Cx43、β-catenin、Smo在第二生心区的表达规律及意义

doi:10.12307/2024.143

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (19): 3042-3048.doi: 10.12307/2024.143

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Cx43、β-catenin、Smo在第二生心区的表达规律及意义

丁泽原，闫玉楠，谢建山，师亮，景雅，杨艳萍

山西医科大学组织胚胎学教研室，山西省太原市 030001

收稿日期:2023-03-09 接受日期:2023-04-26 出版日期:2024-07-08 发布日期:2023-09-26
通讯作者: 杨艳萍，博士，教授，山西医科大学组织胚胎学教研室，山西省太原市 030001
作者简介:丁泽原，男，1998年生，山西省忻州市人，汉族，山西医科大学在读硕士。
基金资助:
国家自然科学基金(31200899)，项目负责人：杨艳萍；山西省科技厅应用基础研究计划面上项目(202203021211247)，项目负责人：师亮

Expression pattern and signification of Cx43, beta-catenin and Smo in the second heart field

Ding Zeyuan, Yan Yunan, Xie Jianshan, Shi Liang, Jing Ya, Yang Yanping

Department of Histology and Embryology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China

Received:2023-03-09 Accepted:2023-04-26 Online:2024-07-08 Published:2023-09-26
Contact: Yang Yanping, PhD, Professor, Department of Histology and Embryology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
About author:Ding Zeyuan, Master candidate, Department of Histology and Embryology, Shanxi Medical University, Taiyuan 030001, Shanxi Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 31200899 (to YYP); General Project of Applied Basic Research Program of Shanxi Provincial Department of Science and Technology, No. 202203021211247 (to SL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

第二生心区：由咽前间充质、心包腔背侧壁的脏壁中胚层等构成。第二生心区的前体细胞可分化为心肌细胞，不断添加至心管的动脉端和静脉端，形成流出道、右心室和大部分心房。第二生心区发育异常导致心管缩短和动脉干畸形等。
连接蛋白43：是哺乳动物心脏中构成缝隙连接最主要的连接蛋白。在心电传导、流出道发育和调节心脏神经嵴细胞迁移行为中起着重要作用。

背景：第二生心区对于胚胎心脏发育具有重要意义，其发育异常会导致多种心脏畸形，Cx43基因敲除后第二生心区细胞的形成和增殖减少，但具体原因尚未明确。

目的：①明确β-catenin、Smo以及Cx43在内胚层与第二生心区的表达模式，观察其有无共表达；②探究Cx43与Wnt/β-catenin通路或Shh通路之间是否存在相互作用，共同参与第二生心区的发育。
方法：选取胚龄10-12 d的ICR小鼠胚胎石蜡包埋连续切片，进行免疫组织化学染色、苏木精-伊红染色、免疫荧光染色；剥离胚龄11 d小鼠胚胎的原始消化管用于蛋白印迹实验和免疫共沉淀。

结果与结论：①胚龄10-12 d，Cx43与Isl1在前肠腹侧和心包腔背侧壁的部分间充质细胞呈共表达，Isl1阳性细胞增多的同时Cx43阳性细胞也增多；②胚龄10-12 d，Cx43与β-catenin在内胚层腹侧共表达；③胚龄10-12 d，Cx43与Smo在内胚层上共表达；④免疫共沉淀结果表明Cx43与β-catenin之间存在相互作用，共同参与第二生心区的发育。

https://orcid.org/0009-0003-3824-9573 (丁泽原)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 小鼠胚胎, 第二生心区, 流出道, Wnt/β-catenin通路, Shh通路, Cx43, 免疫共沉淀

