鹿茸干细胞外泌体miRNA-145调控炎症软骨细胞的作用

doi:10.12307/2026.322

中国组织工程研究 ›› 2026, Vol. 30 ›› Issue (13): 3288-3297.doi: 10.12307/2026.322

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鹿茸干细胞外泌体miRNA-145调控炎症软骨细胞的作用

蒋一頔，赵建伟，周珏，吕金朋，王大涛，李勋胜，岳志刚，崔博，孙红梅

中国农业科学院特产研究所，吉林省长春市 130000

收稿日期:2025-04-03 修回日期:2025-07-11 接受日期:2025-07-30 出版日期:2026-05-08 发布日期:2025-12-25
通讯作者: 孙红梅，博士，副研究员，硕士生导师，中国农业科学院特产研究所，吉林省长春市 130000
作者简介:蒋一頔，女，四川省成都市人，汉族，中国农业科学院在读硕士，主要从事鹿茸干细胞及再生医学模型的研究。
基金资助:
吉林省自然科学基金项目(YDZJ202401459ZYTS)，项目负责人：孙红梅；中国农业科学院科技创新工程(CAAS-ASTIP-2021-ISAPS)，项目负责人：孙红梅

Regulation of antler stem cell exosomes miRNA-145 on inflammatory chondrocytes

Jiang Yidi, Zhao Jianwei, Zhou Jue, Lyu Jinpeng, Wang Datao, Li Xunsheng, Yue Zhigang, Cui Bo, Sun Hongmei

Institute of Special Animal and Plant Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130000, Jilin Province, China

Received:2025-04-03 Revised:2025-07-11 Accepted:2025-07-30 Online:2026-05-08 Published:2025-12-25
Contact: Sun Hongmei, PhD, Associate researcher, Master’s supervisor, Institute of Special Animal and Plant Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130000, Jilin Province, China
About author:Jiang Yidi, Master candidate, Institute of Special Animal and Plant Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changchun 130000, Jilin Province, China
Supported by:
Natural Science Foundation of Jilin Province, No. YDZJ202401459ZYTS (to SHM); Science and Technology Innovation Project of Chinese Academy of Agricultural Sciences, No. CAAS-ASTIP-2021-ISAPS (to SHM)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

外泌体：是一类由细胞内出芽形成的直径在50-150 nm的脂质双层微小囊泡，其包含mRNAs、miRNAs、蛋白质等成分，通过旁分泌作用参与细胞之间的信息传递并发挥对受体细胞的调控作用。
miRNA-145：是一种序列高度保守的非编码RNA，已有研究表明与骨关节炎的发生有关，通过降解mRNA或抑制其翻译过程，影响软骨细胞的增殖、分化、凋亡。

摘要
背景：近年来，干细胞外泌体对关节炎的治疗作用备受关注，课题组前期已发现鹿茸干细胞外泌体对软骨缺损有明显修复作用，但其作用机制尚不清楚。
目的：探究鹿茸干细胞外泌体中miRNA-145在关节炎软骨细胞中的调控作用和机制。
方法：通过慢病毒载体系统构建过表达miRNA-145的鹿茸干细胞，并通过超速离心法提取外泌体。将大鼠软骨细胞分为5组：空白对照组、白细胞介素1β组、外泌体+白细胞介素1β组、空载体转染外泌体+白细胞介素1β组、miRNA-145转染外泌体+白细胞介素1β组，除空白对照组外，其余4组用白细胞介素1β诱导软骨细胞24 h建立炎症细胞模型，然后分别用相应外泌体处理，采用CCK-8检测细胞增殖水平，划痕实验检测细胞迁移能力，qPCR、Western blot实验检测软骨细胞相关基因和蛋白表达水平。
结果与结论：①外泌体呈现典型椭圆形双层囊泡样结构，直径在50-150 nm之间，均表达外泌体的经典标志物CD9、ALIX和TSG101，且不表达Calnexin；②鹿茸干细胞外泌体可提高炎症环境下软骨细胞活力、细胞迁移率、Ⅱ型胶原A1、转化生长因子β1、SMAD3、SOX9 mRNA和蛋白表达水平，降低基质金属蛋白酶13 mRNA表达水平；③miRNA-145过表达使炎症环境下软骨细胞活力、细胞迁移率、Ⅱ型胶原A1、转化生长因子β1、SMAD3、SOX9 mRNA和蛋白表达下降，基质金属蛋白酶13 mRNA表达上升；④结果表明，鹿茸干细胞外泌体可以通过转化生长因子β1/SMAD3信号通路促进软骨细胞修复，miRNA-145过表达后抑制软骨细胞修复。

https://orcid.org/0000-0002-4336-941X (孙红梅)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 骨关节炎, 外泌体, 鹿茸干细胞, microRNA, miRNA-145, 软骨细胞, SOX9, 转化生长因子β1(TGF-β1), SMAD3

