成骨诱导因子缓释系统修饰国产多孔钽对MG63细胞功能的影响

doi:10.12307/2024.410

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (17): 2696-2701.doi: 10.12307/2024.410

• 组织工程骨材料 tissue-engineered bone • 上一篇下一篇

成骨诱导因子缓释系统修饰国产多孔钽对MG63细胞功能的影响

郭小玲1，李粤源2，徐田杰1，张辉3，王志强2，王茜1

1华北理工大学基础医学院，河北省唐山市 063000；2华北理工大学附属医院骨科，河北省唐山市 063000；3唐山市第二医院关节一科，河北省唐山市 063000

收稿日期:2023-06-10 接受日期:2023-07-20 出版日期:2024-06-18 发布日期:2023-12-15
通讯作者: 王茜，博士，副教授，硕士生导师，华北理工大学基础医学院，河北省唐山市 063000
作者简介:郭小玲，女，1999年生，湖南省永州市人，汉族，在读硕士，主要从事骨组织工程研究。
基金资助:
国家科技支撑计划课题资助项目(2012BAE06B03)，项目负责人：王志强；河北省科技支撑资助项目(16277776D)，项目负责人：王志强；三三人才工程(C20221117)，项目负责人：张辉；河北省2023年度医学科学研究课题(20230215)，项目负责人：王茜

Effect of domestic porous tantalum modified by osteogenic induction factor slow-release system on function of MG63 cells

Guo Xiaoling1, Li Yueyuan2, Xu Tianjie1, Zhang Hui3, Wang Zhiqiang2, Wang Qian1

1Basic Medical College of North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, Hebei Province, China; 2Department of Orthopedics, Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, Hebei Province, China; 3First Department of Arthrology, Tangshan Second Hospital, Tangshan 063000, Hebei Province, China

Received:2023-06-10 Accepted:2023-07-20 Online:2024-06-18 Published:2023-12-15
Contact: Wang Qian, MD, Associate professor, Master’s supervisor, Basic Medical College of North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, Hebei Province, China
About author:Guo Xiaoling, Master candidate, Basic Medical College of North China University of Science and Technology, Tangshan 063000, Hebei Province, China
Supported by:
National Science and Technology Support Program, No. 2012BAE06B03 (to WZQ); Hebei Province Science and Technology Support Project, No. 16277776D (to WZQ); Three-Three Talent Project, No. C20221117 (to ZH); 2023 Medical Science Research Project in Hebei Province, No. 20230215 (to WQ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

多孔钽：实验使用的金属多孔钽材料采用海绵浸渍-高温烧结技术制备，材料切面粗糙，具有丰富的蜂窝状孔隙，镜下观察各孔隙间互通，呈多重十二面体网格排列，该结构类似人体松质骨结构，易诱导骨的内向生长。
成骨诱导因子缓释系统：聚乳酸-羟基乙酸共聚化合物作为典型的人工合成可降解高分子材料在医学领域得到广泛的应用，其可在生物体内通过三羧酸循环，依靠酯键水解而发生降解，最终降解的产物二氧化碳和水通过肺脏排出，对人体组织细胞无毒无害；其具有强大的缓释能力，可通过负载生物活性物质成骨诱导因子组成成骨诱导因子缓释系统，提高支架的成骨活性且促进骨再生。

背景：课题组前期研究发现，国产多孔钽有利于MG63细胞的早期黏附、增殖，可用作骨组织工程支架材料。

目的：进一步探讨成骨诱导因子缓释系统修饰的国产多孔钽对MG63细胞黏附增殖及分化能力的影响。
方法：在聚乳酸-羟基乙酸共聚化合物凝胶中加入体积分数为15%的成骨诱导因子溶液，构成成骨诱导因子缓释系统。取第3代MG63细胞，分别接种于单纯多孔钽表面(对照组)、聚乳酸-羟基乙酸共聚化合物凝胶涂覆的多孔钽表面(凝胶涂覆组)、成骨诱导因子缓释系统涂覆的多孔钽表面(缓释系统涂覆组)，共培养5 d后，利用鬼笔环肽染色观察材料表面细胞骨架，流式细胞仪检测细胞增殖，Western blot、RT-qPCR检测材料表面细胞Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、RUNX-2的蛋白和mRNA表达。