Abstract: BACKGROUND: The second heart field is crucial for the development of the embryonic heart. Abnormal development of the second heart field can result in multiple cardiac malformations. After Cx43 gene knockout, reduced formation and proliferation of cells of the second heart field can be observed, but the specific reason remains unclear.
OBJECTIVE: (1) To determine whether β-catenin, Smo and Cx43 were co-expressed in the second heart field and the endoderm, we observed the expression patterns of these proteins. (2) To explore whether Cx43 interacts with the Wnt/β-catenin pathway or the Shh pathway in the development of the second heart field.
METHODS: Serial paraffin sections of the mouse embryos at embryonic days 10-12 were selected for immunohistochemical staining, hematoxylin-eosin staining and immunofluorescence staining. The primitive gut of mouse embryos at embryonic day 11 was separated for western blot assay and co-immunoprecipitation.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Cx43 and Isl1 were co-expressed in some mesenchymal cells on the ventral side of the foregut and dorsal wall of the pericardial cavity of mouse embryos at embryonic days 10-12; Isl1 positive cells increased while Cx43 positive cells increased. (2) Cx43 and β-catenin were co-expressed in the ventral part of the endoderm at embryonic days 10-12. (3) Cx43 and Smo were co-expressed in the endoderm at embryonic days 10-12. (4) The co-immunoprecipitation results confirmed that there was an interaction between Cx43 and β-catenin, which suggested that Cx43 interacted with β-catenin to participate in the development of the second heart field.

Key words: mouse embryo, second heart field, outflow tract, Wnt/β-catenin pathway, Shh pathway, Cx43, co-immunoprecipitation

中图分类号:

丁泽原, 闫玉楠, 谢建山, 师亮, 景雅, 杨艳萍. Cx43、β-catenin、Smo在第二生心区的表达规律及意义[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(19): 3042-3048.

Ding Zeyuan, Yan Yunan, Xie Jianshan, Shi Liang, Jing Ya, Yang Yanping. Expression pattern and signification of Cx43, beta-catenin and Smo in the second heart field[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(19): 3042-3048.

图/表（结果） 6

2.1 Cx43、Wnt/β-catenin通路与Shh通路组分的表达胚龄10 d，心管已成襻，从动脉端至静脉端，依次可见动脉囊、流出道、心室、心房与静脉窦。心管背侧的前肠壁由内胚层细胞构成。前肠的头端即原始咽横断面呈扁椭圆形，其背侧壁细胞呈单层扁平状，而腹侧的细胞为单层立方或柱状，尤其在腹侧正中，细胞形态由单层变为多层，呈Isl1阳性，局部基膜消失，内胚层腹侧可观察到少量散在分布的间充质细胞，见图1A-C，部分细胞呈Isl1阳性，见图1D。向心脏静脉端移行，前肠横断面呈管状，其腹侧部内胚层细胞表达Isl1，内胚层的腹侧Isl1阳性间充质细胞数量增加，见图1E。此外，Isl1表达也见于鳃弓核心间充质、心包腔背侧壁，见图1F，说明此期第二生心区由心包腔背侧壁脏壁中胚层、鳃弓核心间充质、前肠腹侧间充质细胞构成。β-catenin在前肠内胚层广泛表达，见图1G，H，其下游信号Lef1在前肠内胚层细胞染色呈阴性。Shh信号通路的受体Smo在咽内胚层的表达局限于两侧，见图1I。随着向前肠尾端移行，在前肠腹侧Isl1阳性间充质细胞丰富的区域，相邻的内胚层呈现明显的Smo表达，见图1J。Cx43在前肠内胚层的表达模式与Smo相似，在前肠头端的内胚层表达较弱，见图1K，至前肠尾端，Cx43在内胚层的表达变得明显，见图1L。在心管动脉端，心包腔背侧壁脏壁中胚层的Isl1表达延续至与之相连的流出道远端壁，MHC在Isl1阳性的流出道远端壁呈弱阳性表达，见图1C，M。在心管静脉端，Isl1阳性间充质细胞延续至心背系膜及与之相连的心房壁，见图1E，MHC在心房壁的Isl1阳性区尚未表达，见图1E，N。说明Isl1阳性细胞向心管动脉端和静脉端添加，并分化为心肌细胞。

