二甲双胍激活核因子E2及相关通路保护脂多糖诱导的软骨细胞损伤

doi:10.12307/2023.441

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (26): 4147-4153.doi: 10.12307/2023.441

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二甲双胍激活核因子E2及相关通路保护脂多糖诱导的软骨细胞损伤

王旭东1，韩俊柱1，王文锐2，夏启鑫1，郭成1

1蚌埠医学院第二附属医院骨科，组织移植安徽省重点实验室，安徽省蚌埠市 233000；2蚌埠医学院生命科学院，癌症转化医学安徽省重点实验室，安徽省蚌埠市 233000

收稿日期:2022-06-06 接受日期:2022-07-21 出版日期:2023-09-18 发布日期:2023-01-20
通讯作者: 韩俊柱，博士，副主任医师，蚌埠医学院第二附属医院骨科，组织移植安徽省重点实验室，安徽省蚌埠市 233000
作者简介:王旭东，男，1992年生，四川省宜宾市人，汉族，蚌埠医学院在读硕士，主要从事骨关节相关研究。
基金资助:
安徽省蚌埠医学院自然科学重点项目(2020byzd186)，项目负责人：韩俊柱

Protective effect of metformin against lipopolysaccharide-induced chondrocyte injury by activating nuclear factor E2 and its relevant signaling pathway

Wang Xudong1, Han Junzhu1, Wang Wenrui2, Xia Qixin1, Guo Cheng1

1Anhui Key Laboratory of Tissue Transplantation, Department of Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Bengbu Medical University, Bengbu 233000, Anhui Province, China; 2Anhui Provincial Key Laboratory of Translational Cancer Research, School of Life Science, Bengbu Medical University, Bengbu 233030,Anhui Province China

Received:2022-06-06 Accepted:2022-07-21 Online:2023-09-18 Published:2023-01-20
Contact: Han Junzhu, MD, Associate chief physician, Anhui Key Laboratory of Tissue Transplantation, Department of Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Bengbu Medical University, Bengbu 233000, Anhui Province, China
About author:Wang Xudong, Master candidate, Anhui Key Laboratory of Tissue Transplantation, Department of Orthopedics, Second Affiliated Hospital of Bengbu Medical University, Bengbu 233000, Anhui Province, China
Supported by:
the Natural Science Key Project of Bengbu Medical College, No. 2020byzd186 (to HJZ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

核因子E2相关性因子2(nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2)：作为一种关键转录因子，其特点是直接调节与抗氧化和解毒相关基因的表达水平，在正常情况下，Nrf2主要存在于细胞质中，处于低表达状态；然而，当细胞活性氧水平升高时，Nrf2会转移入细胞核与位于启动子区域的抗氧化反应元件结合，调节抗氧化蛋白，从而降低细胞活性氧和氧化应激产物，同时进一步增加抗氧化酶的表达，从而保护机体免受氧化应激和组织损伤。
血红素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)：作为热休克蛋白家族的成员，除了抗氧化作用外，HO-1在软骨细胞的炎症和分解代谢中也起着重要的调节作用。

背景：既往研究表明，核因子E2相关性因子2/血红素加氧酶1信号通路在骨关节炎发生发展中至关重要，二甲双胍对软骨细胞具有一定的保护作用。
目的：探讨二甲双胍对脂多糖诱导的软骨细胞损伤的保护作用及机制研究。
方法：取SD大鼠软骨细胞进行体外分离培养和鉴定。选取第3代软骨细胞，分别用不同质量浓度的脂多糖(0，10，50，100，500，1 000和5 000 μg/L)和二甲双胍(0，50，100，500，1 000，5 000和10 000 μmol/L)处理细胞24 h，采用CCK8法检测细胞活性，筛选最适脂多糖和二甲双胍质量浓度。按照处理因素不同将软骨细胞分为空白组、脂多糖诱导组(5 000 μg/L)和脂多糖(5 000 μg/L)+二甲双胍组(1 000 μmol/L)。流式细胞术检测各组软骨细胞凋亡情况；通过活性氧、丙二醛和超氧化物歧化酶试剂盒检测细胞氧化应激；RT-PCR和Western Blot检测软骨细胞白细胞介素1β、环氧化酶2、Ⅱ型胶原、核因子E2相关性因子2和血红素加氧酶1的mRNA和蛋白表达。

