m6A RNA甲基化修饰在颅脑损伤模型大鼠坏死性凋亡中的作用

doi:10.12307/2023.187

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

m6A：指N6-腺苷酸甲基化，是一种广泛存在于mRNA上的碱基修饰行为，mRNA的内部修饰用于维持mRNA的稳定性。mRNA最常见的内部修饰包括了N6-腺苷酸甲基化(m6A)、N1-腺苷酸甲基化(m1A)、胞嘧啶羟基化(m5C)等。m6A在 mRNA内部修饰碱基中所占比例最大，主要分布在 G(m6A)C (70%)或者A(m6A)C (30%)保守序列中。
坏死性凋亡：又叫程序性坏死，是一种受调控的由RIP1和RIP3激酶介导的坏死性细胞死亡方式。坏死性凋亡的特征包括细胞质膜完整性会在早期丢失，细胞内容物泄漏以及细胞器肿胀。通过坏死性凋亡方式死亡的细胞缺乏典型的凋亡特征，例如细胞膜出泡、染色质固缩和核小体内DNA裂解成180 bp的梯状DNA，但也可能表现出TUNEL阳性。

背景：哺乳动物中枢神经系统损伤依赖N6-甲基腺苷(m6A)的调节，并与坏死性凋亡密切相关。目前在大鼠创伤性颅脑损伤中，m6A RNA甲基化修饰与创伤性颅脑损伤坏死性凋亡的关系尚未被研究。
目的：探讨m6A RNA甲基化修饰与创伤性颅脑损伤大鼠坏死性凋亡的关系，为颅脑损伤坏死性凋亡的发生发展及预后的分子机制提供实验依据。
方法：选取SPF级SD雄性大鼠30只，随机分为假手术组、创伤性颅脑损伤组和NSC118218(STAT1抑制剂)组，各10只。后2组通过改良Feeney法建立颅脑损伤模型，假手术组仅暴露脑硬膜，不进行颅脑打击。颅脑损伤6 h后检测各组大鼠大脑皮质炎症因子肿瘤坏死因子ɑ、白细胞介素6、白细胞介素1β、白细胞介素10和高迁移率族蛋白B1表达水平以及脑含水量，检测YTH结构域家族蛋白2、总m6A RNA甲基化修饰水平、STAT1和JAK1的表达水平。
结果与结论：①创伤性颅脑损伤组和NSC118218组炎症因子水平和脑含水量明显高于假手术组，m6A RNA甲基化修饰比例和YTHDF2表达水平明显低于假手术组，JAK1和STAT1的表达水平明显高于假手术组(P < 0.05)；②与创伤性颅脑损伤组相比，NSC118218组炎症因子水平和脑含水量明显降低，m6A RNA甲基化修饰比例和YTH结构域家族蛋白2表达水平明显升高，JAK1和STAT1的mRNA及蛋白表达水平明显降低(P < 0.05)；③提示颅脑损伤后m6A RNA甲基化修饰比例降低，YTH结构域家族蛋白2表达水平下降，激活JAK/STAT信号通路，增加JAK1和STAT1的表达，促进细胞坏死性凋亡。
https://orcid.org/0000-0003-1974-1944(林树楷)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 创伤性颅脑损伤, m6A RNA甲基化, 坏死性凋亡, JAK/STAT, 动物模型

Abstract: BACKGROUND: Mammalian central nervous system injury is dependent on the regulation of N6-methyladenosine (m6A) and is closely associated with necrotic apoptosis. At present, the relationship between m6A RNA methylation modification and necrotic apoptosis in rat models of traumatic brain injury has not been studied.
OBJECTION: To study the relationship between m6A RNA methylation and necrotic apoptosis in a rabbit brain injury model and to provide experimental basis for the molecular mechanism of occurrence, development and prognosis of necrotic apoptosis following craniocerebral injury.
METHODS: A total of 30 SPF male Sprague-Dawley rats were selected and randomized into sham operation group (n=10), traumatic brain injury group (n=10), and signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1) inhibitor (NSC118218) group (n=10). The brain injury model was established using the modified Feeney method in the latter two groups, while the dura mater in the sham operation group was only exposed without striking. The levels of inflammatory factors, tumor necrosis factor ɑ, interleukin-6, interleukin-1β, interleukin-10, and high mobility group box 1 in the cerebral cortex of rats and brain water content were detected at 6 hours after brain injury. At the same time, the methylation level of total m6A RNA and the mRNA and protein expression levels of YTH domain family protein family 2 (YTHDF2), JAK1 and STAT1 were detected.
RESULTS AND CONCLUSION: The levels of inflammatory factors, brain water content, and the expression of JAK1 and STAT1 in the traumatic brain injury group and NSC118218 group were significantly higher than those in sham operation group, while the proportion of m6A RNA methylation and the expression level of YTHDF2 were significantly lower than those in the sham operation group (P < 0.05). The levels of inflammatory factors, brain water content, and the mRNA and protein expressions of JAK1 and STAT1 in the NSC118218 group were significantly lower than those in the traumatic brain injury group, while the proportion of m6A RNA methylation and the expression level of YTHDF2 were significantly increased (P < 0.05). These findings indicate that the proportion of m6A RNA methylation and YTHDF2 expression decrease after brain injury, which activates the JAK/STAT signaling pathway, increases the expression of JAK1 and STAT1, and thus promotes necrotic apoptosis in cells.

