Lewis大鼠骨髓来源成熟和未成熟树突状细胞的提取与鉴别

doi:10.12307/2024.190

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (25): 4013-4017.doi: 10.12307/2024.190

• 干细胞培养与分化 stem cell culture and differentiation • 上一篇下一篇

Lewis大鼠骨髓来源成熟和未成熟树突状细胞的提取与鉴别

李立强1，2，李明皓2，李良1，李文波1，张军1，孔令梅1

1合肥市第二人民医院肝胆外科/安徽医科大学附属合肥医院肝胆外科/蚌埠医学院附属合肥市第二人民医院教学医院，安徽省合肥市 230011；2宁夏回族自治区人民医院肝胆外科，宁夏回族自治区银川市 750002

收稿日期:2023-06-20 接受日期:2023-08-17 出版日期:2024-09-08 发布日期:2023-11-23
通讯作者: 张军，硕士，副主任医师，合肥市第二人民医院肝胆外科/安徽医科大学附属合肥医院肝胆外科/蚌埠医学院附属合肥市第二人民医院教学医院，安徽省合肥市 230011 李明皓，博士，主任医师，宁夏回族自治区人民医院肝胆外科，宁夏回族自治区银川市 750002
作者简介:李立强，男，1992年生，安徽省定远县人，2021年宁夏医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事肝移植的免疫耐受研究。李良，男，1966年生，安徽省定远县人，1989年蚌埠医学院毕业，主任医师，主要从事肝胆的免疫耐受及胃癌的分子学机制研究。
基金资助:
国家自然科学基金地区基金(81560114)，项目负责人：李明皓；宁夏自然科学基金(2021AAC03308)，项目负责人：
李明皓；蚌埠医学院科技项目自然科学重点项目(2022byzd200)，项目负责人：张军；蚌埠医学院科技项目自然科学重点项目(2022byzd199)，项目负责人：李良

Extraction and differentiation of mature and immature dendritic cells from Lewis rat bone marrow

Li Liqiang1, 2, Li Minghao2, Li Liang1, Li Wenbo1, Zhang Jun1, Kong Lingmei1

1Department of Hepatobiliary Surgery, Second People’s Hospital of Hefei/Department of Hepatobiliary Surgery, Hefei Hospital Affiliated to Anhui Medical University/Teaching Hospital of Second People’s Hospital of Hefei Affiliated to Bengbu Medical College, Hefei 230011, Anhui Province, China; 2Department of Hepatobiliary Surgery, People’s Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, Yinchuan 750002, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Received:2023-06-20 Accepted:2023-08-17 Online:2024-09-08 Published:2023-11-23
Contact: Zhang Jun, Master, Associate chief physician, Department of Hepatobiliary Surgery, Second People’s Hospital of Hefei/Department of Hepatobiliary Surgery, Hefei Hospital Affiliated to Anhui Medical University/Teaching Hospital of Second People’s Hospital of Hefei Affiliated to Bengbu Medical College, Hefei 230011, Anhui Province, China Li Minghao, MD, Chief physician, Department of Hepatobiliary Surgery, People’s Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, Yinchuan 750002, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Li Liqiang, Master, Attending physician, Department of Hepatobiliary Surgery, Second People’s Hospital of Hefei/Department of Hepatobiliary Surgery, Hefei Hospital Affiliated to Anhui Medical University/Teaching Hospital of Second People’s Hospital of Hefei Affiliated to Bengbu Medical College, Hefei 230011, Anhui Province, China; Department of Hepatobiliary Surgery, People’s Hospital of Ningxia Hui Autonomous Region, Yinchuan 750002, Ningxia Hui Autonomous Region, China Li Liang, Chief physician, Department of Hepatobiliary Surgery, Second People’s Hospital of Hefei/Department of Hepatobiliary Surgery, Hefei Hospital Affiliated to Anhui Medical University/Teaching Hospital of Second People’s Hospital of Hefei Affiliated to Bengbu Medical College, Hefei 230011, Anhui Province, China
Supported by:
Regional Fund of National Natural Science Foundation of China, No. 81560114 (to LMH); Ningxia Natural Science Foundation, No. 2021AAC03308 (to LMH); Natural Science Key Project of Science and Technology Project of Bengbu Medical College, No. 2022byzd200 (to ZJ); Natural Science Key Project of Science and Technology Project of Bengbu Medical College, No. 2022byzd199 (to LL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

