiency. Electron microscope and flow cytometery verified necrotic or apoptotic cells after 24 hours exposure to costimulated activation. Compared with blank control group, CD80 alone elevated the apoptosis rate of MKN45 cells (P < 0.01). Results from the present study show that CD80 can elevate the killing effect of costimulated activation of PBMC with CD28/CpGODN on MKN45 cells in vitro.

中图分类号:

R394.2

方军，李永研，郭树军. 体外联合应用CD80和CD28/CpG ODN共刺激活化人外周血单个核细胞
对胃癌细胞株MKN45有靶向杀伤作用吗？[J]. 中国组织工程研究, 2010, 14(1): 99-102.

Fang Jun, Li Yong-yan, Guo Shu-jun. Killing effect of costimulated activation of peripheral blood mononuclear cells with CD80 and CD28/CpG ODN on gastric cancerous cells MKN45[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2010, 14(1): 99-102.

参考文献

引言

材料方法

讨论

国外已有实验基于体外容易得到人外周血单个核细胞，用CD3，CD28抗体在体外扩增活化T淋巴细胞，利用激活表型为CD8⁺CD25⁺的杀伤细胞回输治疗免疫力下降引起的感染与肿瘤，并将其发生作为肿瘤免疫治疗的新手段^[14]。免疫应答过程中，诱导抗原特异性T细胞应答需要靶细胞上表达B7分子，若其表达缺乏及CD80和CD86功能降低，则干扰T细胞的激活及其效应，使T细胞无能。在T细胞激活中，若无共刺激信号存在，则T细胞呈无反应状态或免疫耐受^[15-17]。刘莉等^[18]报道，大肠癌患者可能通过Tr细胞的免疫抑制作用，使肿瘤细胞逃逸机体免疫监视系统而得以发生、发展。任秀红等^[19]认为，恶性肿瘤患者的细胞免疫功能抑制程度与肿瘤分期相关。肿瘤细胞表面缺乏或低表达B71(CD80)分子，机体的抗肿瘤免疫反应缺乏共刺激分子的辅助作用，因而肿瘤细胞可以逃避机体免疫系统的监视和杀灭，而导致肿瘤细胞产生免疫逃避，这可能是B71(CD80)缺失导致胃癌发生的机制之一^[20-23]。分析经胃癌患者外周血分离培养MoDCs免疫表型发现，CD40，CD80和CD83表达均较对照显著降低，T细胞的共刺激信号通路为调控T细胞活化及其介导的免疫应答提供了有效靶点^[24-25]。B71与CD40L质粒直接瘤内注射可以发挥良好的抗肿瘤作用，有研究认为采用脂质体、电穿孔及基因枪技术可以提高体内转染率并籍此获得更强的抗肿瘤效应^[26-28]。实验进一步证实了CD80通过协同刺激信号使T细胞活化增殖来达到对肿瘤细胞的抑制作用，不同的活化效应细胞与靶细胞浓度比对肿瘤细胞均有一定的杀伤作用。要达到半数致死量，效∶靶细胞比应不小于20∶1。但是CD80与CD28/CpG ODN共刺激活化外周血单个核细胞合用，靶细胞只达到15∶1就能达到半数杀伤率。实验结果显示体外培养6 d时，活化T细胞和CD80(0.4 mg/L)分别可致胃癌细胞株MKN45细胞生长抑制率达91%和52%，二者联合使用杀伤作用更明显，于培养3，6 d时抑瘤率达40%和97%。MTT法检测杀伤率，联合应用活化外周血单个核细胞和CD80(0.4 mg/L)较单用杀伤细胞作用更明显(P < 0.05)。CD80与外周血单个核细胞的浓度之比对外周血单个核细胞的杀伤活性影响很小，这在作者前期实验中已经证实。透射电镜下，体外培养可见MKN45细胞兼有凋亡与坏死征象，这种现象同时也在体外细胞培养的流式细胞仪检测中得到证实。作者在前期实验中已经证实，活化T细胞引起结肠癌HT-29细胞死亡的过程中有凋亡机制参与^[29]，认为CD80可能通过提高结肠癌细胞对凋亡刺激的敏感性而与活化T细胞产生协同治疗作用。此实验结果验证了活化外周血单个核细胞和CD80对胃癌在体外细胞培养中的杀伤作用，同时证明联合应用CD80可以提高活化外周血单个核细胞对胃癌细胞的杀伤作用，对胃癌康复期的免疫治疗提供重要实验依据。

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