Abstract: BACKGROUND: In recent years, the research on the role of stem cell exosomes in the treatment of arthritis has attracted more and more attention. In the early stage, our research group found that the secretion of antler stem cells has the potential to repair cartilage injuries, but its specific function is still unclear.
OBJECTIVE: To explore the regulatory role and mechanisms of antler stem cell exosomes miRNA-145 in chondrocyte injury repair.
METHODS: A lentiviral vector system was employed to establish the antler stem cells overexpressing miRNA-145. Exosomes were extracted from these cells using ultracentrifugation. Rat chondrocytes were divided into five groups: blank control group, interleukin 1β group, exosomes + interleukin 1β group, empty vector transfected exosomes + interleukin 1β group, and miRNA-145 transfected exosomes + interleukin 1β group. Except for the blank control group, the chondrocytes in the other four groups were induced with interleukin 1β for 24 hours to establish an inflammatory cell model, and then treated with corresponding exosomes. CCK-8 assay was used to detect the cell proliferation level. The scratch test was used to detect the cell migration ability. qPCR and western blot assay were used to detect the expression levels of chondrocyte-related genes and proteins.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The exosomes exhibited a typical oval double-layer vesicle structure with diameters ranging from 50 to 150 nm, all of which expressed classical markers of exosomes, such as CD9, ALIX, and TSG101, and none of them expressed Calnexin. (2) Antler stem cell exosomes enhanced chondrocyte viability, cell mobility, type II collagen A1, transforming growth factor β1, SMAD3, SOX9 mRNA and protein expression levels, and reduced matrix metalloproteinase 13 mRNA expression level in the inflammatory environment. (3) miRNA-145 further decreased chondrocyte viability, cell mobility, type II collagen A1, transforming growth factor β1, SMAD3, SOX9 mRNA and protein expression, and further increased matrix metalloproteinase 13 mRNA expression in the inflammatory environment. (4) These results conclude that antler stem cell exosomes can promote chondrocyte repair through the transforming growth factor β1/SMAD3 signaling pathway, and overexpression of miRNA-145 inhibits chondrocyte repair.

Key words: osteoarthritis, exosome, antler stem cell, microRNA, miRNA-145, chondrocyte, SOX9, transforming growth factor (TGF-β1), SMAD3

中图分类号:

蒋一頔, 赵建伟, 周珏, 吕金朋, 王大涛, 李勋胜, 岳志刚, 崔博, 孙红梅. 鹿茸干细胞外泌体miRNA-145调控炎症软骨细胞的作用[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(13): 3288-3297.

Jiang Yidi, Zhao Jianwei, Zhou Jue, Lyu Jinpeng, Wang Datao, Li Xunsheng, Yue Zhigang, Cui Bo, Sun Hongmei. Regulation of antler stem cell exosomes miRNA-145 on inflammatory chondrocytes[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2026, 30(13): 3288-3297.

图/表（结果） 7

2.1 过表达miRNA-145鹿茸干细胞株建立 通过慢病毒感染鹿茸干细胞，获得稳定表达miRNA-145的鹿茸干细胞以及空载鹿茸干细胞，如图1所示，在慢病毒感染48 h后约90%的鹿茸干细胞表达绿色荧光，细胞大多呈现均一的长梭形，多次传代后细胞状态良好且绿色荧光不减少。qPCR检测3种细胞miRNA-145表达量，如图2所示，相较于未转染鹿茸干细胞和空载体转染鹿茸干细胞，miRNA-145转染鹿茸干细胞的miRNA-145表达量显著升高，提高约30倍，表明鹿茸干细胞稳转细胞系构建成功。

2.2 外泌体鉴定结果 如图3所示，透射电镜观察显示提取的外泌体呈现典型一侧凹陷的圆形或椭圆形双层囊泡样结构。粒径分析结果显示3种外泌体的直径在50-150 nm之间，符合外泌体的直径大小。Western blot结果显示3种外泌体均表达CD9、ALIX和TSG101，且不表达Calnexin。qPCR结果显示miRNA-145转染外泌体的miRNA-145表达量显著高于单纯外泌体和空载外泌体，这表明miRNA-145成功在鹿茸干细胞中过表达，且能够在鹿茸干细胞外泌体中富集。

2.3 大鼠软骨细胞分离与鉴定 通过甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫荧光染色鉴定提取的大鼠原代软骨细胞，如图4A所示，甲苯胺蓝染色后大鼠软骨细胞基质呈蓝色，细胞核呈深蓝色，呈现三角形或短梭形，细胞核为圆形，随着培养时间延长逐渐变为圆形或近圆的多边形。如图4B所示，Ⅱ型胶原免疫荧光染色显示，90%以上的第2代大鼠软骨细胞发出明显的绿色荧光，呈阳性。

2.4 软骨细胞摄取外泌体情况 用PKH26(红色荧光)标记外泌体后，与大鼠软骨细胞共培养24 h，如图5显示，软骨细胞内聚集了大量红色颗粒样物质，这表明软骨细胞成功摄取3种外泌体。

2.5 鹿茸干细胞外泌体促进软骨细胞增殖和迁移 CCK-8实验结果显示加入白细胞介素1β后软骨细胞活力显著下降(P < 0.05)；与外泌体+白细胞介素1β组和空载外泌体+白细胞介素1β组相比，miRNA-145转染外泌体+白细胞介素1β组培养48 h后软骨细胞活力显著下降(P < 0.05)；与白细胞介素1β组相比，外泌体+白细胞介素1β组和空载外泌体+白细胞介素1β组培养48 h后软骨细胞活力显著升高(P < 0.05)，见图6A。结果表明鹿茸干细胞外泌体对炎性环境下软骨细胞增殖有促进作用，而过表达miRNA-145的鹿茸干细胞外泌体对软骨细胞增殖有抑制作用。
划痕实验结果显示加入白细胞介素1β 12 h后软骨细胞迁移率显著下降(P < 0.05)；与白细胞介素1β组相比，miRNA-145转染外泌体+白细胞介素1β组细胞迁移率显著下降(P < 0.05)；培养24 h后，与白细胞介素1β组相比，外泌体+白细胞介素1β组和空载外泌体+白细胞介素1β组软骨细胞迁移率显著升高(P < 0.05)，见图6B，C。结果表明鹿茸干细胞外泌体对炎性环境下软骨细胞的迁移有促进作用，但过表达miRNA-145后鹿茸干细胞外泌体会抑制软骨细胞的迁移。

