石墨相氮化碳特异性吸附血液中血红蛋白的条件优化

doi:10.12307/2023.546

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (30): 4817-4823.doi: 10.12307/2023.546

• 组织工程血管材料 tissue-engineered vascular materials • 上一篇下一篇

石墨相氮化碳特异性吸附血液中血红蛋白的条件优化

陆甜1，2，陶渊3，杨托1，2，孙路路2，裴心阳1，赵亮1，2，李温斌1，4

1新乡医学院第三附属医院心胸外科，河南省新乡市 453003；2新乡医学院生命科学技术学院，河南省新乡市 453003；3郑州大学人民医院麻醉与围术期医学科，河南省郑州市 450003；4首都医科大学附属北京安贞医院，北京市 100029

收稿日期:2022-07-25 接受日期:2022-09-21 出版日期:2023-10-28 发布日期:2023-04-03
通讯作者: 李温斌，主任医师，教授，博士生导师，新乡医学院第三附属医院心胸外科，河南省新乡市 453003；首都医科大学附属北京安贞医院，北京市 100029 赵亮，副教授，硕士生导师，新乡医学院第三附属医院心胸外科，河南省新乡市 453003；新乡医学院生命科学技术学院，河南省新乡市 453003
作者简介:陆甜，女，1997年生，河南省南阳市人，在读硕士，主要从事生物医用材料研究。
基金资助:
河南省科技攻关项目(182102310067)，项目负责人：李温斌；河南省自然科学基金(202300410311)，项目负责人：赵亮；河南方圆医联医疗器械有限公司横向课题(J00043)，项目负责人：赵亮

Optimization of specific adsorption conditions for hemoglobin in blood by graphite-phase carbon nitride

Lu Tian1, 2, Tao Yuan3, Yang Tuo1, 2, Sun Lulu2, Pei Xinyang1, Zhao Liang1, 2, Li Wenbin1, 4

1Department of Cardiothoracic Surgery, The Third Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, Henan Province, China; 2College of Life Science and Technology, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, Henan Province, China; 3Department of Anesthesiology and Perioperative Medicine, People’s Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450003, Henan Province, China; 4Beijing Anzhen Hospital, Capital Medical University, Beijing 100029, China

Received:2022-07-25 Accepted:2022-09-21 Online:2023-10-28 Published:2023-04-03
Contact: Li Wenbin, Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, Department of Cardiothoracic Surgery, The Third Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, Henan Province, China; Beijing Anzhen Hospital, Capital Medical University, Beijing 100029, China Zhao Liang, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Cardiothoracic Surgery, The Third Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, Henan Province, China; College of Life Science and Technology, Xinxiang Medical University Xinxiang 453003, Henan Province, China
About author:Lu Tian, Master candidate, Department of Cardiothoracic Surgery, The Third Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, Henan Province, China; College of Life Science and Technology, Xinxiang Medical University, Xinxiang 453003, Henan Province, China
Supported by:
The Key Science and Technology Program of Henan Province, China, No. 182102310067 (to LWB); the Natural Science Foundation of Henan Province, No. 202300410311 (to ZL); a grant from Henan Fangyuan Medical Union Medical Equipment Co., No. J00043 (to ZL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

石墨相氮化碳：是一种人工合成的二维层状结构软质相聚合物，在常温常压下稳定。C、N原子以sp2杂化形成π电子基团，可与血红蛋白卟啉环发生π-π相互作用，进而使血红蛋白吸附在石墨相氮化碳材料表面，实现血红蛋白的分离纯化且不影响蛋白质构象，因此在实现血液中血红蛋白的特异性吸附方面具有很大优势。
响应面分析法：是一种最优化方法，是将影响结果的多个因素作为函数的因变量，结果作为自变量，通过一系列实验数据作图(一般为等高线图)，以图片显示因变量与自变量的函数关系，以便找到实验的最优条件，实现实验条件的优化。

背景：心脏外科体外循环的安全时限仅6 h的主要原因是游离血红蛋白堆积，目前临床尚无有效的解决办法。
目的：利用石墨相氮化碳可特异性吸附游离血红蛋白的特性，探究其可特异性吸附血红蛋白的最佳条件可达到的最高吸附效率。
方法：配制不同质量浓度的血红蛋白溶液，研究石墨相氮化碳对血红蛋白的吸附能力。基于这些结果，考虑临床应用条件，探究pH值、石墨相氮化碳∶血样、反应温度、反应时间这4个单因素对吸附效率的影响。应用Design-Expert.8.0.6响应面分析软件提供的模型，设pH值、石墨相氮化碳∶血样、反应温度、反应时间4个因素为自变量，全血中游离血红蛋白吸附效率为因变量，设计四因素三水平实验，根据单因素实验结果选定三因素的零水平和波动区，检测吸光度值，计算血红蛋白吸附效率。利用电泳验证石墨相氮化碳对全血中血红蛋白的特异性吸附效果。

结果与结论：①随着血液中血红蛋白质量浓度的增大，石墨相氮化碳对游离血红蛋白的吸附量也逐渐增大，但不满足线性关系；②单因素实验显示，pH=8.0时，石墨相氮化碳对游离血红蛋白的吸附效率为93.5%，对其他蛋白吸附很少，当pH值进一步升高时，对游离血红蛋白的吸附效率先维持平稳后逐渐下降；随着石墨相氮化碳∶血样比值、反应温度及反应时间的增加，石墨相氮化碳对游离血红蛋白的吸附效率呈现上升趋势；③通过Design-Expert.8.0.6软件计算实验的多元回归方程，可以得到4个因素的最佳作用值：pH=7.5，石墨相氮化碳∶血样为6.00 mg∶1 mL，反应温度为36.5 ℃，反应时间为60 min，全血中游离血红蛋白的吸附效率为54.34%；SDS-聚丙烯酰胺凝胶实验，在最佳吸附条件下，石墨相氮化碳可实现对全血中血红蛋白的特异性吸附；④结果显示，石墨相氮化碳可特异性吸附游离血红蛋白，且在最佳吸附条件下可提高吸附效率，有望作为一种新型生物医用材料进一步推动组织工程材料的发展。

https://orcid.org/0000-0002-7392-7582(陆甜)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 石墨相氮化碳, 游离血红蛋白, 特异性吸附, 响应面分析法, 最佳吸附条件

