柚皮苷调控成骨细胞成骨分化的机制

doi:10.12307/2022.1021

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (11): 1722-1727.doi: 10.12307/2022.1021

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柚皮苷调控成骨细胞成骨分化的机制

吴晶晶1，林海雄2，3，孙伟鹏1，李紫阁1，姜自伟4

1广州中医药大学第一临床医学院，广东省广州市 510405；2宁夏回族自治区中医医院暨中医研究所，宁夏回族自治区银川市 750000；3香港中文大学组织工程与再生医学研究所，香港特别行政区 999077；4广州中医药大学第一附属医院，广东省广州市 510405

收稿日期:2021-11-08 接受日期:2022-02-24 出版日期:2023-04-18 发布日期:2022-09-24
通讯作者: 姜自伟，博士，教授，副主任医师，广州中医药大学第一附属医院，广东省广州市 510405
作者简介:吴晶晶，女，1994年生，四川省资中县人，汉族，广州中医药大学在读硕士，主要从事中医药治疗骨与关节损伤的研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81774337)，项目负责人：姜自伟

Mechanism by which naringin regulates osteogenic differentiation in osteoblasts

Wu Jingjing1, Lin Haixiong2,3, Sun Weipeng1, Li Zige1, Jiang Ziwei4

1The First Clinical Medical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405; 2Ningxia Chinese Medicine Research Center, Yinchuan 750000; 3Institute of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, The Chinese University of Hong Kong, Sha Tin 999077, Hong Kong Special Administrative Region, China; 4The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405

Received:2021-11-08 Accepted:2022-02-24 Online:2023-04-18 Published:2022-09-24
Contact: Jiang Ziwei, MD, Professor, Associate chief physician, The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
About author:Wu Jingjing, Master candidate, The First Clinical Medical College of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81774337 (to JZW)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
柚皮苷：是一种由葡萄糖、鼠李糖等构成的天然黄酮化合物。作为骨碎补总黄酮的主要有效成分之一，在临床应用时，柚皮苷对促进骨折愈合、抗骨质疏松、抗炎、抗氧化应激等具有良好的疗效。
MiR-206：作为在生物体中广泛存在的一类小分子单链编码RNA，microRNAs已被公认与细胞的增殖、分化和凋亡等过程密切相关，也在骨组织生长、发育、重塑的过程中发挥着重要作用。其中miR-206最早在骨骼肌细胞中被发现，而后发现成骨细胞也能表达miR-206，进一步研究发现miR-206与骨损伤修复密切相关。

背景：研究发现，柚皮苷主要通过Wnt、转化生长因子β、MAPK信号通路、破骨细胞信号通路等直接影响骨代谢，通过P13K-Akt、血管内皮生长因子信号通路等间接调节骨代谢，具有促进骨损伤修复、减缓骨质疏松的作用。
目的：探讨柚皮苷通过下调miR-206表达靶向激活缝隙连接蛋白43/ERK1信号通路对成骨细胞增殖和成骨分化的影响。
方法：将大鼠成骨细胞(ROB细胞)经不同质量浓度柚皮苷(1，10，100 mg/L及1，10 g/L)处理培养，并进行CCK-8实验检测细胞增殖情况，筛选出柚皮苷质量浓度100 mg/L及1，10 g/L用于后续实验，并以未给药培养做对照组。RT-qPCR检测ROB细胞中miR-206、缝隙连接蛋白43 及ERK1 mRNA相对表达水平，验证其靶向关系；Western blot检测ROB细胞中ERK1/2、P-ERK蛋白的表达水平；碱性磷酸酶染色及茜素红染色观察ROB细胞内碱性磷酸酶活性及细胞钙化能力。
结果与结论：①柚皮苷能显著促进ROB细胞的增殖活性(P < 0.05)，柚皮苷在一定质量浓度范围内，随着给药浓度升高，ROB细胞吸光度值和相对增殖率均相应升高，在质量浓度为1 g/L时细胞增殖活性最强；②柚皮苷能显著抑制ROB细胞内miR-206 mRNA的表达并靶向促进成骨分化指标缝隙连接蛋白43 mRNA及ERK1/2、P-ERK蛋白的表达(P < 0.05)；③碱性磷酸酶染色及茜素红染色结果提示柚皮苷能显著促进ROB细胞内碱性磷酸酶活性和表达以及细胞钙化能力水平(P < 0.05)，其中1 g/L质量浓度处理的效果最佳；④柚皮苷通过下调miR-206表达，靶向激活缝隙连接蛋白43/ERK1信号通路，进而促进ROB细胞增殖活性及成骨分化能力。

https://orcid.org/0000-0002-4883-7331(吴晶晶)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 柚皮苷, miR-206, Cx43, ERK1, 成骨细胞, 骨损伤, 骨碎补, miRNAs