树突状细胞：它在体内具有极强的免疫抗原提呈功能，特别是树突状细胞处于未成熟状态下，主要通过组织相容性复合体捕获、处理抗原并将抗原递呈给初始T细胞，以激活抗原特异性的细胞免疫反应。
混合淋巴细胞反应：在具有抗原提呈功能的树突状细胞刺激下，T细胞发生增殖和活化，根据淋巴细胞反应的强度来评价组织相容性抗原差异和对异体细胞的反应能力。

背景：树突状细胞在未成熟阶段表现出极强的抗原吞噬功能，它可以在免疫耐受、癌症的免疫治疗等方面都表现出极大的优越性。但由于未成熟树突状细胞在生物体内含量极微，这就严重限制了它在临床、科研方面的应用。

目的：提取鉴别Lewis大鼠骨髓来源成熟和未成熟树突状细胞。
方法：从Lewis大鼠骨髓中分离骨髓前体细胞，应用20 ng/mL粒细胞集落刺激因子、10 ng/mL白细胞介素4培养7 d诱导为未成熟树突状细胞，然后在未成熟树突状细胞中加入1 μg/mL脂多糖继续培养2 d诱导为成熟树突状细胞。采用荧光倒置显微镜观察树突状细胞形态，流式细胞仪鉴定成熟和未成熟树突状细胞表面特异性分子，ELISA检测成熟和未成熟树突状细胞培养上清白细胞介素10、白细胞介素12和白细胞介素17A因子的分泌水平，混合淋巴细胞反应检测成熟和未成熟树突状细胞对T淋巴细胞的刺激反应。

结果与结论：①普通荧光倒置显微镜下观察树突状细胞具有明显的突起结构；②流式细胞仪可见未成熟树突状细胞低表达CD40、CD86等共刺激分子；相反，成熟树突状细胞高表达上述共刺激分子；③未成熟树突状细胞的白细胞介素10、白细胞介素17A分泌水平要远高于成熟树突状细胞(P < 0.01)；未成熟树突状细胞的白细胞介素12分泌水平低于成熟树突状细胞(P < 0.05)；④成熟树突状细胞对T细胞的刺激明显比成熟树突状细胞强，当成熟树突状细胞与T淋巴细胞比例达到1∶10时刺激能力更强；⑤结果表明：Lewis大鼠骨髓前体细胞可以分化为树突状细胞，通过流式细胞鉴定、相关因子检测、混合淋巴细胞反应能够鉴别树突状细胞的成熟和未成熟状态。

https://orcid.org/0000-0001-8856-1387 (李立强)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 树突状细胞, 未成熟树突状细胞, 成熟树突状细胞, 细胞因子, 混合淋巴细胞反应