Abstract: BACKGROUND: Currently, there has been no effective strategy for prolonging the 6-hour safe time limit of cardiopulmonary bypass mainly due to the accumulation of free hemoglobin.
OBJECTIVE: To investigate the optimum conditions and the highest adsorption efficiency of graphite-phase carbon nitride (g-C3N4) adsorbing free hemoglobin.
METHODS: Different concentrations of hemoglobin solutions were prepared to study the adsorption capacity of g-C3N4 for hemoglobin, and then the adsorption efficiency of characteristic proteins (albumin, hemoglobin, cytochrome C) in whole blood at different pH values was explored. Based on clinical application conditions, the influences of pH, g-C3N4: blood sample (mg/mL), reaction temperature (°C) and reaction time (minite) on adsorption efficiency were investigated. Using the model created by the response surface analysis software Design-Expert.8.0.6, pH (A), g-C3N4: blood sample (mg/mL) (B), reaction time (C), and reaction temperature (D) were set as independent variables, and the adsorption efficiency of free hemoglobin in whole blood as dependent variables, the experiment with four factors and three levels was designed. According to the single factor experiment results, the zero level and fluctuation zone of three factors were selected, and the absorbance was measured by ultraviolet spectrophotometer to calculate the content of free hemoglobin before and after adsorption, and then the adsorption efficiency was calculated. Finally, the specific adsorption effect of g-C3N4 on hemoglobin in whole blood was verified by electrophoresis.

RESULTS AND CONCLUSION: (1) With the increase of hemoglobin concentration in blood, the adsorption capacity of g-C3N4 to free hemoglobin increased gradually, but did not satisfy the linear relationship. (2) Single factor experiment showed that when the pH was 8.0, the adsorption efficiency of free hemoglobin in whole blood was 93.5%, and the adsorption of other proteins was few. When the pH value increases further, the adsorption efficiency for free hemoglobin initially remains stable and then gradually decreases. With the increase of g-C3N4: blood sample ratio, reaction time and reaction temperature, the adsorption efficiency of free hemoglobin in whole blood increased gradually. (3) The multiple regression equation of this experiment was calculated by Design-Expert.8.0.6 software, and the optimal action values of the four factors were obtained. The highest adsorption efficiency of free hemoglobin in whole blood was obtained by software analysis under the following experimental conditions: pH=7.5, in g-C3N4: blood sample (mg/mL) was 6.00:1, reaction temperature was 36.5 °C, reaction time was 60 minutes, and the adsorption efficiency of free hemoglobin in whole blood was 54.34%. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis analysis showed that g-C3N4 achieved specific adsorption of hemoglobin in whole blood under the optimum adsorption conditions. (4) These results indicate that g-C3N4 can specifically adsorb free hemoglobin and improve the adsorption efficiency under the optimal adsorption conditions, which is expected to be a new biomedical material and further promote the development of tissue engineering materials.

Key words: graphite carbon nitride, free hemoglobin, specific adsorption, response surface analysis, optimum adsorption condition

中图分类号:

陆甜, 陶渊, 杨托, 孙路路, 裴心阳, 赵亮, 李温斌. 石墨相氮化碳特异性吸附血液中血红蛋白的条件优化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(30): 4817-4823.

Lu Tian, Tao Yuan, Yang Tuo, Sun Lulu, Pei Xinyang, Zhao Liang, Li Wenbin. Optimization of specific adsorption conditions for hemoglobin in blood by graphite-phase carbon nitride[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(30): 4817-4823.

图/表（结果） 9

2.1 全血样品中被石墨相氮化碳吸附的游离血红蛋白等温曲线以全血中游离血红蛋白含量为横坐标，被石墨相氮化碳吸附的游离血红蛋白为纵坐标绘制吸附等温线，如图1所示，随着血液中血红蛋白质量浓度的增大，石墨相氮化碳对游离血红蛋白的吸附量也逐渐增大，但不满足线性关系。

2.2 不同pH值下石墨相氮化碳对游离血红蛋白的吸附效率图2为不同pH值下石墨相氮化碳对全血中游离血红蛋白的吸附效率，当pH=8.0时，石墨相氮化碳对全血中游离血红蛋白的吸附效率为93.5%，且对其他蛋白的吸附很少，在可保证特异性吸附血红蛋白的前提下吸附效率也较高。当pH值进一步升高时，石墨相氮化碳对全血中游离血红蛋白的吸附效率先维持平稳后逐渐下降。

2.3 不同石墨相氮化碳∶血样下石墨相氮化碳对游离血红蛋白的吸附效率图3为不同石墨相氮化碳∶血样下石墨相氮化碳对全血中游离血红蛋白的吸附效率，随着石墨相氮化碳∶血样比值的增大，石墨相氮化碳对全血中游离血红蛋白的吸附效率逐渐升高。