Abstract: BACKGROUND: Studies have found that naringin affects bone metabolism directly through Wnt, transforming growth factor β, MAPK signaling pathway, and osteoclast signaling pathway, as well as indirectly through P13K-Akt and vascular endothelial growth factor signaling pathway. Naringin can promote bone repair and retard osteoporosis.
OBJECTIVE: To investigate the effect of naringin on the proliferation and osteogenic differentiation of osteoblasts by targeting the activation of connexin 43/ERK1 signaling pathway through down-regulation of miR-206.
METHODS: Rat osteoblasts (ROB cells) were treated and cultured with different concentrations of naringin (1, 10, 100 mg/L and 1, 10 g/L), and the cell proliferation was detected by cell counting kit-8 assay. Naringin at 100 mg/L and 1, 10 g/L were used for subsequent experiments. Osteoblasts with non-drug culture were used as controls. RT-qPCR was used to detect the relative expression levels of miR-206, connexin 43 and ERK1 mRNAs in ROB cells to verify their targeting relationship. Western blot was used to detect the protein expression levels of ERK1/2 and P-ERK in ROB cells. Alkaline phosphatase activity and calcification ability in ROB cells were observed by alkaline phosphatase staining and alizarin red staining, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Naringin significantly promoted the proliferation activity of ROB cells (P < 0.05). The absorbance value and relative proliferation rate of ROB cells increased as the administration concentration of naringin increased in a certain range. When the mass concentration was 1 g/L, the cell proliferation activity was the strongest. Naringin significantly inhibited the expression of miR-206 mRNA in ROB cells and promoted the expression of connexin 43 mRNA and ERK1/2 and P-ERK protein (P < 0.05). Naringin could significantly promote the activity and expression of alkaline phosphatase and the level of cellular calcification in ROB cells (P < 0.05). Moreover, naringin at 1 g/L showed the best effect. To conclude, naringin can target and activate the connexin 43/ERK1 signaling pathway by down-regulating the expression of miR-206, thereby promoting the proliferation and osteogenic differentiation of ROB cells.

Key words: naringin, miR-206, Cx43, ERK1, osteoblast, bone injury, drynariae, microRNAs

中图分类号:

吴晶晶, 林海雄, 孙伟鹏, 李紫阁, 姜自伟. 柚皮苷调控成骨细胞成骨分化的机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(11): 1722-1727.

Wu Jingjing, Lin Haixiong, Sun Weipeng, Li Zige, Jiang Ziwei. Mechanism by which naringin regulates osteogenic differentiation in osteoblasts[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(11): 1722-1727.

图/表（结果） 9

2.1 柚皮苷诱导ROB细胞增殖并抑制细胞凋亡在与不同质量浓度柚皮苷共同培养后，实验组ROB细胞的增殖均表现出明显的升高，与柚皮苷的给药浓度表现出明显的相关性，在一定范围内，随着柚皮苷给药浓度升高，ROB细胞A值和相对增殖率均相应升高，且在柚皮苷质量浓度为1 g/L时细胞增殖活性最强(P < 0.05)，见表2，图1，2。

2.2 柚皮苷能显著调节ROB细胞中miR-206、Cx43、ERK1的mRNA表达 RT-qPCR检测结果提示，不同质量浓度的柚皮苷与骨损伤修复相关miR-206、Cx43、ERK1的表达水平表现出明显的依赖性，见表3。MiR-206在实验组(柚皮苷质量浓度为100 mg/L及1，10 g/L)ROB细胞中的表达水平较空白对照组(柚皮苷质量浓度为0 mg/L)显著降低，其中柚皮苷质量浓度为1 g/L时，miR-206的表达水平最低(P < 0.05)，见图3。Cx43在实验组ROB细胞中的表达水平较空白对照组均升高，柚皮苷质量浓度为1 g/L时，表达水平最高(P < 0.05)。ERK1在实验组柚皮苷质量浓度为1 g/L时ROB细胞中表达水平高于空白对照组(P < 0.05)，在柚皮苷质量浓度100 mg/L和10 g/L时，表达水平均低于空白对照组，见图4。