Abstract: BACKGROUND: Dendritic cells exhibit extremely strong antigen phagocytic function in the immature stage, and they can demonstrate great advantages in immune tolerance, cancer immunotherapy, and other aspects. However, due to the extremely low content of immature dendritic cells in living organisms, its clinical and scientific applications are severely limited.
OBJECTIVE: To study the extraction and identification of mature and immature dendritic cells from Lewis rat bone marrow.
METHODS: Bone marrow precursor cells were isolated from the bone marrow of Lewis rats, and immature dendritic cells were induced by 20 ng/mL of granulocyte colony-stimulating factor and 10 ng/mL of interleukin-4 for 7 days, and then mature dendritic cells were induced by adding 1 μg/mL of lipopolysaccharide to immature dendritic cells for 2 days. The morphology of dendritic cells was observed using inverted fluorescence microscopy. The surface-specific molecules of mature and immature dendritic cells were identified by flow cytometry, and the secretion levels of supernatant interleukin-10, interleukin-12, and interleukin-17A in mature and immature dendritic cells were detected by ELISA. The response of mature and immature dendritic cells to T lymphocyte stimulation was measured by mixed lymphocyte reaction.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The dendritic cells showed an obvious protrusion structure under an ordinary inverted fluorescence microscope. (2) Flow cytometry showed low expression of CD40, CD86, and other co-stimulatory molecules in immature dendritic cells. On the contrary, mature dendritic cells highly expressed the above co-stimulatory molecules. (3) The secretion of interleukin-10 and interleukin-17A in immature dendritic cells was much higher than that in mature dendritic cells (P < 0.01). Interleukin-12 secretion in immature dendritic cells was much lower than that in mature dendritic cells (P < 0.05). (4) Mature dendritic cells stimulated T cells significantly better than immature dendritic cells, and the stimulation ability was stronger when the ratio of mature dendritic cells to T lymphocytes reached 1:10. (5) The results indicate that Lewis rat bone marrow precursor cells can differentiate into dendritic cells and distinguish between mature and immature dendritic cells by flow cytometry identification, related factor detection, and mixed lymphocyte reaction.

Key words: dendritic cell, immature dendritic cell, mature dendritic cell, cytokine, mixed lymphocyte reaction

中图分类号:

李立强, 李明皓, 李良, 李文波, 张军, 孔令梅. Lewis大鼠骨髓来源成熟和未成熟树突状细胞的提取与鉴别[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(25): 4013-4017.

Li Liqiang, Li Minghao, Li Liang, Li Wenbo, Zhang Jun, Kong Lingmei. Extraction and differentiation of mature and immature dendritic cells from Lewis rat bone marrow[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(25): 4013-4017.