2.4 不同反应温度下石墨相氮化碳对游离血红蛋白的吸附效率图4为不同反应温度下石墨相氮化碳对全血中游离血红蛋白的吸附效率，随反应温度的增加，石墨相氮化碳对全血中游离血红蛋白的吸附效率呈现递增趋势。

2.5 不同反应时间下石墨相氮化碳对游离血红蛋白的吸附效率图5为不同反应时间下石墨相氮化碳对全血中游离血红蛋白的吸附效率，随着反应时间的增加，石墨相氮化碳对全血中游离血红蛋白的吸附效率呈现上升趋势。

2.6 响应面实验结果分析
2.6.1 实验结果 Box-Benhnken设计四因素三水平实验所得全血中游离血红蛋白的吸附效率，见表2，模型共设29个实验，其中14、2、24、23、22号实验为中心实验，其余为析因实验。中心实验作为等高线图的区域中心，析因实验作为等高线图的三维定点，重复做5次中心实验以估计误差。

2.6.2 模型建立利用Design-Expert.8.0.6软件对实验结果进行多元拟合，得到pH值(A)、石墨相氮化碳∶血样(B)、反应温度(C)、反应时间(D)的多项回归方程：吸附效率=33.24+0.93A+1.79B+1.70C+15.65D+0.43AB+0.67AC-0.10AD-0.14BC+1.66BD+1.66CD。
2.6.3 方差分析利用Design-Expert.8.0.6软件对实验结果进行多元回归分析，具体结果见表3。方差分析表明，以全血中游离血红蛋白吸附效率为响应值建立的回归模型是显著的，同时误差项不显著，说明建立的回归方程与实际情况吻合度较好，确定系数R2=0.990 6，R2Adj=0.985 4。基于R2及R2Adj接近于1的数值，可用该模型回归方程代替真实实验点对实验结果进行分析。模型中为多元一次项，表明选定的4个因素对全血中游离血红蛋白吸附效率的影响是线性关系。影响全血中游离血红蛋白吸附效率的因素按主次顺序排列为：反应时间(D)>pH值(A)>反应温度(C)>石墨相氮化碳∶血样(B)。

2.6.4 响应面分析为了能更直观地反映4个因素之间的相互作用，以及对全血中游离血红蛋白吸附效率的影响，做出两两自变量为横坐标、吸附效率为纵坐标的3D图。利用Design-Expert.8.0.6软件进行回归分析，分析结果如图6所示。

通过Design-Expert.8.0.6软件计算本实验的多元回归方程，可以得到4个因素的最佳作用值。利用软件分析得全血中游离血红蛋白吸附效率最高的实验条件为：pH=7.5，石墨相氮化碳∶血样为6.00 mg∶1 mL，反应温度为36.5 ℃，反应时间为60 min，石墨相氮化碳对全血中游离血红蛋白的吸附效率为54.34%。为了验证验证响应面分析法的可靠性，用得到的最佳吸附条件对全血中的游离血红蛋白吸附效率进行验证实验，5次平行实验得到的实际平均吸附效率为54.29%，与理论值相差0.05%。基于理论值和实际值微小的差别可得出结论：响应面分析法对全血中游离血红蛋白吸附效率的优化是可行的，得到的吸附效率提取条件有实际应用价值以及可行性。
2.7 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析结果 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳条带结果如图7所示，稀释的全血样品在5-100 kD范围内存在明显的条带，表明全血中存在白蛋白、球蛋白、细胞色素C以及血红蛋白等多种蛋白质(泳道1，8)，经过石墨相氮化碳吸附后这些蛋白条带仍存在，表明石墨相氮化碳实现了对血红蛋白的特异性吸附(泳道2，7)，洗脱液中只有一条明显的条带(泳道3，6)，其条带和血红蛋白标准溶液条带吻合(泳道4，5)，实验结果表明，石墨相氮化碳对可以从人全血样品中特异性地吸附血红蛋白。