2.6 鹿茸干细胞外泌体抑制白细胞介素1β诱导的软骨细胞损伤 qPCR结果显示，加入白细胞介素1β后，软骨细胞Ⅱ型胶原A1、SOX9、转化生长因子β1、SMAD3 mRNA表达显著降低(P < 0.05)，基质金属蛋白酶13 mRNA表达显著升高(P < 0.05)；与白细胞介素1β组相比，外泌体+白细胞介素1β组和空载外泌体+白细胞介素1β组软骨细胞Ⅱ型胶原A1、SOX9、转化生长因子1β、SMAD3 mRNA表达显著升高(P < 0.05)，基质金属蛋白酶13 mRNA表达显著降低(P < 0.05)；与白细胞介素1β组相比，miRNA-145转染外泌体+白细胞介素1β组软骨细胞Ⅱ型胶原A1、SOX9、转化生长因子β1 mRNA表达显著降低(P < 0.05)，基质金属蛋白酶13 mRNA表达显著升高(P < 0.05)，见图7A。
Western blot结果同样表明，白细胞介素1β处理后，软骨细胞Ⅱ型胶原A1、SOX9、转化生长因子β1蛋白表达显著降低(P < 0.05)；与白细胞介素1β组相比，外泌体+白细胞介素1β组和空载外泌体+白细胞介素1β组Ⅱ型胶原A1蛋白表达显著升高，空载外泌体+白细胞介素1β组SOX9蛋白显著升高(P < 0.05)；与白细胞介素1β组相比，miRNA-145转染外泌体+白细胞介素1β组Ⅱ型胶原A1、SOX9蛋白表达显著下降(P < 0.05)，见图7B。
上述结果表明鹿茸干细胞外泌体可以有效逆转炎性环境下大鼠软骨细胞Ⅱ型胶原A1的降解，降低基质金属蛋白酶13的表达水平，从而保护软骨细胞细胞外基质平衡。鹿茸干细胞外泌体可以上调转化生长因子β1/SMAD3通路，有效促进软骨细胞Ⅱ型胶原A1、SOX9表达。而miRNA-145则起到抑制作用，miRNA-145可靶向降低SOX9的表达，提高基质金属蛋白酶13的表达，使炎症环境下软骨细胞的损伤进一步加剧。