胚龄10.5 d，前肠头端向尾端移行，其腹侧间充质内Isl1阳性细胞与胚龄10 d相比数量增加，见图2A，B，尤其是前肠中段腹侧，Isl1阳性细胞已聚集形成锥形结构，见图2B。前肠尾端已分隔形成食管与气管，Isl1阳性锥形区位于气管两侧与腹侧，Isl1阳性细胞延续至心包腔背侧壁、心背系膜，形成心背侧间充质突，见图2C。课题组前期结果提示这些内胚层细胞通过上皮-间充质转化形成第二生心区前体细胞[21]。实验观察到在Isl1阳性间充质细胞急剧增加的同时，前肠中段内胚层腹侧正中的细胞基底面的基膜消失，内胚层细胞与相邻的间充质细胞失去界限，见图2D，并表达Isl1，见图2B，说明前肠内胚层细胞通过上皮-间充质转化使第二生心区前体细胞数量增加。相邻切片染色显示β-catenin仍在前肠内胚层广泛表达，见图2E，F。在前肠腹侧部内胚层细胞出现上皮-间充质转化的部位未见Lef1阳性表达，在第二生心区偶见数个Lef1阳性细胞，见图2G。Smo、Cx43在前肠头端的表达情况与胚龄10 d相似；而在与Isl1阳性锥形区相邻的前肠中段内胚层Smo、Cx43的表达明显增强，且较胚龄10 d增强，见图2H，I。同时β-catenin、Cx43阳性表达也见于前肠腹侧的Isl1阳性间充质区，见图2F，I。

胚龄11 d，前肠腹侧的锥形结构由尾端扩展至头端，因此在咽腹侧Isl1阳性细胞明显增加，形成锥形间充质区，其尖端的细胞延续至流出道非心肌部的管壁，见图3A，B，提示Isl1阳性细胞仍然贡献于流出道，促进其发育。相邻的前肠内胚层腹侧部向间充质内延伸形成Isl1阳性细胞索，该细胞索腹侧的上皮细胞失去基膜，排列不规则，细胞分散，细胞间隙明显，呈现间充质细胞样形态，与周围阳性间充质细胞无明确界限，即前肠腹侧部内胚层细胞仍在进行上皮-间充质转化形成Isl1阳性间充质细胞，见图3B，C。在腔静脉水平，气管内胚层细胞呈单层柱状，基膜完整，Isl1阳性间充质细胞聚集于气管腹侧，其数量明显少于咽腹侧Isl1阳性细胞。该部位未见到Isl1阳性细胞向心脏静脉端的延伸，见图3D。β-catenin表达仍遍布前肠内胚层，包括其腹侧的细胞索，见图3E。Lef1在前肠内胚层以及第二生心区阳性细胞分布的区域表达情况与胚龄10.5 d相似。随着Isl1阳性锥形区向前肠头端的扩展，Smo与Cx43在内胚层的表达也向头端扩展，包括前肠头端的内胚层腹侧部以及延伸的细胞索，见图3F，G。免疫荧光双染结果证实前肠内胚层的部分Cx43阳性细胞共表达Smo或β-catenin，见图3H，I。此外，前肠腹侧第二生心区内部分Isl1阳性细胞同时表达Cx43，见图3J。

胚龄12 d，主肺动脉隔将流出道非心肌部分隔为心包内升主动脉和肺动脉干，其背侧的前肠已经分隔为食管和气管，见图4A，B。此期气管壁内胚层细胞基膜完整，不再能观察到上皮-间充质转化，见图4B。气管腹侧Isl1阳性锥形区明显减小，其顶端的Isl1阳性细胞延续至主动脉和肺动脉干管壁，见图4A。Cx43的阳性表达仍见于气管内胚层及其腹侧的第二生心区内，见图4C。β-catenin表达部位与Cx43相似，与胚龄11 d相比，较多β-catenin阳性细胞共表达Cx43，见图4C。Smo表达主要在内胚层，少量Smo阳性细胞共表达Cx43，见图4D。在心房水平，气管延续为两侧肺芽，其内胚层未见Isl1表达，肺芽两侧与腹侧的间充质内仍有Isl1阳性细胞聚集，但不再向心脏内延续，见图4E。Cx43的阳性表达主要局限于肺芽内胚层细胞，在细胞膜呈弥散表达，见图4F。