参考文献

[1] 仇冰梅,王康,张雷,等.胸腹主动脉置换术中股静脉-股动脉转流的体外循环管理[J].医学研究生学报,2022,35(1):79-81.
[2] GOVENDER K, JANI V P, CABRALES P. The Disconnect Between Extracorporeal Circulation and the Microcirculation: A Review. ASAIO J. 2022;68(7):881-889.
[3] 段正伟,刘云霏.常规供心与边缘供心在终末期心脏病心脏移植中的应用[J].中国组织工程研究,2022,26(26):4211-4215.
[4] 高国栋,胡强,胡金晓,等.体外循环冠状动脉搭桥术中不同停跳液灌注方法的心肌保护作用[J]. 中国组织工程研究,2015,19(7):1112-1116.
[5] BAUDYS M, PAUŠOVá Š, PRAUS P, et al. Graphitic Carbon Nitride for Photocatalytic Air Treatment. Materials (Basel). 2020;13(13):3038.
[6] LIU Y, LIU Y, XU Y, et al. Phenanthroline bridging graphitic carbon nitride framework and Fe (II) ions to promote transfer of ph otogenerated electrons for selective photocatalytic reduction of Nitrophenols. J Colloid Interface Sci. 2022;608(Pt 2):2088-2099.
[7] CUI Y, WANG Z, ZHENG J, et al. Fabrication of silver vanadate quantum dots/reduced graphene oxide/graphitic carbon nitride Z-scheme heterostructure modified polyvinylidene fluoride self-cleaning membrane for enhancing photocatalysis and mechanism insight. J Colloid Interface Sci. 2022;614: 677-689.
[8] JALILI R, CHENAGHLOU S, KHATAEE A, et al. An Electrochemiluminescence Biosensor for the Detection of Alzheimer’s Tau Protein Based on Gold Nano star Decorated Carbon Nitride Nanosheets. Molecules. 2022;27(2):431.
[9] ALIZADEH T, RAFIEI F, AKHOUNDIAN M. A novel chloride selective potentiometric sensor based on graphitic carbon nitride/silver chloride (g -C3N4/AgCl) composite as the sensing element. Talanta. 2022;237:122895.
[10] KITTE SA, BUSHIRA FA, XU C, et al. Plasmon-Enhanced Nitrogen Vacancy-Rich Carbon Nitride Electrochemiluminescence Aptasensor for Highly Sensitive Detection of miRNA. Anal Chem. 2022;94(2):1406-1414.
[11] LI J, ZHANG K, ZHAO Y, et al. High-Efficiency and Stable Li-CO2 Battery Enabled by Carbon Nanotube/Carbon Nitride Heterostructured Photocathode. Angew Chem Int Ed Engl. 2022;61(4):e202114612.
[12] YE C, LIU M. A computational study on the potential application of carbon nitride nanosheets in Na-ion batteries. J Mol Model. 2022;28(2):40.
[13] LIU X, ZHANG H, CAI Z, et al. Fluorescent graphitic carbon nitride with photocatalytic oxidase-like activity for anti-counterfeitin g application. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 2022;268:120685.
[14] CUI Y, AN X, ZHANG S, et al. Emerging graphitic carbon nitride-based membranes for water purification. Water Res. 2021;200:117207.
[15] TAO L, ZHANG H, LI G, et al. Photocatalytic degradation of pharmaceuticals by pore-structured graphitic carbon nitride with carbon vacancy in water: Identification of intermediate degradants and effects of active species. Sci Total Environ. 2022;824:153845.
[16] WANG J, LIAN X, CHEN S, et al. Effect of Bi(2)WO(6)/g-C(3)N(4) composite on the combustion and catalytic decomposition of energetic materials: An efficient catalyst with g-C(3)N(4) carrier. J Colloid Interface Sci. 2022;610: 842-853.
[17] PATTANAYAK DS, PAL D, MISHRA J, et al. Doped graphitic carbon nitride (g-C(3)N(4)) catalysts for efficient photodegradation of tetracycline antibiotics in aquatic environments. Environ Sci Pollut Res Int. 2022. doi: 10.1007/s11356-022-19766-y.
[18] TIAN Y, ZHAO D, HUANG X, et al. Extended π-Conjugative Carbon Nitride for Single 1064 nm Laser-Activated Photodynamic/Photothermal Sy nergistic Therapy and Photoacoustic Imaging. ACS Appl Mater Interfaces. 2022;14(6):7626-7635.
[19] ZHENG H, ZHAO Z, PHAN JB, et al. Highly Efficient Metal-Free Two-Dimensional Luminescent Melem Nanosheets for Bioimaging. ACS Appl Mater Interfaces. 2020;12(2):2145-2151.
[20] ONG WJ, TAN LL, NG YH, et al. Graphitic Carbon Nitride (g-C3N4)-Based Photocatalysts for Artificial Photosynthesis and Environmental Remediation: Are We a Step Closer To Achieving Sustainability? Chem Rev. 2016;116(12):7159-7329.
[21] 张锐.石墨型氮化碳在蛋白质分离纯化中的应用研究[D].沈阳:东北大学,2014.
[22] 陈旭伟,郑旭,王晓峰,等.超高容量氧化石墨烯/碳纳米管气凝胶用于血红蛋白的吸附分离 [J]. 高等学校化学学报,2015,36(8):1498-1504.
[23] 孟媛媛.聚丙烯酸/石墨相氮化碳三维复合水凝胶的制备及其在血红蛋白分离中的应用[D].沈阳:东北大学,2018.
[24] ZHAO X, FAN X, SHAO X, et al. Modifying the physicochemical properties, solubility and foaming capacity of milk proteins by ultrasound-assisted alkaline pH-shifting treatment. Ultrason Sonochem. 2022;88:106089.
[25] 邵冬青,张群,姜舟婷.分子动力学模拟研究温度对蛋白质结构稳定性的影响[J].中国计量大学学报,2022,33(1):44-48+130.
[26] 袁玉琦,张巨源,王莉,等. 影响PVDF膜对蛋白吸附效率的主要因素[J].氨基酸和生物资源,2015,37(3):51-56.
[27] LI J, JIN H, HU Z. Application of Salvage Autologous Blood Transfusion for treating Massive Hemorrhage during Ectopic Pregnancy. Front Surg. 2022; 9:896526.
[28] SCHMIDBAUER SL, SEYFRIED TF. Cell Salvage at the ICU. J Clin Med. 2022; 11(13):3848.
[29] EROL K. Polychelated cryogels: hemoglobin adsorption from human blood. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 2017;45(1):31-38.
[30] BAYDEMIR G, ANDAÇ M, PERÇIN I, et al. Molecularly imprinted composite cryogels for hemoglobin depletion from human blood. J Mol Recognit. 2014;27(9):528-536.
[31] ARMUTCU C, ÖZGüR E, ÇORMAN ME, et al. Interface imprinted polymers with well-oriented recognition sites for selective purification of hemoglobin. Colloids Surf B Biointerfaces. 2021;197:111435.
[32] MOBASHERAT JAJROUD SY, FALAHATI M, ATTAR F, et al. Human hemoglobin adsorption onto colloidal cerium oxide nanoparticles: a new model based on zeta pote ntial and spectroscopy measurements. J Biomol Struct Dyn. 2018;36(11):2908-2916.
[33] CHEN Q, WANG MM, ZHANG Y, et al. Selective Adsorption of Hemoglobin in Human Whole Blood with a Nickel Monosubstituted Silicotungstic Acid Hybrid. ACS Omega. 2022;7(26):22633-22638.
[34] LIU Y, WANG Y, YAN M, et al. Selective Removal of Hemoglobin from Blood Using Hierarchical Copper Shells Anchored to Magnetic Nano particles. Biomed Res Int. 2017;2017:7309481.
[35] LIU J, LIANG Y, LIANG Q, et al. Tunable composites prepared from graphene oxide and zeolitic imidazolate framework-8 for improved sel ective isolation of hemoglobin. Mikrochim Acta. 2018;185(8):361.
[36] WANG J, TAN S, LIANG Q, et al. Selective separation of bovine hemoglobin using magnetic mesoporous rare-earth silicate microspheres. Talanta. 2019; 204:792-801.
[37] WANG XM, HU ZJ, GUO PF, et al. Purification of hemoglobin by adsorption on nitrogen-doped flower-like carbon superstructures. Mikrochim Acta. 2020;187(3):162.
[38] ZHANG X, WU D, SHEN J, et al. Preparation of bottlebrush polymer-modified magnetic graphene as immobilized metal ion affinity adsor bent for purification of hemoglobin from blood samples. Mikrochim Acta. 2020; 187(8):472.