结果与结论：①鬼笔环肽染色显示，MG63细胞在3组多孔钽表面及内部黏附生长，细胞分泌的基质覆盖在材料表面；②流式细胞仪检测显示，缓释系统涂覆组细胞增殖快于对照组、凝胶涂覆组(P < 0.05)；③Western blot、RT-qPCR检测显示，缓释系统涂覆组Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、RUNX-2的蛋白和mRNA表达均高于对照组、凝胶涂覆组(P < 0.05)；④结果表明，经成骨诱导因子缓释系统修饰的国产多孔钽有利于MG63成骨细胞的黏附、增殖及分化。

https://orcid.org/0009-0003-8693-4460(郭小玲)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 多孔钽, MG63细胞, 缓释系统, 成骨诱导因子, 聚乳酸-羟基乙酸共聚化合物

Abstract: BACKGROUND: Previous research by the research team found that domestically produced porous tantalum is beneficial for early adhesion and proliferation of MG63 cells, and can be used as a scaffold material for bone tissue engineering.
OBJECTIVE: To investigate the effect of domestic porous tantalum modified by osteogenic induction factor slow-release system on the adhesion, proliferation, and differentiation of MG63 cells.
METHODS: Osteogenic induction factor slow-release system was constructed by adding 15% volume fraction of osteogenic factor solution to poly(lactic-co-glycolic-acid) gel. The passage 3 MG63 cells were inoculated on a porous tantalum surface (control group), porous tantalum surface coated with poly(lactic-co-glycolic-acid) copolymer gel (gel group), and porous tantalum surface coated with osteoblastic induction factor slow-release system (slow-release system group), and co-cultured for 5 days. The surface cytoskeleton of the material was observed by phalloidine staining. Cell proliferation was detected by flow cytometry. Western blot assay and RT-qPCR were used to detect the protein and mRNA expressions of type I collagen, osteopontin, and RUNX-2 on the surface cells of the material.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Phalloidine staining showed that MG63 cells adhered to and grew on the surface and inside of the three groups of porous tantalum, and the matrix secreted by the cells covered the surface of the material. (2) Flow cytometry showed that the cell proliferation in the slow-release system group was faster than that in the control group and the gel group (P < 0.05). (3) Western blot assay and RT-qPCR showed that the protein and mRNA expressions of type I collagen, osteopontin, and RUNX-2 in the slow-release system group were higher than those in the control group and gel group (P < 0.05). (4) The results showed that the domestic porous tantalum modified by the osteogenic induction factor slow-release system was beneficial to the adhesion, proliferation, and differentiation of MG63 osteoblasts.

Key words: porous tantalum, MG63 cell, slow-release system, osteogenic induction factor, poly(lactic-co-glycolic-acid) copolymer

中图分类号:

郭小玲, 李粤源, 徐田杰, 张辉, 王志强, 王茜. 成骨诱导因子缓释系统修饰国产多孔钽对MG63细胞功能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(17): 2696-2701.

Guo Xiaoling, Li Yueyuan, Xu Tianjie, Zhang Hui, Wang Zhiqiang, Wang Qian. Effect of domestic porous tantalum modified by osteogenic induction factor slow-release system on function of MG63 cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(17): 2696-2701.