2.2 Cx43与Wnt/β-catenin通路、Shh通路的相互作用免疫组化与免疫荧光染色结果显示与第二生心区间充质直接相邻的前肠内胚层腹侧部同时表达Isl1、Cx43、Smo与β-catenin。已有研究揭示前肠腹侧部的内胚层细胞上皮-间充质转化参与第二生心区的形成，而Wnt/β-catenin通路、Shh通路调控第二生心区细胞的增殖，Cx43基因敲除后第二生心区细胞减少[4-5，9-10，22]。因此，该实验拟用免疫共沉淀探究Cx43与Wnt/β-catenin通路、Shh通路之间是否存在相互作用，共同参与第二生心区的发育。首先选取胚龄11 d小鼠胚胎，剥离原始消化管，见图5A；然后进行Western blot检测，样本中内胚层特异性标记物FOXA2表达量很高，证明所取组织无误。同时可观察到Cx43、β-catenin、Smo均有较高的表达量，见图5B，可以进行下一步实验。
免疫共沉淀结果显示，Input组Cx43、β-catenin、Smo 3个蛋白均有表达，IP组Cx43可将原始消化管组织中的β-catenin沉淀下来，且Cx43的表达量明显高于Input组，见图5C，说明ProteinG磁珠起到了富集作用，β-catenin的表达量高于IgG组，说明Cx43特异性结合β-catenin，起到了沉淀的作用，而Smo未被沉淀下来。而阴性对照IgG组Cx43只沉淀下少量β-catenin和Smo，说明Cx43与β-catenin之间存在相互作用，与Smo无相互作用。

2.3 前肠内胚层腹侧部Cx43、β-catenin、Smo与咽前间充质Isl1变化规律一致对胚龄10-12 d小鼠胚胎咽腹侧间充质内Isl1阳性细胞以及前肠内胚层腹侧部Cx43、β-catenin、Smo进行计数，统计学分析显示，胚龄10-11d，咽腹侧间充质Isl1阳性细胞数量均不断增加，前肠内胚层腹侧部Cx43、β-catenin、Smo阳性细胞也显著增加(P < 0.01)，胚龄12 d，Isl1阳性细胞延伸至主动脉与肺动脉干管壁，气管腹侧的Isl1细胞减少，Cx43、β-catenin、Smo在气管腹侧的阳性细胞也减少，即前肠内胚层腹侧部Cx43、β-catenin、Smo与咽前间充质Isl1变化规律一致。见图6。