引言

红细胞因理化因素被破坏碎裂释放出血红蛋白的现象称为溶血，多见于血液系统疾病、免疫系统疾病以及感染性疾病，在外科手术中也很常见，尤其常见于心脏外科开胸体外循环下[1-4]。血液中游离血红蛋白过多可导致黄疸、肾功能不全等严重并发症，至今没有合适的治疗方法。另外，临床上使用的术中红细胞离心回收技术只回收红细胞，废弃全部血浆，外科出血不能够实现全血回收利用，临床“血荒”的严峻局势多年来得不到缓解。这其中的关键技术限制即为如何在不破坏其他血液成分的前提下，特异性分离出血浆中的游离血红蛋白。
氮化碳作为一种人工合成的共价化合物，具有密度低、稳定性好、不溶于水、耐磨性强等优点[5]，在光催化[6-7]、传感器[8-10]、电池[11-12]，防伪[13]、水处理[14-15]、催化剂[16-17]、光热治疗及生物成像等方面具有广阔的应用前景[18-19]。氮化碳有5种结构，但只有g相即石墨相是软质相，在常温常压下最稳定，已在能源、材料以及生物医药等相关领域大放异彩。石墨型氮化碳(graphite-phase carbon nitride，g-C3N4)由二维层状结构组成，相邻各层之间通过弱的范德华力相互作用结合在一起。三嗪(C3N3)和三-s-三嗪(C6N7)是建立石墨相氮化碳的2个基本构造单元[20]，其中基于三-s-三嗪的石墨相氮化碳被认为是最稳定的g-C3N4形式，在整个层状结构中具有规则分布的三角形纳米孔，p轨道上存在多余的电子，可形成π电子基团，其中较大的π电子基团可与蛋白质分子中的疏水残基、蛋白质疏水腔内的色氨酸或酪氨酸残基、血红蛋白和细胞色素C中的卟啉环发生π-π相互作用，进而吸附在石墨相氮化碳材料表面，由此可见疏水作用力是蛋白质与石墨相氮化碳材料结合的主要驱动力。当溶液pH值接近蛋白质的等电点时，包埋在蛋白内部的疏水性残基得以充分暴露，可更多的在疏水作用力驱动下吸附在石墨相氮化碳材料表面[21]。基于此，当溶液pH值接近血红蛋白的等电点时，血红蛋白的疏水性残基充分暴露，含氧的卟啉环与石墨相氮化碳之间发生π-π堆积作用，可使血红蛋白有效吸附在固相材料表面。在pH=8.0附近，白蛋白几乎没有吸附，血红蛋白的吸附效率很高，这一发现使利用石墨相氮化碳材料从全血中选择性吸附血红蛋白成为可能。
目前已经有研究证实，石墨相氮化碳可特异性吸附游离血红蛋白，还可被洗脱下来而不破坏血红蛋白构象[22-23]。考虑到影响蛋白吸附的4个基本因素：pH值[24]，石墨相氮化碳与蛋白溶液的比例、吸附温度[25]、吸附时间[26]，此次实验在分别探究其单因素对吸附效率影响的基础上，探讨两两因素交互作用下的吸附效率，对石墨型氮化碳特异性吸附游离血红蛋白的吸附条件进行优化，通过响应面分析法对吸附效率进行评价，旨在为优化石墨相氮化碳特异性吸附游离血红蛋白的吸附条件提供参考。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计基于g-C3N4特异性吸附血红蛋白的基础构建实验，组间比较采用多元回归分析。
1.2 时间及地点实验于2021年10月至2022年2月在新乡医学院生命科学技术学院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验样品实验用血为急性StanfordA型主动脉夹层开胸患者经过体外循环的高肝素化抗凝血液(高肝素化抗凝血液标本对实验结果无影响，供者对实验知情同意)，该实验获新乡医学院第三附属医院伦理委员会批准，批准号：K2022-051-01。稀释血液的液体为B-R缓冲液(磷酸、硼酸、冰醋酸、氢氧化钠的混合溶液)，pH值范围为7.0-8.0。
1.3.2 实验主要试剂仪器三聚氰胺、磷酸、硼酸、冰醋酸、氢氧化钠、甲醇、体积分数95%乙醇、无水乙醇、考马斯亮蓝染液均购自上海阿拉丁试剂有限公司；温度控制采用恒温水浴锅(DK-8D 江苏)；pH值监测采用精密台式数显酸度计(PHS-3E 上海)；电子天平(精确度0.000 1 g，FA2204 上海)；吸附前后的血液吸光度测量用紫外-可见分光光度计(U-3900 日本)；台式高速离心机(TGL-16G 上海)；血红蛋白检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；SDS-聚丙烯酰胺E凝胶配置试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 溶液的制备