图/表（结果） 8

2.1 MG63细胞形态学观察倒置相差显微镜下观察原代MG63细胞接种后为圆球形，大多数细胞贴壁生长并呈梭形及多角形，胞质向外伸展形成突起，第5天细胞快速生长体积增大、相互连结，可铺满瓶底，紧密排列且细胞形态不易区分(图1A、B)。第3代细胞生长速度增快，贴壁时间缩短，形态趋于单一化，呈长梭形或多角形(图1C、D)。

2.2 多孔钽表面观察及内部观察多孔钽为深灰色方形薄片，表面有大小不等的蜂窝状间隙(图2A)，扫描电镜下可见多孔钽表面及断面有直径20-50 μm的微粒，微粒间有直径400-600 μm的微孔结构，孔隙率80%左右，且微粒间孔隙呈相互连通的网状结构，这种良好的微孔结构有助于细胞培养及营养物质的输送，并为细胞集落和组织的形成提供有利的三维立体空间(图2B)。扫描电镜下观察成骨诱导因子缓释系统涂覆多孔钽，可见缓释系统均匀附着在多孔钽材料表面，保持良好的相互连通的网状结构(图2C)。

2.3 各组多孔钽表面细胞骨架荧光显微镜下观察鬼笔环肽染色结果，DAPI标记的细胞核呈蓝色荧光，FITC 标记的细胞微丝结构呈绿色荧光，细胞浆与细胞核的合成荧光图可见，细胞微丝结构包绕成环形，细胞分泌的基质覆盖在材料表面(图3)，结果表明MG63细胞在各组多孔钽表面及内部黏附生长，各组多孔钽材料对MG63细胞无毒无害，具有良好的细胞相容性。

2.4 各组多孔钽表面细胞增殖情况流式细胞仪检测显示，3组多孔钽表面细胞增殖率比较差异有显著性意义[(27.833±1.097)%，(23.400±0.436)%，(38.033±1.724)%，F=116.048，P=0.000]，缓释系统涂覆组细胞增殖快于对照组、凝胶涂覆组(P < 0.05)，对照组细胞增殖快于凝胶涂覆组(P < 0.05)，见图4。

2.5 各组多孔钽表面细胞成骨相关因子蛋白表达比较 Western blot检测显示，3组间多孔钽表面细胞Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、RUNX-2的蛋白表达比较差异有显著性意义(P < 0.05)，与对照组、凝胶涂覆组比较，缓释系统涂覆组多孔钽表面细胞Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、RUNX-2的蛋白表达升高(P < 0.05)；与凝胶涂覆组比较，对照组钽表面细胞Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、RUNX-2的蛋白表达升高(P < 0.05)，见图5，表2。

2.6 各组多孔钽表面细胞成骨相关因子mRNA表达比较 qRT-PCR检测显示，3组间多孔钽表面细胞Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、RUNX-2的mRNA表达比较差异有显著性意义(P < 0.05)，与对照组、凝胶涂覆组比较，缓释系统涂覆组多孔钽表面细胞Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、RUNX-2的mRNA表达升高(P < 0.05)；与凝胶涂覆组比较，对照组钽表面细胞Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、RUNX-2的mRNA表达升高(P < 0.05)，见图6，表3。