结果与结论：①脂多糖降低了软骨细胞活力，诱导软骨细胞凋亡，而二甲双胍干预后细胞活力上升，凋亡率下降；②脂多糖诱导软骨细胞活性氧和丙二醛表达增加，超氧化物歧化酶活性下降，而二甲双胍干预后活性氧和丙二醛表达降低，超氧化物歧化酶活性增加；③脂多糖诱导软骨细胞白细胞介素1β、环氧化酶2表达增加，Ⅱ型胶原、核因子E2相关性因子2和血红素加氧酶1表达降低，而二甲双胍干预后白细胞介素1β和环氧化酶2表达降低，Ⅱ型胶原、核因子E2相关性因子2和血红素加氧酶1表达增加；④结果说明，二甲双胍能够抑制脂多糖诱导的软骨细胞损伤，发挥对软骨细胞的保护作用，其作用可能通过激活核因子E2相关性因子2/血红素加氧酶1信号通路实现的。

https://orcid.org/0000-0003-2798-1315(王旭东)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 二甲双胍, 关节炎, 氧化损伤, Nrf2/HO-1通路

Abstract: BACKGROUND: Previous studies have shown that the nuclear factor E2-related factor 2/heme oxygenase 1 signaling pathway is crucial for the development of osteoarthritis, and metformin has a certain protective effect on chondrocytes.
OBJECTIVE: To investigate the protective effect and mechanism of metformin on chondrocyte injury induced by lipopolysaccharide.
METHODS: Sprague-Dawley rat chondrocytes were isolated, cultured, and identified in vitro. Passage 3 chondrocytes were selected and treated with different concentrations of lipopolysaccharide (0, 10, 50, 100, 500, 1 000, and 5 000 μg/L) and metformin (0, 50, 100, 500, 1 000, 5 000, and 10 000 μmol/L) for 24 hours. Cell viability was then detected by cell counting kit-8 method, and the optimal mass concentrations of lipopolysaccharide and metformin were screened. According to different treatment factors, the chondrocytes were divided into blank group, lipopolysaccharide (5 000 μg/L) induced group, and 5 000 μg/L lipopolysaccharide +1 000 μmol/L group. Cell apoptosis was detected by flow cytometry. Oxidative stress was detected by reactive oxygen species, malondialdehyde, and superoxide dismutase kits. The mRNA and protein expressions of interleukin-1β, cyclooxygenase 2, type II collagen, nuclear factor E2-related factor 2, and heme oxygenase were detected by RT-PCR and western blot, respectively.
RESULTS AND CONCLUSION: Lipopolysaccharide reduced the activity of chondrocytes and induced apoptosis of chondrocytes, while metformin increased the activity of chondrocytes and decreased the apoptosis rate. The levels of reactive oxygen species and malondialdehyde were increased and the activity of superoxide dismutase was decreased in lipopolysaccharide-induced chondrocytes, while treatment with metformin decreased the levels of reactive oxygen species and malondialdehyde and increased the activity of superoxide dismutase in lipopolysaccharide-induced chondrocytes. Lipopolysaccharide increased the expressions of interleukin-1β and cyclooxygenase-2 in chondrocytes, and decreased the expressions of type II collagen, nuclear factor E2-related factor 2, and heme oxygenase 1 in chondrocytes. After metformin intervention, the expressions of interleukin-1β and cyclooxygenase-2 were decreased, and the expression of type II collagen, nuclear factor E2-related factor 2, and heme oxygenase 1 were increased. To conclude, metformin can inhibit lipopolysaccharide-induced chondrocyte injury, possibly through the activation of nuclear factor E2-related factor 2/heme oxygenase 1 signaling pathway

Key words: metformin, osteoarthritis, oxidative damage, Nrf2/HO-1 pathway

中图分类号:

王旭东, 韩俊柱, 王文锐, 夏启鑫, 郭成. 二甲双胍激活核因子E2及相关通路保护脂多糖诱导的软骨细胞损伤[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(26): 4147-4153.