B-R缓冲液：①A：准确称取0.286 7 g硼酸于20 mL烧杯中，加水溶解，再用移液枪分别移取0.376 mL磷酸和0.335 mL冰醋酸于烧杯中，混合均匀后配制成体积为1 000 mL的溶液，此溶液即为0.004 mmol/L的H3PO4-HAc-H3BO3混酸溶液，室温保存备用；②B：配制浓度为0.02 mol/L的NaOH溶液1 000 mL，室温保存备用。临用时，取适量体积的A溶液，在pH值检测下加入B溶液，配置成所需pH值的B-R缓冲液。缓冲液现配现用。
考马斯亮蓝R-250染液：100 mL甲醇，45 mL蒸馏水，45 mL冰乙酸，10 mL考马斯亮蓝。
脱色液：250 mL体积分数95%乙醇加80 mL冰醋酸定容至1 000 mL。
1.4.2 石墨相氮化碳特异性吸附血红蛋白
石墨相氮化碳的制备：称取8 g三聚氰胺置于10 mL带盖坩埚中，用药匙压平，放入马弗炉中，在室温条件下设定程序升温，2 h升温至550 ℃，保温4 h。自然冷却至室温得到淡黄色固体。将固体放入研钵中研成粉末，去离子水洗涤2次，无水乙醇洗涤2次(重复2次洗涤步骤)，60 ℃真空烘干，再次研磨得到黄色粉末，此即用热聚合法合成的石墨相氮化碳。
吸附曲线的绘制：用0.004 mmol/L 的B-R缓冲液(pH=8.0)将血液稀释为20-1 000 mg/L的血样，将稀释后的不同质量浓度的血样均以13 000 r/min离心10 min，取10 μL上清液，加入检测血红蛋白的试剂，混匀，室温反应5 min后在540 nm处测定吸光度值(此为吸附前血液中的游离血红蛋白含量)。将5 mg的石墨相氮化碳与上述不同质量浓度的1 mL上清液混合，室温下在摇床上低速振荡吸附60 min(模拟血液在体流动过程中的吸附)。将吸附后的血样以6 000 r/min离心8 min，取上清，加入检测血红蛋白的试剂，混匀，室温反应5 min后，在540 nm处测定吸光度值。以吸附前血样中的游离血红蛋白含量为横坐标，吸附的游离血红蛋白为纵坐标绘制吸附曲线。
实验样品中游离血红蛋白的测定：取1.5 mL稀释后的血样13 000 r/min离心10 min，取10 μL上清液，加入检测血红蛋白的试剂，混匀，室温反应5 min后，在540 nm处测定吸光度值。再取1 mL上清，在其中加入5 mg石墨相氮化碳粉末，室温下在摇床上低速振荡吸附60 min(摇床上低速振荡模拟血液在体流动过程中的吸附)。将吸附后的血样以6 000 r/min离心8 min，取上清10 μL，加入检测血红蛋白的试剂，混匀，室温反应5 min后，在540 nm波长处测定吸光度值(此为吸附后血液中的游离血红蛋白含量)，各不同质量浓度的血样均按上述实验步骤测量，计算吸附前后血液中的游离血红蛋白含量。
1.4.3 石墨相氮化碳特异性吸附游离血红蛋白的条件优化根据预实验结果与临床应用条件，设计石墨相氮化碳特异性吸附全血中游离血红蛋白的单因素预实验，通过单因素预实验，确定pH值、石墨相氮化碳∶血样、反应时间、反应温度并进行单因素实验。
pH值对全血中游离血红蛋白吸附效率的影响：准确称取10份5 mg的石墨相氮化碳粉末，准确量取10份1 mg/mL的稀释血样1 mL，pH值为3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，石墨相氮化碳∶血样为5.00 mg∶1 mL，反应温度为37 ℃，反应时间为60 min，考察不同pH值对全血中游离血红蛋白吸附效率的影响。
石墨相氮化碳∶血样对全血中游离血红蛋白吸附效率的影响：准确量取6份1 mg/mL的pH=8.0的稀释血样1 mL，反应温度为37 ℃，反应时间为60 min，石墨相氮化碳∶血样分别为1.00 mg∶1 mL、2.00 mg∶1 mL、3.00 mg∶1 mL、4.00 mg∶1 mL、5.00 mg∶1 mL、6.00 mg∶1 mL，考察不同石墨相氮化碳∶血样对全血中游离血红蛋白吸附效率的影响。
反应温度对全血中游离血红蛋白吸附效率的影响：准确称取6份5 mg的石墨相氮化碳粉末，准确量取6份1 mg/mL的pH=8.0的稀释血样1 mL，反应温度为60 ℃，反应温度分别为36.0，36.2，36.4，36.6，36.8，37.0 ℃，考察不同反应时间对全血中游离血红蛋白吸附效率的影响。
反应时间对全血中游离血红蛋白吸附效率的影响：准确称取6份5 mg的石墨相氮化碳粉末，准确量取6份1 mg/mL的pH=8.0的稀释血样1 mL，反应温度为37 ℃，反应时间分别为10，20，30，40，50，60 min，考察不同反应时间对全血中游离血红蛋白吸附效率的影响。