图/表（结果） 5

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引言

树突状细胞属于抗原提呈细胞，它是目前已知抗原提呈功能最强的细胞之一[1-2]，主要通过组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)捕获、处理抗原并将抗原递呈给初始T细胞，以激活抗原特异性的细胞免疫反应[3]。抗原提呈与免疫激活是树突状细胞最重要的功能，根据刺激T细胞增殖能力的不同以及按照成熟的情况，树突状细胞可分为未成熟树突状细胞和成熟树突状细胞。在生理状态下，生物体内大部分存在的都是未成熟树突状细胞，未成熟树突状细胞可以捕获处理抗原，在激活和启动免疫应答中起着重要作用。成熟树突状细胞呈递给T细胞[4]，增加机体的免疫排斥。成熟树突状细胞表达丰富的共刺激分子，例如参与激活初始T细胞的MHC Ⅰ类和Ⅱ类分子、CD40、CD80和CD86[5]。树突状细胞还通过自身分泌或诱导其他细胞大量合成和分泌白细胞介素12、白细胞介素6、白细胞介素10、肿瘤坏死因子α、干扰素γ等细胞因子提供第三信号，从而激活T细胞[6-7]，产生抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)效应，这是树突状细胞诱导免疫耐受的另一重要功能[8-11]。同时树突状细胞还参与调节性T细胞的产生和诱导，进而参与免疫耐受的形成和维持[12]。树突状细胞在未成熟阶段表现出极强的抗原吞噬功能，它可以在免疫耐受、癌症的免疫治疗等方面都表现出极大的优越性能[13]。但由于未成熟树突状细胞在生物体内含量极微，这就严重限制了它在临床、科研方面的应用。目前，市面上出现磁珠分选方法来提取未成熟树突状细胞，虽可以提取到纯度极高的未成熟树突状细胞，但此方法用的试剂和设备过于昂贵且收获的细胞数量过低，远远无法满足临床及科研的需求。该实验采用小鼠重组粒细胞集落刺激因子和小鼠重组白细胞介素4来诱导树突状细胞分化为未成熟树突状细胞，以期为临床及科研提供实验纯度较高的未成熟树突状细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计动物提取细胞实验，组间数据比较采用t检验。
1.2 时间及地点实验于2022年8月至2023年5月在安徽医科大学动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 20只SPF级雄性Lewis大鼠，6-8周龄，体质量300 g左右，购自安徽医科大学动物中心。
实验方案经合肥市第二人民医院动物实验伦理委员会批准，审批号为2023科研-050。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2 试剂和仪器粒细胞集落刺激因子和白细胞介素4购自美国PepreTech公司；RPMI1640培养基、胎牛血清购自以色列BI(Biological Industries)公司；藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记的抗大鼠CD80抗体(CD80-PE)、PE标记的抗大鼠CD86抗体(CD86-PE)、别藻蓝蛋白(allophycocyanin，APC)标记的抗大鼠CD40抗体(CD40-APC)、APC标记的抗大鼠主要组织相容性复合体Ⅱ(major histocompatibility complex MHC-Ⅱ)抗体、APC标记的抗大鼠OX62/CD103抗体均购自美国BD公司；红细胞裂解液购自天津市灏洋公司；脂多糖购自美国Sigma公司；ELISA试剂盒购自武汉博士德公司；流式细胞仪购自美国贝克曼公司。
1.4 方法