2.3 柚皮苷能显著增高ROB细胞中ERK1/2、P-ERK的表达各组别在经不同质量浓度柚皮苷处理后，Western blot检测结果提示：不同质量浓度的柚皮苷与ERK1/2、P-ERK的表达水平表现出明显的依赖性。实验组ROB细胞内的ERK1/2、P-ERK蛋白的相对表达量均高于空白对照组，其中柚皮苷质量浓度为1 g/L时相对表达量最高，组间差异有显著性意义(P < 0.05)，见图5。

2.4 柚皮苷能显著增高ROB细胞中碱性磷酸酶的表达和钙化结节的数量经不同质量浓度柚皮苷处理后，碱性磷酸酶染色结果提示，柚皮苷能显著增高ROB细胞内碱性磷酸酶的表达和活性(P < 0.05)，见图6。茜素红染色结果提示，柚皮苷能显著提高ROB细胞内的钙盐沉积和钙化结节的数量，促进ROB细胞的钙矿化(P < 0.05)，见图7。

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引言

材料方法

1.1 设计完全随机设计分组，空白对照和条件对照，组间比较通过重复测量进行方差分析和t检验。
1.2 时间及地点实验于2021年3-6月在广州中医药大学岭南医学研究中心完成。
1.3 材料
1.3.1 药物和试剂柚皮苷(纯度≥98%，规格20 mg)。40 g/L多聚甲醛、细胞周期检测试剂盒、EdU细胞增殖检测试剂盒、Calcein-AM/PI活/死细胞染色试剂盒均购自武汉阿斯本生物技术有限公司；LightShift Chemiluminescent EMSA Kit、蛋白Marker均购自Thermo Scientific；Trizol Reagent购自InvitrogenTM；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBR Premix Ex TaqTM均购自TaKaRa；ECGS购自Sciencell；Matrigel、Transwell板(8 μm)均购自Corning；TRIpure Total RNA Extraction Reagent、EntiLinkTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit、EnTurboTM SYBR Green PCR SuperMix均购自ELK Biotechnology；RIPA总蛋白裂解液、BCA蛋白质浓度测定试剂盒、ECL化学发光检测试剂盒、显影定影液均购自ASPEN；双荧光素酶报告基因检测试剂盒均购自Beyotime。一抗(Anti-ERK1+ERK2 Mouse mAb，货号GB12087)、HRP标记山羊抗大鼠IgG(货号GB23302)均购自Servicebio。
1.3.2 细胞 ROB细胞购自Icell(货号RAT-iCell-s002)。
1.3.3 仪器 TGL-16c冷冻离心机(湖南湘仪仪器开发有限公司)；SCO6WE 恒温培养箱(SHEL LAB)；倒置显微镜、普通光学显微镜(OLYMPUS)；DR-200Bs 酶标检测仪(Diatek)；MicroPublisher成像系统(Q-IMAGING)；FACSCalibur 流式仪(BD)；PCR仪(杭州博日科技)；电泳仪、脱色摇床(北京市六一仪器厂)；扫描仪(Canon)；荧光定量PCR仪(Life technologies)。
1.4 实验方法
1.4.1 细胞培养将ROB细胞接种于含体积分数10%胎牛血清(FBS)、100 mg/L青霉素和100 mg/L链霉素的DMEM完全培养基中，置于条件为体积分数5% CO2、37 ℃的恒温培养箱中进行培养。