参考文献

[1] 中华医学会物理医学与康复学分会,四川大学华西医院.中国膝骨关节炎康复治疗指南(2023版)[J].中国循证医学杂志,2024,24(1): 1-14.
[2] ZHANG L, YANG H, LIU J, et al. Metabolomics-based Approach to Analyze the Therapeutic Targets and Metabolites of a Synovitis Ointment for Knee Osteoarthritis. Current Pharmaceutical Analysis. 2023;19(3):222-234.
[3] XIA Z, MA P, WU N, et al. Altered function in cartilage derived mesenchymal stem cell leads to OA-related cartilage erosion. Am J Transl Res. 2016;8(2):433-446.
[4] IM GI, HENROTIN Y. Regenerative medicine for early osteoarthritis. Ther Adv Musculoskelet Dis. 2023;15:1759720X231194813.
[5] RAPOSO G, STOORVOGEL W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 2013;200(4):373-383.
[6] LOBB RJ, BECKER M, WEN SW, et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 2015;4:27031.
[7] TIAN X, HE X, QIAN S, et al. Immunoregulatory effects of human amniotic mesenchymal stem cells and their exosomes on human peripheral blood mononuclear cells. BIOCELL.2023;47(5):1085-1093.
[8] PEKÁČOVÁ A, BALOUN J, ŠVEC X, et al. Non-coding RNAs in diseases with a focus on osteoarthritis. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2023;14(3): e1756.
[9] YAMAZAKI A, TOMO Y, ETO H, et al. A pilot study of microRNA assessment as a means to identify novel biomarkers of spontaneous osteoarthritis in dogs. Sci Rep. 2022;12(1):18152.
[10] 周珏.鹿茸干细胞分泌蛋白促进大鼠软骨缺损修复[D].北京:中国农业科学院,2023.
[11] 秦涛.鹿茸四区段mRNA-microRNA表达谱测定、分析及蜡片区调控网络构建[D].北京:中国农业科学院,2020.
[12] LI C, LITTLEJOHN RP, SUTTIE JM. Effects of insulin-like growth factor 1 and testosterone on the proliferation of antlerogenic cells in vitro. J Exp Zool. 1999;284(1):82-90.
[13] FAN B, LI C, SZALAD A, et al. Mesenchymal stromal cell-derived exosomes ameliorate peripheral neuropathy in a mouse model of diabetes. Diabetologia. 2020;63(2):431-443.
[14] KIM J, TRAN AN, LEE JY, et al. Human Fetal Cartilage-Derived Progenitor Cells Exhibit Anti-Inflammatory Effect on IL-1β-Mediated Osteoarthritis Phenotypes In Vitro. Tissue Eng Regen Med. 2022;19(6):1237-1250.
[15] 刘冬阳,黄昕彤,赖晋锋,等.中国中老年人慢性病共病流行趋势研究[J].中国慢性病预防与控制,2024,32(4):244-249.
[16] 王伟康,刘晓冬,周长林,等.MiRNAs在骨关节炎发生发展中的调控作用[J].中国组织工程研究,2021,25(35):5709-5715.
[17] JIANG S, LIU Y, XU B, et al. Noncoding RNAs: New regulatory code in chondrocyte apoptosis and autophagy. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2020;11(4):e1584.
[18] PALAMÀ MEF, COCO S, SHAW GM, et al. Xeno-free cultured mesenchymal stromal cells release extracellular vesicles with a “therapeutic” miRNA cargo ameliorating cartilage inflammation in vitro. Theranostics. 2023;13(5):1470-1489.
[19] YIN B, NI J, WITHEREL CE, et al. Harnessing Tissue-derived Extracellular Vesicles for Osteoarthritis Theranostics. Theranostics. 2022;12(1): 207-231.
[20] ZHOU J, ZHAO J, WANG Y, et al. Repair of Mechanical Cartilage Damage Using Exosomes Derived from Deer Antler Stem Cells. Front Biosci (Landmark Ed). 2024;29(8):309.
[21] KIM M, SHIN DI, CHOI BH, et al. Exosomes from IL-1β-Primed Mesenchymal Stem Cells Inhibited IL-1β- and TNF-α-Mediated Inflammatory Responses in Osteoarthritic SW982 Cells. Tissue Eng Regen Med. 2021;18(4):525-536.
[22] LI S, STÖCKL S, LUKAS C, et al. Curcumin-primed human BMSC-derived extracellular vesicles reverse IL-1β-induced catabolic responses of OA chondrocytes by upregulating miR-126-3p. Stem Cell Res Ther. 2021;12(1):252.
[23] GAO JY, WANG XJ, YU JP, et al. Loss of autophagy in condylar chondrocytes causes increased apoptosis rate in temporomandibular joint osteoarthritis of rats. Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi. 2020; 55(5):343-347.
[24] ABO-ZALAM HB, ABDELSALAM RM, ABDEL-RAHMAN RF, et al. In Vivo Investigation of the Ameliorating Effect of Tempol against MIA-Induced Knee Osteoarthritis in Rats: Involvement of TGF-β1/SMAD3/NOX4 Cue. Molecules. 2021;26(22):6993.
[25] PU P, QINGYUAN M, WEISHAN W, et al. Protein-Degrading Enzymes in Osteoarthritis. Z Orthop Unfall. 2021;159(1):54-66.
[26] 杨均,李澎.转化生长因子β诱导骨髓间充质干细胞分化为半月板纤维软骨细胞[J].中国组织工程研究,2023,27(15):2412-2419.
[27] FONGSODSRI K, TIYASATKULKOVIT W, CHAISRI U, et al. Sericin promotes chondrogenic proliferation and differentiation via glycolysis and Smad2/3 TGF-β signaling inductions and alleviates inflammation in three-dimensional models. Sci Rep. 2024;14(1):11553.
[28] KISHTA MS, KHAMIS A, AM H, et al. Exploring the tumor-suppressive role of miRNA-200c in head and neck squamous cell carcinoma: Potential and mechanisms of exosome-mediated delivery for therapeutic applications. Transl Oncol. 2025;51:102216.
[29] WANG Z, WANG W, ZUO B, et al. Identification of potential pathogenic genes related to osteoporosis and osteoarthritis. Technol Health Care. 2024;32(6):4431-4444.
[30] MUÑOZ EL, FUENTES FB, FELMER RN, et al. Extracellular vesicles in mammalian reproduction: a review. Zygote. 2022;30(4):440-463.
[31] YANG F, XIONG WQ, LI CZ, et al. Extracellular vesicles derived from mesenchymal stem cells mediate extracellular matrix remodeling in osteoarthritis through the transport of microRNA-29a. World J Stem Cells. 2024;16(2):191-206.
[32] LIN T, WU N, WANG L, et al. Inhibition of chondrocyte apoptosis in a rat model of osteoarthritis by exosomes derived from miR‑140‑5p‑overexpressing human dental pulp stem cells. Int J Mol Med. 2021;47(3):7.
[33] JOUNG S, YOON DS, CHO S, et al. Downregulation of MicroRNA-495 Alleviates IL-1β Responses among Chondrocytes by Preventing SOX9 Reduction. Yonsei Med J. 2021;62(7):650-659.
[34] LIU H, LIU P. Kartogenin Promotes the BMSCs Chondrogenic Differentiation in Osteoarthritis by Down-Regulation of miR-145-5p Targeting Smad4 Pathway. Tissue Eng Regen Med. 2021;18(6): 989-1000.
[35] MARTINEZ-SANCHEZ A, LAZZARANO S, SHARMA E, et al. High-Throughput Identification of MiR-145 Targets in Human Articular Chondrocytes. Life (Basel). 2020;10(5):58.
[36] WU M, LIU F, YAN L, et al. MiR-145-5p restrains chondrogenic differentiation of synovium-derived mesenchymal stem cells by suppressing TLR4. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids. 2022;41(7): 625-642.