Key words: traumatic brain injury, m6A RNA methylation, necrotic apoptosis, JAK/STAT, animal model

中图分类号:

林树楷, 刘仲海, 刘珍, 蔡金城, 魏入廷. m6A RNA甲基化修饰在颅脑损伤模型大鼠坏死性凋亡中的作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(20): 3167-3172.

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图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析纳入30只大鼠，随机分为3组，全部进入结果分析，无脱失。
2.2 各组大鼠脑组织挫伤情况比较对各组大鼠造模6 d后脑组织大体病理学外观改变进行观察发现：假手术组无明显病理性改变；创伤性颅脑损伤组有明显蛛网膜下腔出血，偶见一侧脑室少量出血；NSC118218组有蛛网膜下腔出血，同时偶见一侧脑室少量出血，但较创伤性颅脑损伤组出血量少，见图1。

对大鼠颅脑损伤6 d后挫伤区域进行石蜡切片苏木精-伊红染色，结果显示，假手术组未发现明显病理性改变，细胞排列整齐，胞核清晰；创伤性颅脑损伤组挫伤区域出现明显的挫伤灶，与正常组织交界清晰，细胞排列疏松，可见散在分布的红色神经细胞和部分坏死神经元；NSC118218组挫伤区域明显减少，细胞排列疏松，散在分布的红色神经细胞和坏死神经元数量少于创伤性颅脑损伤组，见图2。

2.3 各组大鼠脑组织炎症及水肿情况创伤性颅脑损伤组和NSC118218组的相关炎症因子及脑含水量明显高于假手术组，差异有显著性意义(P < 0.05)，说明脑水肿明显，出现明显的炎症反应。与创伤性颅脑损伤组比较，NSC118218组的炎症因子水平和脑含水量明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，说明脑损伤后情况好转，见表2及图3。

2.4 各组总m6A RNA甲基化修饰水平假手术组总m6A RNA甲基化修饰比例为(36±5)%，创伤性颅脑损伤组为(22±3)%，NSC118218组为(30±3)%。创伤性颅脑损伤组总m6A RNA甲基化修饰比例明显低于假手术组，NSC118218组明显高于创伤性颅脑损伤组，差异均有显著性意义(P < 0.05)。
2.5 JAK1和STAT1的转录及蛋白翻译水平与创伤性颅脑损伤组比较，NSC118218组JAK1和STAT1的转录及蛋白翻译水平都明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)，见表3及图4。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。使用方差分析先分析数据整体是否有比较意义，随后用LSD-t法进行两两比较。
1.2 时间及地点实验于2021年3-10月在三亚中心医院/贵州医科大学分生实验室完成。
1.3 材料 SPF级SD雄性成年大鼠30只，体质量210-250 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)2002-0003。按随机数字表法随机分为假手术组、创伤性颅脑损伤组和NSC118218组，每组10只。实验方案经贵州医科大学动物实验伦理委员会批准，批准号为20200908。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.4 方法
1.4.1 模型建立除假手术组外，其余2组采用改良Feeney法即自由落体撞击大鼠脑硬膜建立颅脑损伤模型[5]。创伤性颅脑损伤组以35 mg/kg的剂量腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，暴露脑硬膜，采用颅脑打击器(撞针直径4.5 mm)撞击大鼠颅骨顶部，撞击速度为4.5 m/s，停留时间200 ms，打击深度为2.0 mm，注射庆大霉素(江西制药厂，批号：950217)以预防感染。假手术组以35 mg/kg的剂量腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，仅暴露脑硬膜，不进行颅脑打击，注射庆大霉素。NSC118218组是在造模以后每天上午10：00腹腔注射1次STAT1的特异性抑制剂NSC118218(美国Selleck生物科技有限公司，2 mg/kg)，共用药6 d，用于观察特异性抑制JAK1/STAT1信号的表达。
各组大鼠在造模6 d后麻醉断头处死，锐性分离挫伤灶脑组织约40 mg，置于-80 ℃冰箱中保存备用。