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引言

第二生心区(second heart filed，SHF)是心管成襻过程中，分布于心包腔背侧脏壁中胚层和咽腹侧间充质等区域的前体细胞群，具有持续增殖和分化的特征。第二生心区的前体细胞可分化为心肌细胞，不断添加至心管的静脉端和动脉端，使心管增长。在动脉端，第二生心区形成流出道与右心室[1-2]。在流出道分隔后，第二生心区的前体细胞还可分化为心包内主动脉、肺动脉干管壁的平滑肌[1]。转录因子ISL LIM Homeobox 1(islet1，Isl1)表达于第二生心区内增生但尚未分化的前体细胞，可作为第二生心区细胞的标记蛋白[2]。研究证实第二生心区参与胚胎心脏发育过程中多种信号通路调控前体细胞的形成、增殖与分化，主要包括Wnt、BMP与Shh[3-4]。Wnt/β-catenin通路由分泌蛋白Wnt家族、跨膜受体Frizzled家族、酪蛋白激酶1(casein kinase 1，CK1)、接受上游信号的核心蛋白DVL(Dishevelled)、糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK3β)、肿瘤抑制蛋白APC、支架蛋白Axin、核心成分β-catenin以及转录因子TCF/LEF家族组成，调控干细胞的多向分化、器官的发育和再生。β-catenin是Wnt/β-catenin通路的核心成分，在促进第二生心区细胞增殖过程中起着重要的上游调控作用[5]。小鼠胚胎活化Wnt/β-catenin可通过作用于成纤维细胞生长因子增加咽腹侧间充质内第二生心区细胞数量[6-7]。Sonic hedgehog(Shh)信号通路是由Shh配体蛋白介导的高度保守的信号传导通路，主要由Shh配体、跨膜蛋白受体复合物Patched(Ptch)与Smoothened(Smo)、核转录因子Gli蛋白及其下游靶基因组成[8]，表达于咽内胚层的Shh通过其受体Patched(Ptch)与Smoothened(Smo)及下游信号促进第二生心区前体细胞保持增殖能力[9-13]。因此，Wnt/β-catenin通路和Shh通路通过作用于Isl1等信号，调控第二生心区前体细胞的增殖、存活、部署与分化[4]，另一方面，β-catenin可通过调节前肠内胚层的Shh，参与第二生心区的发育[14]。
连接蛋白43(connexin43，Cx43)是哺乳动物心脏中构成缝隙连接最主要的连接蛋白[15]。Cx43基因敲除小鼠表现为心脏成襻延迟[16]、右心室小梁过度增生、流出道梗阻、主动脉弓离断等[16-17]。课题组前期研究发现Cx43在咽内胚层以及与之相邻的咽腹侧间充质呈阳性表达。Cx43基因敲除后第二生心区细胞数量有所减少，且Isl1阳性第二生心区细胞向胚胎心脏的迁移减少，推测Cx43可能影响第二生心区前体细胞的形成与增殖。而Wnt/β-catenin通路和Shh通路对第二生心区前体细胞的增殖、存活、部署起作用，同时其他学者也证实Cx43与Tbx3、Wnt等信号分子相互作用[18-20]。该实验通过免疫组化、免疫共沉淀等方法观察胚龄10-12 d小鼠胚胎Cx43、β-catenin、Smo在第二生心区的表达规律，探究此3种蛋白是否相互作用，共同参与第二生心区的发育。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学体外实验。