Wang Xudong, Han Junzhu, Wang Wenrui, Xia Qixin, Guo Cheng. Protective effect of metformin against lipopolysaccharide-induced chondrocyte injury by activating nuclear factor E2 and its relevant signaling pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(26): 4147-4153.

图/表（结果） 7

2.1 软骨细胞培养鉴定 4倍镜下见第3代软骨细胞呈梭形或椭圆形密集排列(图1A)，10倍镜下见软骨细胞形态较为明显，以椭圆形为主(图1B)，20倍镜下可见软骨细胞细微形态，细胞两端有伪足伸出，分化更为典型(图1C)。第3代软骨细胞经甲苯胺蓝染色后胞质呈淡蓝色，胞核呈深蓝色，镜下可见蓝紫色异染颗粒(图2A)；经Ⅱ型胶原免疫荧光染色后，胞质及胞膜呈绿色荧光，胞核呈深蓝色荧光(图2B)。上述细胞形态以及染色结果表明培养的细胞为第3代软骨细胞。

2.2 CCK-8法检测软骨细胞活力细胞活力随脂多糖质量浓度的增加而有所降低，质量浓度为5 000 μg/L时，软骨细胞活力的下降较空白组差异有显著性意义(P < 0.001)(图3A)。二甲双胍促进细胞的增殖，随浓度的不同增殖效果有所差别，且浓度在1 000 μmol/L时，其增殖效果最佳(图3B)。因此，实验选用的脂多糖质量浓度为5 000 μg/L来制备骨关节炎模型，在此基础上，选用浓度为1 000 μmol/L的二甲双胍进行干预。将二甲双胍同脂多糖诱导的软骨细胞共孵育24 h后，其活力相较于脂多糖诱导组明显上升(P < 0.05)(图3C)。

2.3 流式细胞术检测软骨细胞凋亡结果显示脂多糖诱导的软骨细胞发生早期凋亡的比例增加，而脂多糖与二甲双胍混悬液处理后的细胞早期凋亡比例相对下降(P < 0.05)，见图4。

2.4 软骨细胞活性氧、丙二醛和超氧化物歧化酶水平脂多糖诱导的软骨细胞活性氧产生增加，荧光强度也较强，而脂多糖与二甲双胍混悬液处理后的细胞活性氧的产生相对降低，荧光强度也相对较弱，差异有显著性意义(P < 0.05)，图5A-D；此外，脂多糖诱导的软骨细胞丙二醛浓度增加，超氧化物歧化酶活性下降，而脂多糖与二甲双胍混悬液处理后的细胞丙二醛浓度相对降低，超氧化物歧化酶活性相对增加
(P < 0.05)，图5E，F。

2.5 软骨细胞白细胞介素1β、环氧化酶2、Ⅱ型胶原、Nrf2和HO-1 mRNA的表达脂多糖诱导的软骨细胞白细胞介素1β和环氧化酶2的表达增加，Ⅱ型胶原、Nrf2和HO-1表达减少；而脂多糖与二甲双胍混悬液处理后的细胞白细胞介素1β和环氧化酶2的表达相对下降，Ⅱ型胶原、Nrf2和HO-1表达也相对增高，且差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图6。

2.6 软骨细胞白细胞介素1β、环氧化酶2、Ⅱ型胶原、Nrf2和HO-1蛋白的表达脂多糖诱导的软骨细胞白细胞介素1β和环氧化酶2蛋白表达增加，Ⅱ型胶原、Nrf2和HO-1蛋白表达减少；而脂多糖与二甲双胍混悬液处理后的细胞白细胞介素1β和环氧化酶2蛋白表达相对减少，Ⅱ型胶原、Nrf2和HO-1蛋白表达也相对增加，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图7。