1.4.2 细胞分组及处理将对数生长期的ROB细胞，以1×103个/孔的密度接种于96孔板内，置于条件为体积分数5% CO2、37 ℃的恒温培养箱中培养24 h，细胞贴壁后移除培养液，实验组加入100 μL经不同质量浓度柚皮苷(1，10，100 mg/L及1，10 g/L)处理的正常培养基；对照组加入正常培养基；空白组不加入细胞培养基，均有5个复孔。收集经上述处理后的ROB细胞用于后续实验。
1.4.3 CCK-8检测细胞增殖经上述处理后的ROB细胞继续培养24 h后，将10 μL CCK-8溶液依次加入所有孔中，置于体积分数为5% CO2、37 ℃的恒温培养箱中继续孵育0.5-4 h，最后加入150 μL二甲基亚砜终止孵育。使用酶标仪依次测定所有孔在450 nm处的吸光度值(A)，并计算相对增殖率[相对增殖率%=(实验组A值-空白组A值)/空白组A值×100%]。每组实验重复3次。
1.4.4 RT-qPCR检测细胞内miR-206及Cx43、ERK1的mRNA表达经CCK-8检测筛选后，实验组选取分别用柚皮苷100 mg/L及1，10 g/L培养24 h的ROB细胞；空白对照组为未经柚皮苷处理的ROB细胞。根据Trizol试剂盒说明书，各组ROB细胞用预冷PBS洗涤后，使用Trizol溶液提取ROB细胞内的总RNA。使用EntiLinkTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，根据说明书进行反转录，合成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒，根据说明书构建PCR反应体系，在StepOneTM Real-Time PCR仪上进行检测，反应程序及参数为：预变性(95 ℃，持续1 min)，扩增循环(共进行40次，95 ℃，持续15 s，58 ℃，持续20 s，72 ℃，持续45 s)，熔解曲线(60-95 ℃，每20 s升温1 ℃)。每个样品均作3个复孔。以GAPDH及U6作为内参。数据分析方法为2-ΔΔCt法。引物序列见表1。

1.4.5 Western blot检测细胞内ERK1/2、P-ERK通路蛋白的表达经不同质量浓度柚皮苷(0，100 mg/L及1，10g/L)处理各组ROB细胞48 h后，使用RIPA裂解液提取细胞总蛋白(或核蛋白、浆蛋白)，并用BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定各组样品的蛋白质浓度。根据各组的蛋白质浓度吸取相应体积的样品，加入各孔，每孔40 μg蛋白，加入蛋白上样缓冲液(5X)，95-100 ℃沸水浴5 min，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)、过硫酸铵(TEMED)等试剂配制不同浓度(8%，10%，12%，15%，18%，20%)的分离胶及浓度为5%的浓缩胶，将各组样品加入点样孔中，进行恒压电泳后，将分离出的蛋白质裂解物转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加入封闭液(5%脱脂奶粉)室温封闭1 h，除去封闭液，加入稀释后(1∶100)的一抗(Anti-ERK1+ERK2 Mouse mAb)，在4 ℃冰箱过夜，除去一抗并使用TBST洗涤后，加入稀释后(1∶2 000)的二抗(HRP标记山羊抗大鼠IgG)，室温孵育30 min，使用TBST洗涤后，滴入新鲜配制的ECL混合溶液进行化学发光、显影定影。每组样品重复实验3次，结果在ImageJ软件网页(网址：https://cnij.imjoy.io/)上进行分析，内参蛋白为GAPDH。
1.4.6 碱性磷酸酶染色检测ROB细胞碱性磷酸酶活性吸取经不同质量浓度柚皮苷(0，100 mg/L及1，10 g/L)培养24 h后的各组细胞悬液，滴加至盖玻片上后置于培养箱培养至固着，加入2 mL细胞培养液后继续培养6 h，用PBS洗涤3次后加入40 g/L多聚甲醛固定，用PBS洗涤、蒸馏水浸洗3次，加入1 mL碱性磷酸酶孵育液置于培养箱孵育30-60 min，水洗5 min后加入硝酸钴染液染色2 min，浸洗10 min后，加入硫化铵染液染色1 min，反复洗净染液后置于光学显微镜下观察并拍照，每组样品重复实验3次，结果在ImageJ软件网页(网址：https://cnij.imjoy.io/)上进行分析。
1.4.7 茜素红染色检测ROB细胞矿化情况吸取经不同质量浓度柚皮苷(0，100 mg/L及1，10 g/L)培养24 h后的各组细胞悬液，滴加至盖玻片上后置于培养箱培养至固着，加入2 mL细胞培养液后继续培养6 h，用PBS洗涤3次后加入40 g/L多聚甲醛固定，用PBS洗涤、蒸馏水浸洗3次，加入1 mL茜素红染液染色3-5 min，反复洗净染液后置于光学显微镜下观察并拍照，每组样品重复实验3次，结果在ImageJ软件网页(网址：https://cnij.imjoy.io/)上进行分析。
1.5 主要观察指标 ①柚皮苷诱导后ROB细胞增殖情况；②柚皮苷诱导后ROB细胞中miR-206、Cx43、ERK1 mRNA的表达；③柚皮苷诱导后ROB细胞中ERK1/2、P-ERK蛋白表达；④柚皮苷诱导后ROB细胞中碱性磷酸酶的表达和钙化结节的数量。
1.6 统计学分析使用SPSS 19.0软件进行统计学分析，上述实验均重复3次，各组间比较采用单因素方差分析和t检验。文章统计学方法已经广州中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