引言

骨关节炎是一种常见的退行性关节疾病，最常见于膝关节。骨关节炎的发生可导致关节软骨降解、骨赘形成、软骨下硬化、滑膜增生、半月板变性、囊膜韧带肥大等，引起疼痛、畸形、关节功能障碍。由于软骨中缺乏血管，氧气和营养物质的供应受到限制，阻碍了受损软骨的修复[1]，软骨损伤后往往预后不良，严重影响患者的生活质量。目前临床上治疗早期骨关节炎的方法主要是关节腔注射玻璃酸钠，这种方法只能短期内缓解症状；中期治疗骨关节炎的方法主要是微创关节清理术、人工关节置换，这种手术疗法存在外源性材料植入感染、替换关节寿命短、需要二次手术等缺点[2]。
目前，细胞疗法成为治疗软骨损伤的新方法[3]，主要有间充质干细胞、软骨细胞等，一方面，通过细胞的自我更新能力和多潜能性诱导软骨再生，另一方面干细胞可通过旁分泌作用促进细胞增殖、迁移、分化、抗凋亡等，进而促进软骨损伤的修复[4]。外泌体是干细胞旁分泌的主要成分，是一种直径在50-150 nm的具有脂质双层质膜的微小生物囊泡[5-6]，包含mRNAs、miRNAs、蛋白质等成分，参与细胞间的信息传递并发挥对受体细胞的调控作用[7]。
miRNA是一种序列高度保守的非编码RNA，其长度约为22个核苷酸，近年来已有大量研究表明miRNA与关节炎的发生有关[8-9]。鹿茸的再生与哺乳动物的软骨形成过程相似，均由间充质细胞发展而来，鹿茸干细胞外泌体中含有大量miRNA，其在促进软骨形成方面发挥着重要作用，但发挥的功效尚不完全明确。课题组在前期研究中发现鹿茸干细胞的旁分泌物能有效修复软骨损伤[10]，鹿茸干细胞外泌体(anlter stem cell derived exosomes，ASC-exos)可增强软骨细胞的增殖、迁移能力，维持软骨细胞表型。课题组前期对鹿茸各区段miRNA测序发现miRNA-145在蜡片区高表达，而在软骨形成的粉片区低表达[11]，该研究旨在探讨鹿茸干细胞外泌体中miRNA-145对软骨修复的调控作用及机制。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞实验。
1.2 时间及地点 实验于2024年2-12月在中国农业科学院特产研究所完成。
1.3 材料 鹿茸干细胞由中国农业科学院特产研究所特种动物干细胞课题组提供，按照LI等[12]的方法进行培养；DMEM培养基、青霉素-链霉素(美国Gibco)；胎牛血清(美国Sigma)；大鼠肿瘤坏死因子α、白细胞介素6 ELIAS试剂盒(上海酶联生物)；反转录试剂盒、TB Green Premix Ex TaqⅡ(日本Takara)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、Anti-CD9抗体、Anti-GAPDH抗体、Anti-TSG101抗体、BeyoPEI™转染试剂、PKH26、白细胞介素1β(上海碧云天)；Calnexin多克隆抗体(武汉三鹰生物)；重组抗SOX9抗体、抗转化生长因子β1抗体、抗ALIX抗体(英国Abcam)；抗Ⅱ型胶原A1抗体(武汉赛维尔)；实时荧光定量PCR仪(德国Yena)；倒置显微镜(日本Olympus IX51)；超速离心机(美国Therom)；酶标仪(中国普朗新)。
3周龄雄性SD大鼠4只，体质量30-40 g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，实验动物生产许可证号：SCXK(吉)2023-0002，动物质量合格证号：01021741595572454。实验方案经中国农业科学院特产研究所实验动物伦理委员会批准，审批号为ISAPSAEC-2024-033SD。
1.4 实验方法
1.4.1 构建miRNA-145过表达的鹿茸干细胞 通过PubMed网站寻找马鹿miRNA-145的基因CDS序列，使用SnapGene软件设计序列，构建质粒。取指数生长的293T细胞接种于T175瓶，实验前融合度达70%-80%，取10 µg pLV3-CMV-Mir145-CopGFP-Puro质粒/pLV3-CMV-MCS2-EF1a-CopGFP-Puro质粒、8 µg psPAX2、4.5 µg pMD2.G，加入2 250 µL无血清DMEM混合均匀，加入40 µL PEI转染试剂混匀，室温孵育15 min。将292T细胞培养基更换为无血清DMEM，将转染复合物逐滴加入培养瓶中轻轻混匀，37 ℃、体积分数5% CO2培养箱孵育6 h，将培养基更换为含体积分数10%胎牛血清、无双抗DMEM。转染48 h后收集细胞培养液，3 000×g离心10 min去除细胞碎片，用超速离心机72 000×g离心2 h进行浓缩，弃上清，加入100 μL DMEM培养基重悬，-80 ℃保存。实验前1 d将第3代鹿茸干细胞按9×104/孔密度接种于6孔培养板中，在37 ℃、体积分数5% CO2培养箱培养，第2天细胞融合度为50%-60%，弃掉培养基，将miRNA-145-up慢病毒和空载慢病毒(感染复数为100)分别与8 μg/mL polybrene混匀加入到细胞中，放回培养箱继续培养，培养过夜后补充1 mL新鲜完全培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM)继续培养，48 h后更换为含4 μg/mL嘌呤霉素的培养基筛选稳定细胞。
1.4.2 外泌体提取与鉴定 通过慢病毒转染鹿茸干细胞，获得了稳定高表达miRNA-145的鹿茸干细胞以及空载鹿茸干细胞，使用含体积分数10%去外泌体胎牛血清(4 ℃、100 000×g离心2 h，去除血清中的外泌体)和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基培养，待细胞长满后收集培养上清液，使用超速离心法提取外泌体[13]，将外泌体用PBS稀释，调整为1 μg/μL。
外泌体鉴定：①透射电镜观察：在碳覆膜的铜网上滴加20 μL外泌体溶液，将铜网倒扣于醋酸铀染液上负染30 s，烘干后放置于白光下，在-80 kV透射电镜下观察并拍照分析外泌体结构；②粒径分析：用PBS冲洗仪器连接管，然后抽取稀释的不同浓度的样品缓慢注射入连接管，单颗粒纳米生物检测仪检测粒子数。③蛋白免疫印迹检测外泌体标志蛋白CD9、TSG101、ALIX以及阴性蛋白Calnexin的表达。
1.4.3 大鼠软骨细胞提取与鉴定 取3周龄雄性SD大鼠4只，麻醉处死，置于体积分数75%乙醇中浸泡10 min后转移至超净台取出髋关节软骨，使用胰酶37 ℃消化30 min，然后加入4 mL DMEM完全培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM)配置的0.2%Ⅱ型胶原酶溶液，放置在培养箱中静止消化3 h，加入5 mL DMEM完全培养基终止消化，300×g离心5 min，弃上清，加入1 mL DMEM完全培养基重悬细胞，接种到T25培养瓶中，补足5 mL DMEM完全培养基，37 ℃、体积分数5% CO2培养箱培养2 d后换液。取生长良好的第2代细胞进行甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫荧光染色鉴定。
1.4.4 软骨细胞摄取外泌体示踪 取100 μL外泌体加入1 mL Diluent C，再加入4 µL PKH26染料，轻轻混匀，室温避光孵育5 min，加入2 mL 10% BSA终止染色反应，孵育1 min，超速离心机100 000×g离心1 h去除未结合的PKH26染料。将PKH26标记的外泌体与软骨细胞共孵育24 h(含体积分数10%去外泌体胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM培养基，37 ℃、体积分数5% CO2培养箱)，吸去培养基，PBS漂洗3次，加入40 g/L多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次，避光加入DAPI染核10 min，PBS漂洗3次，倒置荧光显微镜观察软骨细胞摄取外泌体情况。
1.4.5 关节炎软骨细胞模型构建和细胞分组 将对数生长期软骨细胞分为空白对照组(未进行炎症诱导)、白细胞介素1β组、外泌体+白细胞介素1β组、空载外泌体+白细胞介素1β组、miRNA-145转染外泌体+白细胞介素1β组，除空白对照组外，其余4组加入10 ng/mL 白细胞介素1β干预24 h，建立关节炎细胞模型[14]，造模后空白对照组和白细胞介素1β组加入含体积分数2%胎牛血清的DMEM培养基培养，其余3组加入含未转染外泌体或空载体转染外泌体或miRNA-145转染外泌体以及体积分数2%胎牛血清的DMEM培养基培养。
1.4.6 鹿茸干细胞外泌体对软骨细胞的作用
(1)CCK-8检测软骨细胞增殖情况：取对数生长期软骨细胞，以3×103/孔密度接种于96孔板中，根据分组每孔加入对应培养基培养(外泌体加入量为1 μg/孔，外泌体质量浓度为1 μg/μL)，分别在12，24，48 h弃掉培养基，每孔加入100 μL用无血清DMEM培养基配置的10%CCK-8试剂，细胞培养箱内孵育2 h，酶标仪检测450 nm波长处吸光度值。
(2)划痕实验检测软骨细胞迁移情况：取对数生长期软骨细胞，以2×106/孔密度接种于6孔板中，待细胞融合达到90%时用100 μL枪头进行划痕，根据分组每孔加入对应培养基继续培养(外泌体加入量为30 μg/孔，外泌体质量浓度为1 μg/μL)，分别在0，6，12，24 h用显微镜观察细胞迁移情况并拍照，使用Image J软件测量划痕面积，分析划痕闭合率。