1.2 时间及地点实验于2021年5月至2022年12月在山西医科大学组织胚胎学实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 2月龄SPF级健康ICR雌鼠30只，雄鼠10只，体质量24-32 g，均来自山西医科大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(晋)2019-0004。实验方案经山西医科大学动物实验中心伦理委员会批准，使用许可号：SYXK(晋)2019-0007。
1.3.2 主要试剂鼠源Cx43抗体(SC-271837)、鼠源β-catenin抗体(SC-7963)、鼠源Smo抗体(SC-166685)均购自Santa Cruz公司；兔源β-catenin抗体(D10A8)、兔源淋巴增强结合因子1(lymphoid enhancer-binding factor 1，Lef1)抗体(C12A5)均购自Cell signal公司；兔源Smo抗体(20708-1-AP)购自Proteintech公司；鼠源Isl1抗体(39.4D5-C)购自DSHB公司；兔源Isl1抗体(A5245)购自Abclonal公司；小鼠抗心肌肌球蛋白重链(myosin heavy chain，MHC)抗体(05-716)购自Upstate公司；正常小鼠对照IgG(bs-0296-PC)购自Bioss公司；HRP标记的山羊抗小鼠IgG(GB23301)、HRP标记的山羊抗兔IgG(GB23303)、山羊抗小鼠IgG-FITC(GB22401)、鼠源β-actin(GB-12001)、RIPA组织裂解液均购自Servicebio公司；山羊抗兔IgG-Cy3(BA1032)、兔源FOXA2抗体(A01032-2)、DAPI染色液、即用型SABC-POD山羊抗小鼠IgG(SA1021)、即用型SABC-POD山羊抗兔IgG(SA1022)均购自武汉博士德生物工程有限公司；蛋白酶抑制剂、ECL免疫印迹检测试剂购自Seven公司；聚偏二氟乙烯膜购自Millipore公司；ProteinG MagBeads购自GenScript公司。
1.4 实验方法
1.4.1 标本制作 2月龄健康ICR小鼠，发情期于每日晚18点以雌雄3∶1的比例进行合笼，次日6点发现阴栓者记为妊娠0.5 d，胚龄10 d，10.5 d，11 d，12 d的胚胎各取6只，胚胎经过甲醇-丙酮固定液固定，梯度乙醇脱水，正丁醇透明，石蜡包埋，使用切片机(德国Leica，RM2235)制作7 μm厚连续切片，进行免疫组织化学染色、免疫荧光染色、苏木精-伊红染色。剩余雌鼠均取胚龄11 d的胚胎进行蛋白印迹和免疫共沉淀检测。
1.4.2 免疫组织化学染色选用SABC法染色。石蜡切片经过二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、蒸馏水水化、体积分数3%过氧化氢处理30 min、TENG-T封闭1 h后，加入鼠源Isl1抗体(1∶50)、鼠源MHC抗体(1∶500)、鼠源Cx43抗体(1∶50)、鼠源β-catenin抗体(1∶50)、兔源Lef1抗体(1∶100)和兔源Smo抗体(1∶75)，4 ℃孵育过夜，分别滴加即用型SABC-POD山羊抗小鼠IgG和即用型SABC-POD山羊抗兔IgG，37 ℃孵育30 min，SABC试剂常温下孵育30 min，DAB显色，常规脱水，透明，中性树胶封固，最后用显微镜观察，DP74成像系统拍照。