3.1 柚皮苷与成骨分化在骨折、骨缺损等骨损伤的修复过程中，骨的生长、发育和塑形是成骨细胞、破骨细胞和骨细胞协同完成的，其中成骨细胞因参与骨基质的产生、运输以及矿化等过程是骨修复过程中非常重要的组成细胞。研究发现，柚皮苷主要通过Wnt、转化生长因子β、MAPK信号通路、破骨细胞信号通路等直接影响骨代谢，通过PI3K-Akt、血管内皮生长因子信号通路等间接调节骨代谢，具有促进骨损伤修复、减缓骨质疏松的作用[9-10]。此外，柚皮苷可以通过干预MAPK、TOLL样受体信号、血管内皮生长因子A通路等参与抗炎、抗氧化、改善循环的过程。根据LI等[11]的研究结果，负载柚皮苷壳聚糖可以通过激活转化生长因子β信号通路中的成骨蛋白Smad受体，从而提高包括Ⅰ型胶原蛋白、骨钙蛋白、骨桥蛋白、骨形成蛋白、唾液酸蛋白等成骨蛋白的表达水平。此外研究发现柚皮苷通过抑制RANKL通路，从而抑制破骨细胞的形成和活性[12-13]。李风波等[14]研究进一步发现，柚皮苷可以通过下调RANK、TRAP、基质金属蛋白酶9、NFATc1、mRNA以及上调C-fos mRNA的表达，从而干预破骨细胞的分化和骨质的吸收。
3.2 miR-206及靶蛋白Cx43与成骨分化作为在生物体中广泛存在的一类小分子单链编码RNA，microRNAs已被公认与细胞的增殖、分化和凋亡等过程密切相关，也在骨组织生长、发育、重塑的过程中发挥着重要作用。例如，研究发现柚皮苷通过激活miR-126的表达来抑制血管细胞黏附分子1的表达，从而降低人软骨肉瘤的侵袭和迁移活性[15]，其中miR-206的下调和C2C12细胞的成骨分化密切相关，当miR-206过表达时，成骨分化过程被显著地抑制，细胞的碱性磷酸酶、Runx mRNA以及骨桥蛋白 mRNA的表达水平和活性都显著降低[16]。深入研究发现，缝隙连接蛋白Cx43既是骨组织中与成骨相关的重要蛋白，同时也是miR-206的主要靶蛋白之一。INOSE等[6]的研究发现成骨细胞转染miR-206后，Cx43表达水平明显下调，在转染anti-miR-206后，Cx43表达水平则会明显升高。在骨骼肌细胞中，ANDERSON等[17]研究发现miR-206通过和Cx43基因序列互补，抑制相关mRNA的翻译和转录，从而抑制Cx43的表达，减少骨骼肌细胞间的连接并激活骨骼肌细胞的分化。有研究发现，过表达Cx43的MC3T3-E1成骨细胞内Runx2依赖性被激活；下调Cx43的表达后，骨髓基质细胞的成骨分化能力被抑制[18-19]。