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引言

骨关节炎是一种常见的以关节进行性退变为特征的疾病，临床主要表现为关节疼痛、僵硬、活动受限和关节畸形等，是老年人关节疼痛和致残的主要原因[1]。骨关节炎病变关节的特点是软骨细胞凋亡、氧化应激、滑膜炎症、软骨下骨硬化和骨赘形成，导致整个关节结构和功能障碍[2]。骨关节炎的病因及病理机制虽尚未完全明确，但已有研究证实白细胞介素1β、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α等细胞因子在关节软骨损伤及软骨细胞凋亡过程中起重要作用[3]，而脂多糖作为革兰阴性细菌外膜的主要成分，可以促进包括白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、诱导性一氧化氮合酶等促炎细胞因子的产生[4]，从而导致软骨细胞出现凋亡、炎症反应、氧化应激等病理改变，促进骨关节炎的发生发展。
既往研究表明，核因子E2相关性因子2(nuclear factor E2 related factor 2，Nrf2)/血红素加氧酶1(heme oxygenase 1，HO-1)信号通路在骨关节炎发生发展中至关重要，Nrf2作为一种关键转录因子，其特点是直接调节与抗氧化和解毒相关基因的表达水平，在正常情况下，Nrf2主要存在于细胞质中，处于低表达状态；然而，当细胞活性氧水平升高时，Nrf2会转移入细胞核与位于启动子区域的抗氧化反应元件(ARE)结合，调节抗氧化蛋白如HO-1的表达[5-6]，从而降低细胞活性氧和氧化应激产物如丙二醛的含量，同时进一步增加如超氧化物歧化酶之类的抗氧化酶的表达，从而保护机体免受氧化应激和组织损伤[7]。此外，有研究也报道了Nrf2可以调控一系列炎症相关的病理过程，如Nrf2可以对髓系细胞的急性炎症进行调节，抑制炎症反应以及氧化应激，起到保护细胞的作用，同时，Nrf2还参与软骨细胞增殖、凋亡和分化等一系列反应，在骨关节炎的发生发展中发挥重要作
用[7-8]。HO-1作为热休克蛋白家族的成员，除了抗氧化作用外，其在软骨细胞的炎症和分解代谢中也起着重要的调节作
用[9]，如有文献报道HO-1表达的增加可以抑制过氧化氢(H2O2)诱导的软骨细胞白细胞介素1β、基质金属蛋白酶13以及肿瘤坏死因子α的表达[10]，此外，HO-1作为HO的可诱导异构体可将血红素降解为一氧化碳、胆绿素和 Fe2+等，其中一氧化碳可以抑制炎症递质的合成，包括促炎细胞因子和一氧化氮，发挥保护细胞的作用[11]。诸多证据表明，Nrf2/HO-1信号通路参与了细胞的增殖、凋亡和分化，调控氧化应激和炎症反应等病理过程，发挥保护细胞的作用[8，10]。
二甲双胍作为治疗2型糖尿病的经典药物，具有价格低廉、安全系数高和疗效确切的优点[5]。近年来的诸多研究表明，二甲双胍在多种疾病中有效，如肥胖[6]、心血管疾病[7]、肿瘤等[8]，具有抗衰老、抗凋亡、抗炎和抗氧化的作用[12-17]，并对软骨细胞具有一定的保护作用。基于上述研究背景，该研究采用脂多糖对体外分离培养的大鼠软骨细胞进行诱导，构建骨关节炎炎性损伤模型，旨在探讨二甲双胍对脂多糖诱导的软骨细胞损伤的保护作用及作用机制，为药物防治骨关节炎软骨损伤提供新的实验基础及理论依据，以期找到骨关节炎早期治疗的有效方法。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计细胞学实验观察。两组间的比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)。