1.4.3 免疫荧光双染石蜡切片经过二甲苯脱蜡、梯度乙醇脱水、蒸馏水水化、TENG-T封闭处理，特异标记兔源Isl1抗体(1∶50)和鼠源Cx43单克隆抗体(1∶50)混合，兔源β-catenin抗体(1∶50)和鼠源Cx43单克隆抗体(1∶50)混合，兔源Smo抗体(1∶50)和鼠源Cx43单克隆抗体(1∶50)混合，4 ℃孵育过夜，双染二抗分别为羊抗小鼠IgG-FITC(1∶150)和羊抗兔IgG-Cy3(1∶100)混合液，37 ℃孵育1 h，DAPI室温下核复染5 min，甘油缓冲液封固，全自动扫描显微镜及照相系统照像(日本Olympus，BX53)，Image J软件将同一位置所摄2张双染抗体图片以及DIC图片进行合成，镜下观察细胞分布规律。
1.4.4 免疫共沉淀孕11 d小鼠脱颈处死后，迅速取出胚胎并在体视显微镜(日本Olympus，SZX16)下剥离原始消化管，将40个胚龄11 d小鼠胚胎的原始消化管组织放入200 μL预冷的RIPA组织裂解液(使用前加入2 μL蛋白酶抑制剂)于冰上使用玻璃匀浆器研磨至无明显组织块，转移至4 ℃垂直混悬仪(宁波新芝生物科技股份有限公司，HS-3)中继续裂解30 min；4 ℃、12 000×g离心20 min，弃沉淀取上清，测定蛋白浓度后从上清中取出5 μL标记为Input组，Input组上样时使用常规上样量50 μg。将剩余的上清转移至50 μL预处理后的proteinG磁珠中，磁珠用500 μL预冷的洗涤液(20 mmol/L Na2HPO4、0.15 mol/L NaCl、pH 7.0)清洗，在磁力架上静置2 min后弃上清，重复3次，4 ℃摇床孵育4 h，以去除磁珠的非特异性结合，弃去磁珠，保留所得上清，在2份新的预处理过的50 μL proteinG磁珠中分别加入1 μg纯化后的Cx43抗体作为IP组以及1 μg正常鼠IgG抗体作为IgG组，4 ℃垂直混悬仪结合过夜，磁力架上吸附后弃去上清，保留磁珠。将之前所得的蛋白上清分别加入IP组与IgG组的2份磁珠中，4 ℃垂直混悬仪结合过夜，去上清，洗涤液洗磁珠5次，用2×上样缓冲液重悬磁珠，煮样，磁力架上吸附后弃沉淀保留上清，进行免疫印迹检测，IP组与IgG组全部上样。
1.4.5 蛋白印迹检测在提取出的15个胚龄11 d小鼠的原始消化管中加入100 μL RIPA裂解液，使用前加入1 μL蛋白酶抑制剂，冰上使用玻璃匀浆器研磨至无明显组织块，转移至4 ℃垂直混悬仪中继续裂解30 min；充分裂解后离心机(德国Eppendprf公司，5430R)以4 ℃、12 000×g的条件离心20 min，弃沉淀取上清，用1×上样缓冲液煮样，电泳仪(美国Bio-Rad公司，043BR29921)进行10% SDS-PAGE电泳，转膜1 h，脱脂奶粉封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜(Cx43，1∶200；β-catenin，1∶500；Smo，1∶1 000；FOXA2，1∶1 000；β-actin，1∶2 000)，二抗山羊抗兔(1∶2 000)、山羊抗鼠(1∶2 000)室温孵育2 h，ECL发光，ChemiDoc成像仪(美国Bio-Rad公司)曝光观察。
1.4.6 阳性细胞计数胚龄10-12 d胚胎12个(每一胚龄胚胎3个)，每例胚胎前肠内胚层腹侧部与咽腹侧间充质区域免疫组织化学染色后的切片每3片选1片，共选3片，于高倍镜下对该区域进行摄片；再用ImageJ软件分别对每张图片中咽腹侧间充质的Isl1阳性细胞进行计数，对前肠内胚层腹侧部的Cx43、β-catenin、Smo阳性细胞进行计数；每一例胚胎的3片计数结果取均值作为该胚胎的阳性细胞数。
1.5 主要观察指标胚龄10-12 d的小鼠胚胎Cx43、β-catenin、Smo表达情况及其互作情况。
1.6 统计学分析实验数据用x±s表示，进行单因素方差分析(SPSS 16.0统计软件)，P < 0.01为差异有显著性意义。