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引言

由于骨骼疾病引发的骨缺损病例日益增多并极大地影响患者的生活质量，已成为人们严重担忧的问题。自体和同种异体骨移植因其良好的骨诱导特性而成为修复骨缺损最常用的方法之一，然而却存在供体不足、引发机体强烈免疫反应和传播疾病的潜在威胁等问题[1-3]。尽管目前骨组织工程和再生医学取得了良好进展，但修复巨大的骨缺损仍然具有挑战性，因此，开发具有良好成骨特性的植入材料应用于骨缺损的修复已经成为当下骨组织工程的研究热点[4]。
成骨诱导因子具有在体外诱导骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的能力，为了保持和延长成骨诱导因子的药效，优化成骨诱导因子的骨诱导功能，采用聚乳酸-羟基乙酸共聚化合物(poly lactic-co-glycolic-acid，PLGA)作为载体制备成骨诱导因子缓释系统。其中，PLGA作为典型的人工合成的可降解高分子材料，其最大的特点是降解产物对人体组织细胞无毒无害，已被大量研究证实具有优异的缓释能力，在降解过程中可实现药物长效释放[5-7]。有研究表明PLGA支架的成骨活性和血管重建能力有限，但其具有强大的缓释能力，如负载成骨诱导因子及干细胞等可提高支架的成骨活性促进骨再生[8]。金属材料具有优异的机械强度以及耐疲劳特性，也非常适于人体承重部位的骨替代植入[9-10]。金属多孔钽内部具有纵横交错、相互连通的微孔结构，可增加细胞对纤维素的捕获能力、促进成骨细胞黏附、加快骨整合及整合强度，促进骨形成，具有与骨组织相似的弹性模量及良好的生物相容性[11-13]。此次研究试图探讨经成骨诱导因子缓释系统修饰后的国产多孔钽对MG63细胞增殖和分化的影响，为临床应用可降解高分子材料和国产多孔钽支架材料治疗骨缺损和促进骨再生提供理论和实验依据。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞分子生物学体外实验，多组间比较进行单因素方差分析，组间两两比较时采用LSD-t检验。
1.2 时间及地点实验于2021年9月至2022年6月在华北理工大学基础医学院、河北省慢性疾病重点实验室、唐山市慢性病临床基础研究重点实验室及华北理工大学中心实验室完成。
1.3 材料多孔钽片(重庆润泽医疗器械有限公司，中国)；人成骨肉瘤细胞(MG63细胞)(北京协和医学院基础学院细胞资源中心)；DMEM高糖培养基、胎牛血清 (Gibco，美国)；青霉素、链霉素(深圳华药南方制药有限公司，中国)；维生素C、地塞米松(Sigma，美国)；β-甘油磷酸钠(Alfa Aesar，美国)；N-甲基-2-吡咯烷酮、三乙酸甘油酯(上海麦克林生化科技有限公司，中国)；PLGA75/25(山东岱罡生物科技有限公司，中国)；兔抗人Ⅰ型胶原多克隆抗体、兔抗人骨桥蛋白多克隆抗体、兔抗人RUNX-2多克隆抗体、GADPH抗体、BeyoClick™EDU-488细胞增殖试剂盒(碧云天，中国)；CO2培养箱(Esco，美国)；倒置相差显微镜(Olympus，日本)；超净台(上海一恒科学仪器有限公司，中国)；S-4800扫描电镜(日立，日本)；流式细胞仪(BD Biosciences，美国)；免疫印迹电泳槽(北京六一仪器厂，中国)；免疫印迹电泳仪(北京六一仪器厂，中国)。
1.4 方法
1.4.1 MG63细胞的培养将冻存的MG63细胞从液氮取出后复苏，加入含体积分数10%胎牛血清、1%青霉素和1%链霉素的DMEM培养基培养，置于37 ℃、体积分数5%CO2及饱和湿度孵箱内静置培养。使用倒置显微镜观察细胞的生长情况，两三天换液1次，当细胞生长融合至80%时进行传代。取生长状态良好的第3代MG63细胞进行实验。
1.4.2 多孔钽的准备多孔钽为长度20 mm、宽度20 mm、厚度为2 mm的灰色方形薄片，表面光滑，其表面可见致密分布的针尖大小、蜂窝状孔隙 (直径400-600 μm，孔隙率70%-80%)。所有多孔钽片依次用丙酮、去离子水和无水乙醇超声清洗15 min，然后风干和高压蒸汽灭菌30 min，密封备用。多孔钽片使用时都需无菌转移到6孔细胞培养板上，在细胞接种前在超净台内暴露于紫外线照射30 min。