1.2 时间及地点实验于2021年2月至2022年5月在蚌埠医学院组织移植安徽省重点实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验用主要药品和试剂脂多糖(货号BS904，biosharp公司)；二甲双胍(货号B1970，美国APExBIO公司)；白细胞介素1β抗体(目录号AF5103)、环氧化酶2抗体(目录号AF7003)、Ⅱ型胶原抗体(货号AF5456)、Nrf2抗体(目录号AF0639)、HO-1抗体(目录号AF5393)均为Affinity公司产品；DAPI溶液(货号C0065)、胶原酶Ⅱ(货号C8150)均为索莱宝公司产品；CCK8试剂盒(目录号BL001A，麦克生物)；凋亡试剂盒(目录号AT101，联科生物)；活性氧检测试剂盒(目录号KGT010-1，凯基生物)。
1.3.2 实验动物选用4周龄SPF级雌雄各半SD大鼠6只，体质量70-90 g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2019-0004。实验方案经蚌埠医学院动物实验伦理委员会批准。
1.4 实验方法
1.4.1 软骨细胞的分离培养和鉴定 2%戊巴比妥钠腹腔麻醉处死6只SD大鼠，用体积分数75%乙醇浸泡5 min，无菌条件下切取股骨头及胫骨平台表面软骨，用组织剪将软骨组织剪成1.0 mm×1.0 mm碎片，加入2 g/L的Ⅱ型胶原酶，37 ℃体积分数5%CO2培养箱消化4 h，然后加入体积分数10%FBS培养基终止消化，用200目的筛网过滤，1 800 r/min，离心10 min去除上清液，移入培养瓶培养，待细胞铺满瓶底90%以上时传代培养。选取生长状态良好的第3代软骨细胞，采用爬片技术将细胞种植于载玻片上，待软骨细胞爬满玻片后，40 g/L多聚甲醛固定，行甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫荧光染色进行细胞鉴定。
1.4.2 细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8)测定软骨细胞活力选取生长状态良好的第3代软骨细胞，经胰酶消化离心后以细胞浓度为3×108 L-1接种到96孔板内，每孔30 μL，设置5个复孔。然后，分别用不同质量浓度的脂多糖(0，10，50，100，500，1 000和5 000 μg/L)和二甲双胍(0，50，100，500，1 000，5 000和10 000 μmol/L)处理细胞。处理24 h后，每孔加入10 μL CCK8试剂，孵育2 h，在波长=450 nm处测定其吸光度值，选择最适脂多糖和二甲双胍浓度。按照上述方法将细胞接种于96孔板中，每孔30 μL，设置5个复孔。设置空白组、脂多糖诱导组(5 000 μg/L)和脂多糖(5 000 μg/L)+二甲双胍组(1 000 μmol/L)，检测二甲双胍对脂多糖诱导的软骨细胞活力的影响。
1.4.3 流式细胞术检测软骨细胞凋亡第3代软骨细胞消化离心后制成细胞浓度为1×109 L-1的混悬液，标记为空白组、脂多糖诱导组和脂多糖+二甲双胍组，分别加入培养基、脂多糖5 000 μg/L和脂多糖5 000 μg/L+二甲双胍1 000 μmol/L混悬液药物孵育24 h。收集2×106个未处理的软骨细胞，诱导凋亡后冰上孵育30 min，然后加入1.5 mL Binding Buffer工作液和数量相同的细胞混匀，标记为空白管、FITC单染管和PI单染管，室温避光孵育后流式细胞仪检测，调节电压和补偿。在相同电压和补偿条件下，检测各组细胞的凋亡率。
1.4.4 软骨细胞活性氧、丙二醛和超氧化物歧化酶含量检测第3代软骨细胞消化离心后以细胞浓度为1×109 L-1接种于12孔板内，每孔100 μL，设置3个复孔。标记为空白组、脂多糖诱导组和脂多糖+二甲双胍组，分别加入培养基、脂多糖5 000 μg/L和脂多糖5 000 μg/L+二甲双胍1 000 μmol/L混悬液药物孵育24 h。孵育完成后，吸取各组细胞培养上清液进行丙二醛和超氧化物歧化酶检测，然后PBS洗涤2次，加入1 mL DCFH-DA稀释液，37 ℃，孵育20 min，荧光显微镜检测各组细胞内活性氧水平。