讨论

3.1 Cx43、Wnt/β-catenin通路、Shh通路均参与第二生心区发育研究证实小鼠胚胎第二生心区细胞分布于鳃弓核心间充质、心包腔背侧壁脏壁中胚层与前肠腹侧间充质[1]。该实验结果也显示在胚龄10 d，小鼠胚胎第二生心区细胞除了分布于鳃弓核心间充质与心包腔背侧壁脏壁中胚层外，前肠腹侧也开始出现Isl1阳性的第二生心区细胞。从心脏动脉端向静脉端移行，前肠腹侧的Isl1阳性细胞明显增多。胚龄10.5-11 d，前肠腹侧Isl1阳性间充质细胞聚集形成的锥形结构首先出现于前肠尾端，并逐渐向头端扩展。同时可见相邻的前肠内胚层腹侧部细胞延伸出上皮细胞索通过上皮-间充质转化形成Isl1阳性的间充质细胞，参与Isl1阳性锥形区的形成。Isl1阳性锥形区的细胞延伸至胚胎心脏动脉端与静脉端，参与流出道与心背侧间充质突的形成；当Isl1阳性细胞不再向胚胎心脏迁移时，该细胞主要聚集于气管与肺芽的内胚层周围，参与呼吸系统的发育[20]。需要注意的是，除内胚层细胞分化外，前肠内胚层还可通过释放信号调控其腹侧第二生心区的发育[21-22]，因此，前肠内胚层对第二生心区发育具有重要意义。
Cx43是构成缝隙连接最主要的连接蛋白。实验结果显示在气管形成后其内胚层细胞整齐排列，Cx43弥散表达于细胞膜，参与构成缝隙连接。此外，作者观察到前肠内胚层腹侧部细胞进行上皮-间充质转化时，细胞之间排列不再紧密，Cx43呈斑点状表达，同时前肠腹侧的Isl1阳性细胞丰富的区域也可见Cx43的散在表达。有学者证实迁移的神经嵴细胞表达Cx43，有助于保持细胞的定向运动[23]。间充质干细胞进行成脂分化时Cx43表达上调，其意义在于保证该细胞的分化能力[24]。由此推测在内胚层细胞进行上皮-间充质转化参与第二生心区形成时表达Cx43的意义在于有助于内胚层细胞的分化与迁移。此外，该实验观察到Smo在前肠内胚层的表达模式与Cx43相似，β-catenin的表达遍布前肠内胚层。此3种蛋白在Isl1阳性锥形区形成时相邻的前肠内胚层的表达模式说明Cx43与β-catenin、Smo与第二生心区的形成密切相关。课题组前期实验观察到Cx43基因敲除后小鼠胚胎心脏表现为前肠腹侧第二生心区的Isl1阳性细胞数量减少，右心室和流出道发育畸形[22]。而Wnt/β-catenin通路、Shh通路均作用于第二生心区前体细胞的增殖、存活、部
署[6-9，25-26]。因此该实验通过研究Cx43与这2条通路的相互作用情况去进一步明确Cx43如何参与第二生心区发育。
3.2 Cx43与β-catenin存在相互作用 β-catenin是Wnt/β-catenin通路的核心成分，可直接活化Isl1[27]。β-catenin基因突变，胚胎的咽内胚层、第二生心区、流出道的细胞增生减少[27]。
条件性敲除小鼠胚胎内胚层β-catenin，心脏前体细胞迁移异常[28-29]。这些研究表明内胚层与第二生心区的β-catenin参与调控胚胎心脏前体细胞的发生与增殖。实验观察到Cx43与Isl1或与β-catenin在前肠内胚层腹侧部细胞和第二生心区间充质细胞存在共表达，免疫共沉淀结果证实Cx43与β-catenin之间存在相互作用，说明Cx43与β-catenin相互作用共同参与前肠内胚层细胞的上皮-间充质转化以及第二生心区细胞的形成。Wnt/β-catenin通路的核心组分β-catenin进入细胞核后结合LEF/TCF转录因子家族，启动下游靶基因的转录[7]。
但实验观察到在内胚层细胞进行上皮-间充质转化、前肠腹侧第二生心区细胞急剧增加时Lef1未见明显表达，说明β-catenin并未通过Lef1发挥调控作用。其他研究也证实β-catenin是多功能蛋白，其活动依赖于细胞内定位。细胞膜相关的β-catenin作为锚定连接的组分，与Cx43共定位在细胞膜，二者相互作用，Cx43可能负调控自身基因以及其他β-catenin/Tcf依赖的信号转录。但不确定是二者直接作用还是通过其他细胞连接构成组分相互作用[19]。
3.3 Cx43与Smo无相互作用受体Smo是Shh信号通路的构成组分[9，30]。条件性敲除第二生心区的Smo基因，小鼠胚胎表现有弓动脉发育不良与流出道畸形[31]。有研究显示在前肠内胚层腹侧，Smo阳性细胞排列紧密，阳性较强[32]。该实验也观察到在前肠腹侧Isl1阳性锥形区形成过程中，Smo在相邻内胚层呈阳性表达，与ZHANG等[32]的结果一致。同时在Smo阳性表达部位也可见Cx43阳性表达，但免疫共沉淀结果显示Cx43与Smo无相互作用，因此Cx43是否与Shh通路的其他组分相互作用，或Cx43并未通过与Shh通路相互作用来参与第二生心区的发育，都需要在后续的研究中进一步明确。
3.4 小结已有研究证实Cx43基因敲除后Isl1阳性第二生心区细胞数量减少以及向胚胎心脏的迁移减少，推测Cx43与第二生心区前体细胞的形成与增殖有关，但其具体机制仍不明确。Wnt/β-catenin通路和Shh通路对第二生心区前体细胞的增殖、存活、部署起作用，该实验通过观察第二生心区发育过程中Cx43、β-catenin、Smo的表达模式及互作情况，证实了三者共同参与第二生心区发育，但在此过程中，Cx43与β-catenin存在相互作用，但Cx43与Smo无相互作用。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Cx43、β-catenin、Smo在第二生心区的表达规律及意义

Expression pattern and signification of Cx43, beta-catenin and Smo in the second heart field

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