1.4.1 Lewis大鼠树突状细胞的提取和体外培养 ①取雄性健康Lewis大鼠，腹腔注射450 mg戊巴比妥对大鼠进行安乐死，放入体积分数75%乙醇中浸泡30 min。②将浸泡后的大鼠放置微生物工作台内，用无菌剪刀和棉垫反复将附着于股骨和胫骨上的肌肉剥脱干净，然后在培养皿中装满体积分数75%乙醇，将清洗后的骨头浸入培养皿中5-10 s，使其外表消毒，以确保无菌条件，从乙醇中取出骨头并彻底清洗。③小心切开每根骨头的两端，露出骨髓，使用含PBS的3 mL注射器反复冲洗，收集冲洗液，通过200目细胞滤网，过滤到15 mL离心管中，在室温下以1 500 r/min离心5 min，小心去除上清。④将骨髓细胞(带有红细胞)重悬于5 mL红细胞裂解液中，混匀，静置裂解2 min，在室温下以300×g离心15 min，小心去除上清液。⑤重复步骤④1次。⑥加入RPMI1640完全培养基(含体积分数15%胎牛血清)10 mL重悬细胞，吹打为单细胞悬液后转移到6孔圆底板中，于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱培养。⑦4 h后，吸出6孔板中的上清，加入含20 ng/mL粒细胞集落刺激因子、10 ng/mL白细胞介素4的RPMI1640完全培养基。⑧隔日半换液，补充细胞因子。
1.4.2 荧光倒置显微镜观察树突状细胞的形态连续诱导7 d，倒置荧光显微镜下观察其细胞形态(根据相关文献，此时的细胞可认为是未成熟树突状细胞[14])。
1.4.3 脂多糖刺激未成熟树突状细胞成熟取未成熟树突状细胞加入1 μg/mL脂多糖，继续培养2 d，留作备用。
1.4.4 流式细胞仪鉴定树突状细胞表面的特异性分子 ①分别收集6孔圆底培养板中2组(一组未加入脂多糖的树突状细胞，另一组是加入脂多糖的树突状细胞)待测细胞悬液，分别等量装入2只1.5 mL离心管，加入500 μL PBS，1 500 r/min离心3 min，弃上清。②将细胞悬液的细胞浓度调整为1×109 L-1，加入1 μL PE或APC标记的抗大鼠CD40、CD80、MHC-Ⅱ和OX62单克隆抗体，同时设置阴性对照。③上述细胞充分混匀后，在4 ℃避光孵育30 min，4 ℃ PBS洗涤细胞3遍。④加入500 μL PBS上机检测。
1.4.5 ELISA法检测树突状细胞及未成熟树突状细胞的白细胞介素10、白细胞介素12、白细胞介素17A分泌水平从-80 ℃冰箱中分别取出未成熟树突状细胞和成熟树突状细胞的上清，严格按照ELISA试剂盒说明步骤依次检测所需细胞因子水平。
1.4.6 混合淋巴细胞反应(mixed lymphocyte reaction，MLR)
(1)刺激细胞的制备：RPMI1640培养基分别重悬未成熟树突状细胞和成熟树突状细胞，细胞浓度调整为4×108 L-1，加入丝裂霉素C至终质量浓度为25 μg/mL，37 ℃、体积分数5%CO2培养箱孵育45 min，PBS洗涤2遍，留作刺激细胞备用。
(2)反应细胞的制备：①取正常健康的雄性Lewis大鼠，腹腔注射450 mg戊巴比妥对大鼠进行安乐死，取出脾脏，眼科剪剪碎放置于100目细胞筛上，5 mL无菌注射器针芯反复碾压脾脏，RPMI1640培养基冲洗细胞筛3次，得到单细胞悬液，然后加入大鼠外周血淋巴细胞分离液10 mL，900×g离心30 min。按照细胞悬液与分离液体积比为1∶2配比，调整细胞浓度为2×109 L-1，分装至EP管，经MACS CD4+ T细胞分选试剂盒磁珠分选：上述EP管加入16 µL分选缓冲液，轻轻重悬细胞；重悬结束后加入磁珠抗体CD44 µL，吹打均匀，锡纸包裹并放于4 ℃ 15 min；细胞置于LD柱上，加入500 µL分选缓冲液，让缓冲液缓慢通过LD柱，通过LD柱的细胞即为所需要的CD4+ T细胞。在96孔圆底板中将未成熟树突状细胞与T淋巴细胞按1∶40，1∶20，1∶10，1∶5的比例混合共培养，成熟树突状细胞也按照同样的比例混合培养，每个比例均设置3个复孔；同时设置阴性组和空白组。培养结束前4 h，每孔中依次加入CCK-8试剂10 µL，采用酶标仪检测各孔的吸光度值，取其平均值。
1.5 主要观察指标 ①荧光倒置显微镜观察树突状细胞的形态；②流式细胞仪分析成熟和未成熟树突状细胞的细胞表面分子的阳性表达率；③ELISA检测成熟及未成熟树突状细胞的白细胞介素10、白细胞介素12、白细胞介素17A的表达；④成熟和未成熟树突状细胞对T淋巴细胞的刺激反应。
1.6 统计学分析采用 SPSS 21.0统计软件包进行数据处理及分析，计量资料结果以x±s表示，两组间数据比较采用t检验，P≤0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过安徽医科大学统计学专家审核。