1.4.5 RT-PCR检测软骨细胞白细胞介素1β、环氧化酶2、Ⅱ型胶原、Nrf2和HO-1 mRNA的表达取生长状态良好的第3代软骨细胞以细胞浓度1×109 L-1接种于12孔板内，每孔200 μL，设置3个复孔。标记为空白组、脂多糖诱导组、脂多糖+二甲双胍组，分别加入培养基、脂多糖5 000 μg/L和脂多糖5 000 μg/L+二甲双胍1 000 μmol/L混悬液药物孵育24 h。孵育完成后，按照Trizol法步骤提取细胞RNA[18]，测定其RNA浓度和纯度，按照反转录试剂盒操作步骤将RNA反转录成cDNA，然后将cDNA稀释5倍置于冰盒上备用。实时荧光定量PCR扩增：以反转录的cDNA为模板，按照PCR扩增操作步骤进行加样，GAPDH作为内参。见表1。

PCR扩增反应总体积为20 μL，包括10 μL SYBR、上下游引物共0.8 μL、模板cDNA 2 μL、ROXⅡ 0.4 μL和无酶水6.8 μL。反应体系：第一步：预变性95 ℃，60 s；第二步：循环反应共45个循环95 ℃，20 s→60 ℃，20 s→72 ℃，30 s；第三步：熔解曲线95 ℃，15 s→60 ℃，60 s→95 ℃，1 s。通过测得目的基因CT值，计算得出目的基因2-ΔΔCt值，以GAPDH为内参求得各基因的相对表达量。
1.4.6 Western Blot检测软骨细胞白细胞介素1β、环氧化酶2、Ⅱ型胶原、Nrf2和HO-1蛋白的表达取生长状态良好的第3代软骨细胞以细胞浓度5×108 L-1接种于培养皿中，标记为空白组、脂多糖诱导组、脂多糖+二甲双胍组，分别加入培养基、脂多糖5 000 μg/L和脂多糖5 000 μg/L+二甲双胍1 000 μmol/L混悬液药物孵育24 h。孵育完成后，采用细胞刮勺刮取细胞，1 500 r/min，4 ℃，离心10 min，然后弃上清，加入蛋白酶抑制剂和裂解液混匀，冰上裂解30 min。裂解完成后，12 000 r/min，4 ℃，离心30 min，吸取上清液于离心管中，-20 ℃备用。按照BCA蛋白定量试剂盒操作步骤测定蛋白的浓度，加入蛋白上样缓冲液和裂解液，95 ℃，10 min使蛋白变性。按照PAGE凝胶快速制备试剂盒步骤配制分离胶和浓缩胶，待胶凝固后拔出齿梳，每孔上样15 μL，110 V，电泳1.5 h，然后200 mA，转膜2.5 h。待转膜完成后5%脱脂牛奶封闭2 h，TBST洗膜3次，每次5 min，按照1∶1 000比例稀释白细胞介素1β、环氧化酶2、Ⅱ型胶原、Nrf2和HO-1抗体，4 ℃孵育过夜。次日摇床30 min，二抗孵育2 h，TBST洗膜5次，每次3 min。按照ECL化学发光底物试剂盒说明配制显色液，采用Image-Pro Plus6系统扫描并分析条带的灰度值，以目的蛋白的灰度值和相应内参蛋白GAPDH灰度值对比，得出目的蛋白相对表达水平。
1.5 主要观察指标 ①软骨细胞培养鉴定；②软骨细胞活力及凋亡情况；③软骨细胞活性氧、丙二醛和超氧化物歧化酶水平；④软骨细胞白细胞介素1β、环氧化酶2、Ⅱ型胶原、Nrf2、HO-1 的mRNA和蛋白的表达。
1.6 统计学分析采用SPSS 20.0软件进行统计分析，计量资料以x±s表示，两组间的比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA)，P < 0.05表示差异有显著性意义。文章的统计学方法已经蚌埠医学院生物统计学专家审核。