(3)RT-qPCR检测软骨细胞相关mRNA表达：取对数生长期软骨细胞，以1×105/孔密度接种于6孔板中，根据分组每孔加入对应培养基 (外泌体加入量为15 μg/孔，外泌体质量浓度为1 μg/μL)，培养72 h时每孔加入1 mL Trizol，按照说明书步骤提取细胞总RNA并进行RT-qPCR，以GAPDH为内参检测软骨细胞Ⅱ型胶原A1、SOX9、转化生长因子β1、SMAD3、基质金属蛋白酶13基因的表达，以U6为内参检测miRNA-145的表达，反应体系见表1，2，引物序列见表3。根据2-ΔΔCt计算各基因表达情况。

(4)Western blot检测软骨细胞相关蛋白表达：取对数生长期软骨细胞，以1×105/孔密度接种于6孔板中，根据分组每孔加入对应培养基(外泌体加入量为15 μg/孔，外泌体质量浓度1 μg/μL)，培养72 h时用预冷的PBS洗涤细胞3次，每孔加入100 μL蛋白裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)提取细胞总蛋白，通过BCA法测定蛋白浓度，加入5×的蛋白上样缓冲液，98 ℃ 10 min使蛋白变性，随后进行电泳转移蛋白至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，以GAPDH(一抗稀释倍数1∶1 000)为内参检测软骨细胞Ⅱ型胶原A1(1∶1 000)、SOX9(1∶5 000)、转化生长因子β1 (1∶1000)蛋白表达，一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，每次5 min，二抗孵育1 h(1∶1 000)，TBST洗涤3次，每次5 min，随后进行显影。使用Image J软件统计灰度值，以目的蛋白灰度值/内参蛋白灰度值进行归一化处理分析。