1.4.4 应用响应面分析法优化吸附条件应用Design-Expert.8.0.6响应面分析软件提供的模型，设pH值(A)、石墨相氮化碳∶血样(B)、反应时间(C)、反应温度(D)4个因素为自变量，全血中游离血红蛋白吸附效率为因变量，设计四因素三水平实验，并根据单因素实验结果选定三因素的零水平和波动区。实验因素与水平的取值表见表1。

1.4.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析取经过体外循环的高肝素化抗凝血液1 mL，用0.004 mol/L的B-R缓冲溶液(pH=7.5)定容至80 mL，振荡摇匀后5 000 r/min离心10 min，取上清分装后-20 ℃冷冻保存。准确移取1 mL稀释的全血样品，加入6 mg的石墨相氮化碳，振荡吸附60 min后6 000 r/min离心12 min，取上清。在沉淀中加入pH=4.0的B-R缓冲液1 mL，振荡洗脱60 min，6 000 r/min离心12 min，取上清，以全血加两次上清以及血红蛋白标准溶液(1 g/L)作为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的模板。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶配置试剂盒配置15%的分离胶，用无水乙醇封边，静置30 min待凝固后弃去无水乙醇，加入5%的浓缩胶(SDS-聚丙烯酰胺凝胶配置试剂盒配置)，插入梳子。静置45 min待凝固后拔去梳子，加入电泳液后对应孔上样，每孔加入12 μL样品(所有样品质量浓度均为1 mg/mL)，加样完毕，80 V电泳，待样品跑到浓缩胶后调整电压为120 V，当溴酚蓝指示剂距底部2 cm左右停止电泳。在大培养皿中加入考马斯亮蓝R-250染液，静置6 h，弃去染液，加入脱色液，20-30 min更换一次脱色液，直到蛋白条带清晰为止。观察对应样品的电泳条带分布，定性验证石墨相氮化碳可特异性吸附全血中游离血红蛋白。
1.5 主要观察指标在单因素变量条件下石墨相氮化碳对游离血红蛋白的吸附效率，在两两因素相互作用下下对游离血红蛋白的吸附效率。
1.6 统计学分析所有实验数据以x±s形式表示，采用Graphpad Prism 8.0.2软件绘制折线图。通过Design-Expert.8.0.6软件进行统计学分析及绘制图片，P < 0.01表示差异有极显著性意义。该文统计学方法已经新乡医学院生物统计专家审核。

讨论

近年来，随着手术量日益增加、新的手术方式的不断开展以及多学科协作诊疗在围术期的广泛应用，异体血的需求量越来越大，各地医院血荒问题频频出现，因此自体血回输成为临床输血研究的热点[27-28]。现有的血液回收机无法去除全血中的游离血红蛋白，只能回收红细胞，弃去血浆，造成血资源的极大浪费。目前一些其他材料已被证实可用于血红蛋白的分离吸附，如：多螯合冷冻凝胶从人体血液中吸附血红蛋白[29]，分子印迹复合冷冻凝胶或分子印记膜选择性纯化血红蛋白[30-31]，胶态氧化铈纳米粒子吸附人血红蛋白[32]，用镍单取代硅钨酸杂化物选择性吸附人全血中的血红蛋白[33]，使用锚定在磁性纳米粒子上的分层铜壳或金壳选择性去除血液中的血红蛋白[33-34]，由氧化石墨烯和沸石咪唑酸酯骨架制备的可调谐复合材料用于改善血红蛋白的选择性分离[35]，通过溶剂热法制备的磁性介孔稀土硅酸盐(稀土=Er，Tm，Yb)微球作为新型吸附剂选择性分离牛血红蛋白[36]，碳化自组装聚酰亚胺纳米片制备氮掺杂的花状碳超结构(NPC-F)上层结构用于从人全血样品中分离血红蛋白以获得高纯度血红蛋白[37]，以及制备金属离子亲和吸附剂的牙刷聚合物改性磁性石墨烯，用于从血液样品中纯化血红蛋白等[38]。这些不同方法的共同特点就是对血红蛋白均有吸附作用，但吸附效率却不尽相同，而且有些只是在血红蛋白标准液里的吸附(也只能在血红蛋白标准液内进行吸附)，未应用于全血中血红蛋白的吸附，因此无法确定在全血中的吸附效果。
此次实验首先用B-R缓冲溶液配制一系列血红蛋白质量浓度梯度确定的全血稀释液(0-1 000 µg/mL)，用定量的石墨相氮化碳粉末吸附，计算当全血中血红蛋白浓度增加时石墨相氮化碳吸附的血红蛋白含量。实验结果显示，随着质量浓度的增加吸附效率也增加，但不是线性上升，由此推测石墨相氮化碳对全血中游离血红蛋白的吸附为多分子层吸附，无法确定最大吸附量。考虑到全血中的各种蛋白成分，选取白蛋白、血红蛋白、细胞色素C 3种蛋白作为酸性蛋白、中性蛋白以及碱性蛋白的代表，在不同pH值下检测石墨相氮化碳对3种蛋白的吸附效率。结果显示，在pH=8.0时，血红蛋白可被特异性吸附且吸附效率较高，偏离pH=8.0时吸附效率下降，这可能是偏离了血红蛋白的等电点以后，包埋在血红蛋白内部的疏水性残基暴露不充分，含氧的卟啉环与石墨相氮化碳之间发生π-π堆积作用减弱，使石墨相氮化碳对游离血红蛋白的吸附效率减低。为了确定石墨相氮化碳与血样的质量体积比对全血中游离血红蛋白吸附效率的影响，选择不同比例的石墨相氮化碳∶血样，计算吸附效率。结果显示，随着石墨相氮化碳∶血样比例的增加，吸附效率也逐渐增加，但上升趋势变缓，当石墨相氮化碳∶血样为1.00 mg∶1 mL时，可能是因为石墨相氮化碳过少，全血中的游离血红蛋白含量已经超过了石墨相氮化碳的吸附量上限，因而吸附效率较低。考虑到人体温度基本波动在36-37 ℃，所以选择在此范围内观察随温度变化的石墨相氮化碳对全血中血红蛋白的吸附效率。在实验温度范围内，吸附效率随温度增加而增加，37 ℃时石墨相氮化碳对全血中游离血红蛋白的吸附效率达到最大值，此时为47.86%。吸附时间也是一个重要影响因素，实验中随着反应时间的增加，可观察到全血的颜色变浅。通过数值计算绘图得图5，大体所见完全符合图5中随之间延长吸附效率一直增加的趋势，但考虑到临床应用的可能性(体外循环中血液在不断循环)反应时间最长设置为60 min。为了能更直观地反映4个因素之间的相互作用对全血中游离血红蛋白吸附效率的影响，利用Design-Expert. 8.0.6软件中Box-Benhnken设计四因素三水平实验，由实验结果绘制两两影响因素为横坐标，吸附效率为纵坐标的3D图。从图6a可以看出，pH值和石墨相氮化碳血样的变化对全血中游离血红蛋白的吸附效率交互作用影响不大，图6b、d反映出的结果与图6a相似；从图6c可以看出，全血中游离血红蛋白的吸附效率曲线表现出稳定的上升趋势，随着pH值(A)的升高和反应时间(D)的延长，吸附效率增加；图6a-f可以得出各因素的交互作用，并在方差分析基础上得到了最佳吸附条件。
综上所述，此次实验在石墨相氮化碳可特异性吸附全血中血红蛋白的基础上，探究吸附的最佳条件，通过响应面分析法设计实验，得到最佳条件下的吸附效率。若成功将石墨相氮化碳特异性吸附全血中游离血红蛋白的特性应用于临床，将极大缓解临床血资源紧张的局势，为外科手术的顺利进行提供一定保证，而且还可为溶血性疾病以及肾衰患者带来福音。相比于其他材料来说，石墨相氮化碳制备简单、吸附效率高、实际可行性强，因此具有广阔的应用前景。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