根据此次研究的结果可以提示，经不同质量浓度柚皮苷处理的实验组对比未给药的对照组，在一定质量浓度范围内，均可显著提高成骨细胞的增殖水平，超过最佳质量浓度(1 g/L)后，其促进增殖的效果随着浓度升高而下降。同时，MiR-206的表达水平在实验组细胞内普遍低于空白对照组，而相应的Cx43表达水平在实验组细胞内则普遍高于空白对照组，miR-206的表达与Cx43 mRNA的表达呈现明显的负相关，推测适宜浓度的柚皮苷可以通过下调miR-206，从而激活Cx43的表达，促进成骨细胞的成骨分化。
3.3 ERK1/2与成骨分化成骨分化是一个多细胞、多细胞因子及多信号通路共同调控的复杂活动，其中MAPK/ERK1/2通路与成骨细胞的增殖和分化关系密切，丝裂原活化蛋白激酶系统(MAPKs)是将细胞表面的信号级联放大至细胞核的重要组成，调控细胞的生长、发育、分裂和凋亡等，ERK1/2作为其中最重要的通路之一，磷酸化后通过激活Runx2、Osterix的表达来促进成骨分化[20]。有研究发现激活ERK1/2可下调CXC受体趋化因子配体2(CXCL2)对成骨分化的抑制作用[21]。Cx43可通过激活ERK1/2通路，降低促凋亡蛋白Bad的表达水平，促进抗凋亡蛋白CAAT/增强子结合蛋白β(C/EBP β)的表达，进而降低成骨细胞和骨细胞的凋亡率[22]。

此次研究发现，不同质量浓度柚皮苷培养的实验组ROB细胞内，Western blot检测结果显示，ERK1/2、P-ERK的表达水平与空白对照组相比普遍更高，且ERK1/2、P-ERK的表达水平与柚皮苷浓度密切相关；但研究也观察到，RT-qPCR检测结果中，除1 g/L柚皮苷组外，其余实验组中ERK1 mRNA表达均低于对照组，此结果和既往研究结论存在出入，推测在成骨细胞成骨分化过程中，可能存在其他信号通路可以调控ERK1 mRNA的转录，尚需进一步探讨。

骨缺损，特别是大段骨缺损，作为临床常见疾病，疗效不理想、预后差、经济负担大等问题仍然没有解决，在众多治疗方案里，骨组织工程是目前最具有潜力的方案之一[23]。既往研究已经证实，通过局部植入负载并释放活性细胞或活性成分的生物材料，大段骨缺损通常可以获得良好的疗效[24-25]。此研究旨在探讨骨损伤修复过程中，柚皮苷对成骨细胞增殖、成骨分化等过程的作用机制，作为前期实验，下一步将使用负载柚皮苷或骨碎补总黄酮的生物支架进行大段骨缺损的动物实验，探讨柚皮苷在骨损伤修复中，尤其是大段骨缺损中，在细胞内和负载生物支架的动物体内，是否都通过miR-206/Cx43/ERK1信号通路从而影响骨损伤修复。

实验组中miR-206表达下调，相应的CX43、ERK1 mRNA表达则升高，ERK1/2、P-ERK蛋白表达也升高，碱性磷酸酶表达水平、细胞矿化能力也随之升高，表明实验组ROB细胞内柚皮苷通过抑制miR-206的表达，从而激活了Cx43/ERK1信号通路，进一步促进了ERK1/2、P-ERK蛋白表达，提高了碱性磷酸酶活性和表达水平及成骨细胞生物矿化水平，从而促进骨损伤修复。

同时，实验仍然存在一些局限性：只通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色来观察柚皮苷对成骨细胞成骨分化的作用，对除碱性磷酸酶和钙盐外的骨钙蛋白、骨形态发生蛋白等骨损伤修复过程中的成骨细胞特异标志物，未观察柚皮苷对其的作用；作为骨组织工程的前期细胞实验，未观察负载生物支架的不同浓度柚皮苷是否能够具有更好的成骨性能，尚需进一步研究。

综上所述，柚皮苷很可能通过下调miR-206的水平，靶向激活Cx43/ERK1通路，促进成骨细胞增殖、成骨分化和矿化。MiR-206及其靶蛋白Cx43、ERK1参与了成骨细胞的增殖和凋亡，或许是骨损伤修复新的切入点，柚皮苷及骨碎补可能通过抑制miR-206促进对骨损伤修复的治疗。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

柚皮苷调控成骨细胞成骨分化的机制

Mechanism by which naringin regulates osteogenic differentiation in osteoblasts

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