讨论

细胞凋亡是一种高度调控的、活跃的细胞死亡过程，涉及特定的细胞内信号传递和基因的表达，凋亡机制的失调会导致一系列疾病，如癌症、自身免疫性疾病和退行性疾病[2]。此次研究通过脂多糖对体外分离培养的软骨细胞进行诱导，通过CCK-8法和流式细胞术，发现随着脂多糖浓度的增加，其活力逐渐出现下降，同时，软骨细胞经过脂多糖处理后，其早期凋亡比例明显升高。结果说明脂多糖可以降低软骨细胞的活力，抑制细胞增殖，并诱导其发生凋亡，导致软骨细胞的功能和生存能力降低，这与脂多糖促进促炎细胞因子的高表达有关。此外，通过实时荧光定量PCR和Western Blot技术证实了脂多糖诱导的软骨细胞白细胞介素1β和环氧化酶2的产生增加，Ⅱ型胶原的表达降低，同时，通过DCFH-DA探针法检测了脂多糖诱导的软骨细胞活性氧的表达，结果显示脂多糖处理后的软骨细胞活性氧表达增加，且细胞培养上清液中丙二醛浓度增加，超氧化物歧化酶活性下降。
活性氧是含氧自由基，包括过氧化氢(H2O2)、羟基自由基(OH-)和一氧化氮等，具有不稳定和活性高的特点[19]。一般而言，细胞中的活性氧含量较低，但活性氧的存在对于维持细胞内稳态和功能是必不可少的[20]。然而，这种生理机制的失衡导致蛋白质、脂质和DNA等细胞大分子的氧化，改变了它们的功能，促进炎性细胞因子和趋化因子的表达[21]。与此同时，在脂多糖诱导的软骨细胞中，一方面，脂多糖可以直接刺激细胞产生大量的诱导性一氧化氮合酶，从而诱导一氧化氮的产生，使软骨细胞处于氧化应激状态[22]，另一方面由于白细胞介素1β、环氧化酶2等炎症递质在骨关节炎软骨细胞中表达增加，继而诱导活性氧的产生，导致软骨细胞发生氧化应激的病理改变[2]。上述结果说明了脂多糖成功构建了骨关节炎炎性损伤模型，软骨细胞出现凋亡、炎症反应、氧化应激等病理改变，同时，也论证了氧化应激和炎症反应是相互依存的，都是对方的靶点，也是治疗骨关节炎的理想靶点。现代医学对骨关节炎的治疗分为以关节置换为主的手术治疗和以药物及理疗为主的非手术治疗。关节置换术是治疗终末期骨关节炎的有效方法，但不仅价格昂贵，且有一定的感染、松动等并发症的发生，并发症的处理常更为棘手。因此，骨关节炎的早期防治就显得尤为重要[10]。对于早期骨关节炎，目前临床可选择的药物有非类固醇类抗炎镇痛药、皮质类固醇和透明质酸钠，这些药物能够暂时减轻疼痛、改善关节功能，但不能防治关节软骨的破坏与损伤[23]。因此，有必要寻找更为安全有效的新型骨关节炎防治药物。
最近研究表明，二甲双胍可以激活AMPK/SIRT1信号通路，抑制白细胞介素1β诱导的软骨细胞凋亡[24]，亦有动物实验表明二甲双胍可以抑制大鼠关节软骨细胞的凋亡来保护骨骼[16]。此次研究发现脂多糖诱导的软骨细胞活力下降和凋亡率增加，而二甲双胍在一定范围浓度内可以增加软骨细胞活力，并恢复脂多糖处理抑制的软骨细胞增殖，抑制软骨细胞凋亡，证实了二甲双胍对软骨细胞的保护作用。此外，有研究报道二甲双胍通过Nrf2/HO-1信号通路，增加抗氧化酶的活性及表达，抑制炎症细胞因子的水平，减轻大鼠肝脏的氧化损伤和炎症反应[25]。同时，亦有研究表明二甲双胍可以通过调控PI3K/AKT和Nrf2/HO-1信号通路，抑制甲基乙二醛(MGO)诱导的氧化应激、线粒体功能障碍、凋亡及炎症反应，发挥对糖尿病血管内皮的保护作用[26]。因此，为了研究二甲双胍是否对脂多糖诱导的软骨细胞氧化应激和炎症反应有改善作用，此次研究通过脂多糖成功构建了骨关节炎模型，在此基础上给予二甲双胍进行干预，检测软骨细胞的氧化损伤和炎症反应是否有所改善，结果显示二甲双胍干预后软骨细胞分泌的活性氧和丙二醛减少，超氧化物歧化酶活性增加，白细胞介素1β和环氧化酶2表达下降，而Ⅱ型胶原表达增加。结果说明二甲双胍可以改善软骨细胞的氧化应激和炎症反应。