石墨相氮化碳特异性吸附血液中血红蛋白的条件优化

Optimization of specific adsorption conditions for hemoglobin in blood by graphite-phase carbon nitride

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 9

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	吴江, 殷瀚, 严子能, 田广招, 丁振罡, 袁勋, 付力伟, 田壮, 眭翔, 刘舒云, 郭全义. 低温沉积3D打印负载基质细胞衍生因子1的分级多孔软骨复合支架[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(30): 4776-4782.
[2]	崔红旺, 王良盛, 温鹏, 孟志斌. 破骨细胞TRPV5通道对体外降解生物珊瑚人工骨的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(21): 3337-3342.
[3]	薛鹏, 杜斌, 刘锌, 孙光权, 程童飞, 陈浩, 何帅. 镀膜工艺结合3D打印制备Mg-F膜/淫羊藿素膜/β-磷酸三钙支架的表征及成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(16): 2480-2487.
[4]	张辉, 王佳洋, 王茜, 甘洪全, 王志强. 动态培养环境下透明质酸与国产多孔钽复合对软骨细胞功能的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(3): 339-345.
[5]	龙智生, 熊龙, 龚飞鹏, 李经堂, 曾建华, 邓颖, 兰敏, 孔维豪, 陈钢. 多尺度羟基磷灰石/壳聚糖微管结构人工骨对兔骨缺损修复及成血管的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(34): 5436-5441.
[6]	曹飞, 惠敏, 董西玲, 王乐, 王祖旭, 张敏, 张晓明, 刘童斌. 载银纳米羟基磷灰石/聚己内酯复合纳米纤维支架的制备及成骨抗菌性能[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(34): 5461-5467.
[7]	刘畅, 徐玲. 改良同轴3D打印具有空心管道结构的镁黄长石支架[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(34): 5425-5429.
[8]	柳小军, 李自红, 郭文远, 韩颖, 徐玉茵, 周静, 王君敏. 京尼平改性牛心包眼巩膜生物补片的结构表征及性能评价[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(34): 5430-5435.
[9]	吴羽翀, 彭旭, 余喜讯. 掺铕聚磷酸钙骨组织工程支架可促成骨、血管生成及抗无菌性松动[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(28): 4458-4465.
[10]	刘名, 王凯. 壳聚糖/海藻酸盐复合支架联合山楂叶总黄酮修复脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(28): 4466-4471.
[11]	刘康, 王勇平, 左可斌, 杨海涛, 贾斌. 负载虎杖苷的胶原/硫酸肝素支架修复大鼠脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(28): 4500-4506.
[12]	刘钢, 高丽兰, 史菲菲, 王世鑫, 罗来龙, 李瑞欣, 张春秋. Ⅱ型胶原-丝素蛋白-透明质酸复合支架的制备及力学性能检测[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(28): 4519-4524.
[13]	何家辰, 刘畅, 陈迟迟, 施勤. 制备负载细胞可注射微球及体外评价[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(28): 4483-4488.
[14]	王静, 杨九菊, 王宁宁, 刘超. 改性3D打印钛支架对脂肪间充质干细胞成骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(27): 4265-4271.
[15]	廖军, 徐普. 纳米淡水珍珠粉对成骨相关基因表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(27): 4325-4329.