讨论

树突状细胞具有抗原呈递、免疫调节等功能而闻名[15-16]。根据树突状细胞的成熟阶段，可分为成熟树突状细胞和未成熟树突状细胞。该实验从树突状细胞的普通光镜形态、细胞表面分子阳性率、T淋巴细胞的刺激反应、炎性因子水平等方面来鉴定Lewis大鼠的未成熟树突状细胞和成熟树突状细胞形态、功能特点和免疫应答的关系。随着诱导时间的延长，树突状细胞的突触逐渐增多及明显，说明初始的树突状细胞是未成熟状态，随着时间的延长，树突状细胞逐渐转变为成熟状态，这与既往的研究一致[17]。粒细胞集落刺激因子和白细胞介素4质量浓度对树突状细胞的生成至关重要，作者在之前实验中不断摸索两者的质量浓度[18]，最终探索出合适的质量浓度刺激Lewis大鼠骨髓前体细胞分化为树突状细胞。
该实验采取较为简便的方法即可得到数量足够实验使用的树突状细胞，这为后期的相关实验奠定基础。流式细胞术检测树突状细胞表面的特异性分子，在未经过脂多糖刺激之前，未成熟树突状细胞低表达CD40、CD80、MHC-Ⅱ等共刺激分子，抗原提呈功能弱[19]；相反，在经过1.0 μg/mL脂多糖刺激后成熟树突状细胞高表达上述3项共刺激分子，抗原提呈功能强[20]。Lewis大鼠骨髓在经过粒细胞集落刺激因子和白细胞介素4刺激后前体细胞逐渐转化成树突状细胞，流式细胞仪检测树突状细胞表面特异性分子OX62均高表达。树突状细胞可以随着时间的推移逐渐从未成熟状态变为成熟状态，未成熟树突状细胞在经过1.0 μg/mL脂多糖刺激后可以变为成熟树突状细胞；成熟树突状细胞作为主要抗原提呈细胞，通过刺激分泌出不同的细胞因子，并通过Th1或Th2途径使初始 T细胞分化[21-22]，从而造成炎症或免疫抑制的环境。高水平的白细胞介素12被证实可有效极化Th1细胞的产生，从而辅助诱导抗原特异性的CD8+CTL细胞生成[23-24]。因此，能够分泌高水平的白细胞介素12是树突状细胞生物活性高的标志之一[25-26]。ELISA检测发现未成熟树突状细胞高表达非炎性因子白细胞介素10、白细胞介素17A，成熟树突状细胞高表达炎性因子白细胞介素12，这与既往研究一
致[27-29]。混合淋巴细胞反应表现：未成熟树突状细胞对T淋巴细胞的增殖能力远远低于成熟树突状细胞。在未成熟树突状细胞或成熟树突状细胞数量与T淋巴细胞比值在1∶10的情况下，成熟树突状细胞对T淋巴细胞的刺激明显比未成熟树突状细胞刺激T淋巴细胞的能力强。
白细胞介素4可以促进骨髓前体细胞分化成树突状细胞，它可以诱导树突状细胞的分化和成熟，从而增加其数量，也可以调节树突状细胞的表面标记物表达，增强其在免疫调节中的功能[30-31]。粒细胞集落刺激因子可以刺激树突状细胞增殖，从而增加其数量，也可以调节树突状细胞的功能，增强其抗原呈递和T细胞激活能力，同时粒细胞集落刺激因子可以增加树突状细胞的产量，使其在细胞培养中获得更多的树突状细胞[32]。
该实验的不足之处就是在采用白细胞介素4、粒细胞集落刺激因子诱导Lewis大鼠骨髓前体细胞得到的未成熟树突状细胞表面标志物阳性率低于90%，这虽然会给后续的部分实验带来困难，但对整体的实验进程影响不是太大，随着课题组成员提取树突状细胞的技术不断完善，其表面分子标志物的阳性率也会更高。课题组在选用白细胞介素4、粒细胞集落刺激因子提取树突状细胞之前曾使用磁珠分选提取树突状细胞。但磁珠分选也有一定的不足之处，磁珠分选可能使目标细胞在处理过程中受到机械损伤或应激反应，这可能导致树突状细胞的活性、功能和免疫学特性的改变，影响进一步的实验研究。磁珠分选通常需要特异的抗体或分选靶点，以实现对特定细胞类型的选择。然而，特异性的抗体并不完美，可能会出现交叉反应或非特异性结合，从而干扰分选的准确性。磁珠分选技术通常需要昂贵的试剂和设备，并且操作复杂，这增加了实验的成本和难度。白细胞介素4和粒细胞集落刺激因子虽说可以降低整个实验的成本，但随着成本的降低，实验的步骤逐渐繁琐，这同样也给实验带来困难。
综上所述，该实验可得知Lewis骨髓前体细胞提取出的树突状细胞为未成熟状态，随着时间的不断延长，未成熟树突状细胞也在不断向着成熟的状态发展，这可能与体内复杂的微环境有关。Lewis大鼠骨髓前体细胞经过粒细胞集落刺激因子和白细胞介素4刺激后变为未成熟树突状细胞，脂多糖刺激后未成熟树突状细胞逐渐转变成成熟树突状细胞，并通过普通倒置显微镜、流式细胞鉴定、白细胞介素10、白细胞介素12、白细胞介素17A相关因子检测来对未成熟树突状细胞和成熟树突状细胞进行区别。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Lewis大鼠骨髓来源成熟和未成熟树突状细胞的提取与鉴别

Extraction and differentiation of mature and immature dendritic cells from Lewis rat bone marrow

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