1.4.3 成骨诱导因子缓释系统的制备将200 mg β-甘油磷酸钠、5 mg维生素C溶解于100 mL蒸馏水中，磁力搅拌10 min；另将4 mg地塞米松溶于100 mL无水乙醇，磁力搅拌10 min。
取10 μL地塞米松溶液加入β-甘油磷酸钠与维生素C的混合液中并磁力搅拌10 min，过滤除菌后得到成骨诱导因子溶液，避光4 ℃冷藏备用。先将有机溶剂N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、反应性增溶剂三乙酸甘油酯(GTA)按体积比5∶5混合，再向混合溶液中加入质量分数40%的PLGA，充分混匀后过滤除菌得到黏度适宜、质软、无沉淀的PLGA凝胶，最后加入体积分数为15%的成骨诱导因子溶液制得成骨诱导因子缓释系统。直接将PLGA凝胶、成骨诱导因子缓释系统分别涂覆到多孔钽片上，用于细胞实验。
用离子溅射仪对高压灭菌后的多孔钽及成骨诱导因子缓释系统涂覆多孔钽喷金，扫描电镜下观察多孔钽及成骨诱导因子缓释系统涂覆多孔钽的内部结构并拍照。
1.4.4 MG63细胞接种接种前用无菌吸管将1 mL成骨诱导因子缓释系统涂覆到多孔钽片表面(缓释系统涂覆组)，将1 mL PLGA凝胶涂覆到多孔钽表面(凝胶涂覆组)，对照组的多孔钽片不做处理。将3组多孔钽片分别置于6孔板内，每孔加入3 mL DMEM完全培养基充分浸泡预湿24 h。取第3代生长状态良好的MG63细胞，接种于3组多孔钽片表面，钽片两面各接种1×105个MG63细胞，接种后置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养，每间隔2 d更换一次培养基。
1.4.5 鬼笔环肽染色观察细胞骨架形态细胞与多孔钽片共培养5 d后，用37 ℃预热的1×PBS清洗多孔钽2次，在40 g/L多聚甲醛溶液中固定10 min，常规清洗(1×PBS清洗2次)，用具有透化作用的0.5%Triton-100溶液处理10 min后常规清洗，按鬼笔环肽∶甲醇=1∶200 的比例配置 FITC 标记的鬼笔环肽工作液，室温下避光孵育2 h后再常规清洗，使用DAPI溶液染细胞核1 min后常规清洗，锡纸避光晾干后荧光显微镜下观察采图。
1.4.6 流式细胞仪检测细胞增殖细胞与多孔钽片共培养5 d后，收集各组细胞接种于6孔板中，在含有体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中培养8 h，加入10 μmol/L的EDU工作液孵育2 h，用40 g/L多聚甲醛固定细胞，按BeyoClick™EDU细胞增殖试剂盒说明书步骤进行细胞核染色，利用流式细胞仪检测各组细胞增殖。
1.4.7 Western blot法检测Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、RUNX-2的蛋白表达细胞与多孔钽片共培养5 d后，收集各组细胞，加入细胞裂解液裂解，提取蛋白定量后加入4×样本缓冲液，100 ℃变性5 min。取20 μg样品在电泳仪内电泳，电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入兔抗人Ⅰ型胶原多克隆抗体(1∶1 000)、兔抗人骨桥蛋白多克隆抗体(1∶1 000)、兔抗人RUNX-2多克隆抗体 (1∶2 000)、GADPH抗体(1∶2 000)，4 ℃过夜，以PBS洗涤3次，每次10 min；加HRP标记山羊抗兔二抗(1∶2 000)，室温孵育2 h；以PBS洗涤3次，加入ECL化学发光试剂后放入暗盒中压片并依次显影、固定，并用其配套软件分析实验结果。以Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、RUNX-2与GADPH的比值表示相应蛋白表达量。