1.5 主要观察指标 ①慢病毒感染效率，miRNA-145在鹿茸干细胞中的表达量；②外泌体鉴定结果；③大鼠软骨细胞鉴定结果；④外泌体对软骨细胞活力、迁移的影响；⑤外泌体对软骨细胞相关mRNA和蛋白表达的影响。
1.6 统计学分析 使用Graphpad Prism 10.0进行统计学分析。所有数据均通过正态分布检验，以x±s表示，各组间使用单因素方差分析以及t检验比较组间数据差异，P < 0.05为差异有显著性意义。该文统计学方法已经通过中国农业科学院特产研究所生物统计学专家审核。

讨论

随着中国社会经济的快速发展和人口结构的变化，老龄化问题日益凸显，骨关节炎作为老年人群中常见的慢性疾病，已成为影响国民健康和生活质量的重要公共卫生问题[15]。在治疗骨关节炎方面，间充质干细胞及其分泌的外泌体显示出巨大的潜力。外泌体作为细胞间通讯的重要递质，能够携带多种生物活性分子，如蛋白质、脂质、mRNA和miRNA等，这些分子在细胞间传递信号，调节细胞功能。miRNA在关节炎的病理过程中扮演着重要的调控角色，这些非编码RNA分子通过与特定的mRNA靶标结合，调控基因表达，从而影响细胞的增殖、分化、凋亡以及炎症反应等生物学过程。在骨关节炎中，miRNA的异常表达与软骨退化、滑膜炎症和关节功能障碍密切相关[16-18]。在课题组前期研究中，发现鹿茸干细胞外泌体可以促进软骨细胞增殖，并且对大鼠软骨损伤具有良好的修复作用[19]，但对于鹿茸干细胞外泌体中发挥作用的物质尚不明确，通过对鹿茸干细胞外泌体进行miRNA测序，筛选出了与软骨相关的miRNA，但作用机制和相关通路还有待探讨。
根据文献报道白细胞介素1β可以诱导正常软骨细胞损伤，可以模拟骨关节炎软骨细胞的状态[20-21]。该研究发现，白细胞介素1β处理后软骨细胞的增殖能力和迁移能力下降，软骨细胞的标志蛋白Ⅱ型胶原A1下降，软骨细胞外基质分解标志物基质金属蛋白酶13表达量上升。研究表明，骨关节炎的形成与软骨细胞外基质合成和降解的动态平衡遭到破坏有关，当炎症发生时白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α等炎症因子大量被释放，显著上调基质金属蛋白酶13的表达，从而导致Ⅱ型胶原A1降解。基质金属蛋白酶13作为软骨细胞外基质降解的标志性分解酶，可以反映软骨细胞遭到破坏的程度[22-23]。Ⅱ型胶原A1、SOX9、转化生长因子β1、SMAD3和基质金属蛋白酶13是关键的分子，它们在维持软骨稳态、调控炎症反应以及参与关节炎的病理过程中发挥重要作用。Ⅱ型胶原A1是软骨细胞外基质的主要成分，负责维持软骨的结构和功能。SOX9是软骨细胞分化和维持的关键转录因子，直接参与调控Ⅱ型胶原A1的表达，而Ⅱ型胶原A1和SOX9直接受转化生长因子β1/SMAD3通路调控，当炎症发生时白细胞介素1β会抑制转化生长因子β1/SMAD3通路，导致SOX9和Ⅱ型胶原A1表达下降[24]。转化生长因子β1/SMAD3信号通路是细胞内一个重要的信号传导途径，通过转化生长因子β受体丝-苏氨酸蛋白激酶催化下游效应分子Smad2或Smad3磷酸化，在间充质干细胞分化、软骨形成起着重要作用[25-27]。该研究加入鹿茸干细胞外泌体后软骨细胞的增殖能力和迁移能力均有所上升，在培养24 h后能达到正常软骨细胞的水平。在加入鹿茸干细胞外泌体培养软骨细胞72 h后Ⅱ型胶原A1、SOX9、转化生长因子β1、SMAD3基因和蛋白表达升高，基质金属蛋白酶13基因和蛋白表达下降，这表明鹿茸干细胞外泌体可以通过转化生长因子β1/SMAD3信号通路对白细胞介素1β诱导的软骨细胞损伤进行修复，并且抑制软骨细胞外基质的降解。
在骨关节炎中多种miRNA通过降解mRNA或抑制翻译过程，影响软骨细胞的增殖、分化、凋亡，miRNA的差异表达反映了关节炎的病理过程[28]。研究发现miRNA-29a缓解骨关节炎进展，促进细胞外基质生成[29]。miRNA-29a通过靶向作用基质金属蛋白酶和胶原酶等，减少软骨细胞外基质的降解，保护软骨组织。目前外泌体靶向递送miRNA治疗疾病已展现出显著优势和巨大潜力，外泌体的脂质双层膜结构能够将miRNA包裹在内保护miRNA免受核酸酶的降解，提高miRNA的稳定性，从而能够高效地将miRNA递送至靶细胞，并释放到细胞质中发挥作用[30]。外泌体高效递送miRNA，在癌症、心血管疾病、神经退行性疾病和炎症性疾病等领域展现出广阔的应用前景。研究表明外泌体可以作为天然纳米载体，克服了传统递送方法的局限性，将miRNA-200c靶向递送至肿瘤细胞，展现出外泌体递送miRNA的优越性[31]。通过改变外泌体中miRNA的含量可以对目标细胞进行靶向递送，LIN等[32]通过构建过表达miRNA-140-5p的人滑膜间充质干细胞，获得外泌体治疗大鼠关节炎，结果显示miRNA-140通过激活Wnt信号通路和YAP通路，增强了软骨细胞的增殖和迁移能力，提高了细胞外基质的分泌，显著降低了骨关节炎的发生概率[33]。SOX9是软骨的关键转录因子，在前人研究中发现miRNA-145靶标蛋白为SOX9[34]，miRNA-145可以通过靶向作用于SOX9的mRNA使得SOX9蛋白表达量下降，从而对软骨细胞的增殖起负调控作用[35-36]。课题组前期对鹿茸各区段miRNA测序发现，miRNA-145在不同区段中出现差异表达，推测可能与软骨的形成分化相关。miRNA-145是否可以在鹿茸干细胞外泌体中富集并作用于软骨细胞，以及作用的具体机制还需探讨。该实验中通过慢病毒对鹿茸干细胞进行转染，得到了高表达miRNA-145的细胞系，并提取了富集miRNA-145的外泌体，研究发现加入高表达miRNA-145的鹿茸干细胞外泌体后软骨细胞的增殖能力和迁移能力下降，Ⅱ型胶原A1、SOX9、转化生长因子β1、SMAD3基因和蛋白表达下降，基质金属蛋白酶13基因和蛋白表达上升，表明高表达miRNA-145的鹿茸干细胞外泌体可以通过作用于SOX9，进而调控转化生长因子1β/SMAD3信号通路抑制软骨细胞的增殖和迁移，miRNA-145对软骨的生成起反向作用。
综上所述，该研究通过体外实验论证鹿茸干细胞外泌体可激活转化生长因子β1/Smad3通路促进白细胞介素1β 诱导的软骨细胞损伤修复，并发现富含miRNA-145的鹿茸干细胞外泌体可通过靶向抑制SOX9从而抑制软骨再生的具体分子机制。未来可以通过设计对于miRNA-145的内源性竞争siRNA对外泌体进行改造，为干细胞外泌体在软骨损伤中的运用提供可能的理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