Nrf2作为细胞内重要的核心转录因子，是抗氧化防御系统的重要组成部分，在氧化应激状态下，产生的活性氧使得Nrf2磷酸化，解除与Keap1偶联后转移入核与抗氧化反应元件(ARE)结合，激活HO-1基因的转录，从而增强细胞的整体解毒和清除有害物质的能力[27]，而且，相关研究也指出HO-1是血红素代谢的限速酶，是一种经典的内源性抗氧化酶，具有良好的抗氧化作用[6]。此外，有研究报道Nrf2还直接调节炎症相关基因的表达，如Nrf2通过与其启动子之中抗氧化反应元件(ARE)结合来促进激活转录因子3(ATF3)的基因表达[28]，从而发挥抑制促炎细胞因子的作用。Nrf2的抗炎作用在诸多急性炎症模型中也得到了证实，如在肺部炎症模型中，与正常的小鼠相比，Nrf2缺陷型的小鼠表现出更严重的肺部炎症，导致肺气肿恢复延迟[29]。与此同时，既往研究表明，HO-1在软骨细胞的炎症和分解代谢中也起着重要的调节作用，可以抑制过氧化氢(H2O2)诱导的软骨细胞白细胞介素1β、基质金属蛋白酶13以及肿瘤坏死因子α的表达，其降解的产物如一氧化碳也可以抑制炎症递质的合成，发挥保护细胞的作用[9-11]。诸多的研究也证实了Nrf2/HO-1信号通路与炎症反应和氧化应激密切相关，并且激活Nrf2/HO-1信号通路可以改善组织的氧化损伤和炎症反应，起到保护组织的作用[17，30-32]。此次研究结果显示脂多糖诱导的软骨细胞Nrf2和HO-1的表达降低，而二甲双胍可以拮抗该效应，促进Nrf2和HO-1的高表达，抑制脂多糖诱导的软骨细胞凋亡、氧化应激及炎症反应，发挥对软骨细胞的保护作用，从而避免关节软骨的进一步破坏，一定程度上阻遏骨关节炎的发生发展。
综上所述，此次研究结果表明，脂多糖对软骨细胞作用如下：①软骨细胞活力下降，凋亡率增加；②软骨细胞活性氧和丙二醛浓度增加，超氧化物歧化酶活性下降；③软骨细胞白细胞介素1β、环氧化酶2、Ⅱ型胶原、Nrf2和HO-1的表达降低。二甲双胍干预后，软骨细胞活力增加，凋亡率下降，改善了脂多糖诱导的软骨细胞氧化损伤和炎症反应，其作用可能通过激活Nrf2/HO-1信号通路实现的。推测二甲双胍可能成为药物防治骨关节炎软骨损伤的潜在药物，阻止骨关节炎的进一步发展。此次研究的不足之处：①未能完全阐述二甲双胍对骨关节炎的作用机制；②缺乏动物实验进行进一步验证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

二甲双胍激活核因子E2及相关通路保护脂多糖诱导的软骨细胞损伤

Protective effect of metformin against lipopolysaccharide-induced chondrocyte injury by activating nuclear factor E2 and its relevant signaling pathway

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