1.4.8 RT-qPCR法检测各组Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、RUNX-2 mRNA的表达细胞与多孔钽片共培养5 d后，按Trizol RNA标准分离法提取各组细胞总RNA，依照公式计算出RNA浓度、纯度，其质量浓度统一调整为500 mg/L，反转录合成cDNA。引物序列设计由睿博兴科(北京)公司完成，引物序列见表1。应用合成的cDNA进行扩增体系反应。设定循环次数为40；各循环阶段温度分别为95 ℃2 min、95 ℃15 s、56 ℃25 s 、72 ℃20 s；熔解温度72 ℃5 min、95 ℃15 s、60 ℃15 s，升温到95 ℃20 min、95 ℃15 s。检测结束后，通过相对定量方法Comparative Delta-delta Ct分析PCR结果。

1.5 主要观察指标各组多孔钽表面的细胞骨架形态、增殖以及Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、RUNX-2的蛋白和mRNA表达。
1.6 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件对实验数据进行统计。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验方法，以P < 0.05表示差异有显著性意义。该文统计学方法已经华北理工大学生物统计学专家审核。

讨论

钽是一种过渡的稀有金属，其熔点高(3 014 ℃)、质地坚硬且延展性好，其还具有理想的导热性和导电性。自20世纪40年代以来，钽金属被制成外科缝合线、起搏器电极、颅骨成形板、不透射线标志物以及用于神经修复的箔片和网状物首次应用于医疗行业[14]。金属钽是生物惰性的，因此与体液不发生反应，对人体的组织细胞没有刺激作用，因此钽表现出良好的生物相容性。目前钽金属的体内和体外实验均显示出令人满意的结果，没有任何明显的炎症或过敏反应。有研究表明，所有类型的细胞都可以在金属钽上存活，并维持细胞正常的活性和生长状态[15-17]，目前并没有研究报道钽金属对人体组织细胞有毒性作用，因此享有“亲生物”金属的美誉[18-20]。此次研究采用重庆润泽医疗器械有限公司和国内多家高校科研机构共同研制的国产多孔钽，扫描电镜观察可见多孔钽材料表面富含蜂窝状间隙，内部含大量直径400-600 μm的微孔结构，且内部空隙相互连通，该材料表面粗糙，可促进细胞的黏附和生长，其弹性模量更接近人体自然的皮质和松质骨，可诱导新生骨组织向孔隙内生长并促进骨整合，因此多孔钽具有良好的骨传导性。
迄今为止，单纯金属植入材料在骨缺损中的应用效果有限。目前局部应用适当浓度的成骨诱导因子对于患严重骨缺损的患者来说是一种简单而有效的方法，因此寻找合适的药物缓释载体也是近年来骨组织工程的研究热点。此次实验配制的成骨诱导因子由地塞米松、维生素C及甘油磷酸钠组成，是一种典型的成骨诱导剂，已被证实在体外对成骨分化具有积极作用[21]。PLGA一直是最受欢迎的药物缓释载体之一，它是FDA批准的聚合物，具有生物降解性及良好的生物相容性。虽然PLGA被认为是一类理想的骨修复材料，但有研究发现纯 PLGA表面具有较强的疏水性，同时PLGA纳米粒子带有负电荷，会与带负电的细胞膜发生排斥反应，因此不利于成骨细胞和血管内皮细胞的黏附和迁移，故而纯PLGA支架在体内缺乏足够的成骨和成血管能力[22]。同时纯PLGA降解产物会促进多核巨细胞、巨噬细胞和成纤维细胞趋化和增殖，引发慢性炎症反应，从而抑制新生骨形成[23-24]。近年有研究人员将PLGA微球同时负载人骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子，植入体内后发现骨形态发生蛋白2与血管内皮生长因子能够持续从PLGA支架内释放，有效促进骨细胞的增殖和分化，相比纯PLGA支架其成骨能力和血管重建能力均有所提升[25-26]。Ⅰ型胶原是成骨细胞分泌的骨基质中最重要的纤维胶原蛋白成分，可以为细胞的黏附生长提供自体支架，是评价成骨细胞功能的重要指标[27-30]。骨桥蛋白是由成熟的成骨细胞分泌的一种重要成骨因子蛋白，也是成骨细胞的标志物之一，能调节许多生理过程、促进骨基质吸收与矿化、加速血管生成等，在促进骨缺损修复过程中发挥巨大作用[31-34]。RUNX-2属于RUNX家族转录因子，是参与骨形成过程中最早和最特异的标记基因，也是软骨细胞和成骨细胞分化的关键因子[35-38]。CHEN等[39]研究发现经PLGA+成骨诱导因子涂层修饰的种植体具有良好的生物相容性，并能显著促进成骨细胞在种植体表面的黏附、增殖和分化，与此次研究结果相一致。