鹿茸干细胞外泌体miRNA-145调控炎症软骨细胞的作用

Regulation of antler stem cell exosomes miRNA-145 on inflammatory chondrocytes

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[1]	陈秋函, 杨龙, 袁代柱, 吴展羽, 邹梓豪, 叶川. 膝关节周围截骨治疗膝骨关节炎：治疗策略的优化[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(9): 2303-2312.
[2]	张子峥, 罗旺, 刘长路. 膝内侧间室骨关节炎单髁置换中有限元分析的应用价值[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(9): 2313-2322.
[3]	张楠, 孟庆华, 鲍春雨. 踝关节有限元模型的特性及临床应用[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(9): 2343-2349.
[4]	黎清斌, 林建辉, 黄文杰, 王明爽, 杜间开, 劳永锵. 膝关节周围骨巨细胞瘤病灶扩大刮除后填充骨水泥：软骨下植骨与不植骨的比较[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(8): 1896-1902.
[5]	宋浦蓁, 马贺宾, 陈宏广, 章亚东. 骨髓间充质干细胞外泌体联合转化生长因子β1对巨噬细胞的作用[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1616-1623.
[6]	何家乐, 黄茜, 董鸿斐, 陈朗, 钟方宇, 李先慧. 脱细胞真皮基质联合脂肪干细胞外泌体促进烧伤创面愈合[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1699-1710.
[7]	夏林枫, 王露, 龙乾发, 唐荣武, 罗浩东, 汤轶, 钟俊, 刘阳. 人脐带间充质干细胞来源外泌体减轻脓毒症脑病小鼠血脑屏障损伤[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1711-1719.
[8]	陈钰璘, 何莹莹, 胡凯, 陈枝凡, 聂莎, 蒙衍慧, 李闰珍, 张小朵, 李宇稀, 唐耀平. 瓜蒌类外泌体囊泡防治动脉粥样硬化的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1768-1781.
[9]	韩腾, 马洪, 杨若仪, 罗祎, 李超. 口腔鳞状细胞癌细胞来源外泌体递送血管生成素2参与肿瘤血管生成[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1755-1767.
[10]	黄嘉雯, 潘之怡, 薛文君, 廉源沛, 徐建达. 植物源性囊泡与恶性肿瘤治疗：跨物种交流并调节宿主细胞反应[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1828-1838.
[11]	王白燕, 杨树, 王弋鸣, 吴梦晴, 肖瑀, 郭梓璇, 张博艺, 冯书营. 外泌体递送CRISPR/Cas系统在靶细胞内可实现基因编辑[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1839-1849.
[12]	王振泽, 刘奋德, 张瑞, 李武军. 间充质干细胞治疗下肢动脉硬化闭塞症：系统评价和Meta分析[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(7): 1869-1876.
[13]	李林臻, 焦泓焯, 陈伟南, 张铭哲, 王建龙, 张君涛. 淫羊藿苷含药血清对脂多糖诱导人软骨细胞炎症损伤的影响[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(6): 1368-1374.
[14]	陈驹, 郑锦畅, 梁振, 黄成硕, 林颢, 曾莉. β-石竹烯对小鼠膝骨关节炎的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(6): 1341-1347.
[15]	吕国庆, 艾孜麦提江·肉孜, 熊道海. 鸢尾素抑制人关节软骨细胞中铁死亡的作用及其机制[J]. 中国组织工程研究, 2026, 30(6): 1359-1367.