此次研究将成骨诱导因子缓释系统与多孔钽材料复合后，进一步探索成骨诱导因子缓释系统和国产多孔钽材料对MG63细胞功能的影响。采用鬼笔环肽染色观察各组多孔钽材料与MG63复合培养生长情况，结果发现细胞与各组多孔钽材料复合良好，表明各组多孔钽材料对MG63细胞无毒无害，具有良好的细胞相容性，具备优秀的生物相容性是种植体植入机体后达到与组织稳定整合的必要条件。BeyoClick™ EDU-488细胞增殖试剂盒检测3组MG63细胞增殖情况，结果发现缓释系统涂覆组细胞增殖快于凝胶涂覆组和对照组，可显著促进细胞增殖；与对照组相比，凝胶涂覆组细胞增殖能力减慢。研究采用Western blot法和RT-qPCR法检测MG63细胞成骨相关因子Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、RUNX-2的蛋白和mRNA表达，结果发现缓释系统涂覆组Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、RUNX-2的蛋白与mRNA表达均高于凝胶涂覆组和对照组(P < 0.05)，凝胶涂覆组Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、RUNX-2的蛋白和mRNA表达低于对照组(P < 0.05)，造成这一现象的机制尚不清楚，有可能是因为PLGA等聚酯材料亲水性差且本身不具有成骨诱导能力，不利于细胞黏附、增殖和分化，也有可能是因为PLGA降解生成酸性产物酸化了微环境，从而更促进支架降解、抑制细胞的生长[22，40]。MEYER等[41]评估了PLGA降解产物乳酸和乙醇酸对体外培养的人成骨细胞的影响，发现细胞增殖减少，因为PLGA的降解产物导致pH值下降，从而导致成骨细胞增殖减少、细胞分化及矿化失败。此次研究中，当PLGA与成骨诱导因子组合构成成骨诱导因子缓释系统并修饰多孔钽材料时，这种对细胞增殖及分化的抑制似乎被逆转。LIU等[42]将PLGA-成骨诱导因子缓释系统修饰后的金属钛材料与成骨细胞共培养，采用CCK-8法评估成骨细胞的增殖能力，结果发现PLGA-成骨诱导因子缓释系统组钛表面更有利于促进成骨细胞的黏附和增殖。此次实验证实，MG63细胞与经成骨诱导因子缓释系统修饰的多孔钽材料共培养后，多孔钽材料具有良好的细胞相容性，可促进细胞的增殖，并且能显著提高Ⅰ型胶原、骨桥蛋白、RUNX-2的表达量，促进细胞分化。刘旭琳等[43]以PLGA作为缓释载体制备PLGA-成骨诱导因子缓释系统，将其应用于兔下前牙拔牙窝，术后进行影像学和组织学检查，结果显示PLGA缓释系统组的新生骨组织速度优于PLGA组和空白组(P < 0.05)，说明PLGA-成骨诱导因子缓释系统对成骨细胞增殖与分化具有促进作用。此次研究结果与上述研究结果一致。
综上所述，经成骨诱导因子缓释系统修饰的国产多孔钽支架材料有利于MG63 成骨细胞的黏附、增殖及分化。整体而言，随着研究深入及技术革新，该材料有望成为较理想的骨组织工程支架材料，但美中不足的是其在体内修复骨缺损的效果尚不清楚，缺少体内实验，有待进一步研究证实。虽然多孔钽在修复骨缺损方面优势独特，但因其相对较稀有以及造价非常昂贵等原因限制了它的广泛使用，目前仍然需要进一步突破材料制备工艺，开发性能优异以及成本低的医用多孔钽材料。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

成骨诱导因子缓释系统修饰国产多孔钽对MG63细胞功能的影响

Effect of domestic porous tantalum modified by osteogenic induction factor slow-release system on function of MG63 cells

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