1.4.2 检测方法
(1)ELISA实验：采用双抗体夹心ELISA检测各组大鼠大脑皮质的炎症因子，包括肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素1β、白细胞介素10和高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1，HMGB1)。将各组大鼠断头后于冰上分离大脑皮质，加入PBS后冰上研磨，随后以3 000 r/min的速率离心15 min(4 ℃，半径10 cm)，取上清液，按照肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素1β、白细胞介素10和HMGB1的试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)操作手册完成ELISA实验。
(2)使用干湿法检测脑组织含水量：取挫伤区域脑组织约4 mm×3 mm×3 mm大小，按公式计算，脑组织含水量=(湿质量-干质量)/湿质量×100%。
(3)苏木精-伊红染色：流水充分洗涤脑组织后通过脱水、透明、透蜡、包埋，切约4 μm厚度的切片经展片、贴片、脱蜡复水置于苏木精中染色充分后用自来水冲洗至颜色变蓝，体积分数1%盐酸乙醇中褪色，自来水漂洗，乙醇脱水，0.5%伊红乙醇液复染，无水乙醇脱水3 min，中性树胶封固，显微镜下观察染色效果。
(4)m6A RNA甲基化定量检测总m6A RNA甲基化修饰水平：严格按照试剂盒(ab185912，购自英国Abcam公司)的说明书进行操作。首先根据生产商提供的说明使用Trizol(Invitrogen，USA)提取各组总RNA。其次，RNA的质量由NanoDrop(Thermo Fisher Scientific，美国)检测。使用试剂盒检测m6A的修饰水平，200 ng的RNA放置于实验皿上，随后加入捕获抗体溶液和检测抗体溶液，通过酶标仪(Bio-Rad)在450 nm波长下读取每个样品的吸光度来定量测定m6A水平。
(5)实时荧光定量PCR：取大鼠脑组织，采用Trizol和实时荧光定量PCR试剂盒(Invitrogen，USA)提取总RNA反转录合成模板cDNA，PCR引物序列见表1。每个样本3个复孔，β肌动蛋白作为内参，按两步法进行荧光定量PCR扩增分析mRNA表达。采用2-ΔΔCt方法计算目的基因相对表达量。

(6)Western blot：提取各组脑组织总蛋白并测定蛋白浓度，取50 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，转膜，转移至PVDF膜。封闭液室温封闭1 h，经鼠抗人YTHDF2、JAK1和STAT1，GAPDH一抗(艾美捷科技有限公司)孵育后，4 ℃过夜。TBST充分洗膜，加入山羊抗鼠二抗(1∶2 000)(艾美捷科技有限公司)室温孵育2 h，TBST清洗后ECL显色液显色照相，通过Image J软件分析蛋白相对表达水平。
1.5 主要观察指标 ①大脑皮质的炎症因子水平；②脑组织含水量；③脑组织损伤程度；④m6A RNA甲基化修饰水平；⑤YTHDF2、JAK1、STAT1的表达水平。
1.6 统计学分析文章统计学方法已经三亚中心医院生物统计学专家审核。使用SPSS 19.0进行分析数据，以x±s表示计量资料，使用方差分析先分析数据整体是否有比较意义，随后用LSD-t法进行两两比较，以P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

坏死性凋亡是颅脑损伤的重要靶点，颅脑损伤初始机制均为创伤导致的级联神经炎性反应以及代谢功能异常，炎性递质表达发生改变，介导胶质细胞迁移活化，神经元变性凋亡。由于炎症反应的复杂和炎症因子的多样性，颅脑损伤后炎症反应与诱发脑水肿和神经细胞死亡具有密切联系[6-8]。
例如颅脑损伤后胶质细胞分泌大量的白细胞介素1β，它可致血脑屏障开放、脑水肿形成和炎性细胞浸润，临床上高水平表达白细胞介素1β的患者往往伴有较高的颅内压，预后也相对较差[9]。颅脑损伤后白细胞介素6的表达水平亦明显增加，它能够破坏脑血管微循环，加速脑水肿的形成，还能引起内皮损伤，加重血脑屏障损害，从而介导神经细胞的死亡[10]。
此次研究中，利用改良Feeney法即自由落体撞击大鼠脑硬膜法成功建立了颅脑损伤大鼠模型[5]。经过脑组织的大体观测和苏木精-伊红染色，观察到创伤性颅脑损伤组中蛛网膜下腔明显出血并出现大面积脑组织损伤，作者还发现建模后脑皮质中不仅白细胞介素6和白细胞介素1β的表达水平显著增加，而且肿瘤坏死因子α、白细胞介素10和HMGB1的表达水平都明显增加，脑含水量明显增多。此次实验关于大鼠颅脑损伤相关炎症因子和脑水肿的实验结果与前人的研究结果一致[11]，表明创伤性颅脑损伤明显促进了神经细胞炎症反应，为进一步发展为坏死性凋亡创造了条件。
m6A是mRNA中最丰富的修饰[12-14]。m6A由其结合蛋白识别并介导其行使功能。YTH结构域家族蛋白YTHDF1-3和含有1-2 的YTH 结构域已被鉴定为哺乳动物中的m6A 结合蛋白[15-16]。YTHDF2识别并破坏含有m6A 的 mRNA，而YTHDF1和YTHDF3调节mRNA翻译并促进蛋白合成[17-18]。由于m6A修饰和YTHDF家族在真核生物中广泛存在，并在各种生物过程中发挥调节作用[19]，因此作者提出m6A结合蛋白可能在m6A 介导的神经细胞凋亡和坏死中发挥关键作用。YTHDF2(属于一种m6A阅读器[20])是m6A的结合蛋白，能够识别mRNA上发生甲基化的碱基位点，通过直接或间接的方式与其结合，从而影响RNA的代谢[21]。YTHDF2能够通过招募CCR4-NOT复合体来降低mRNA的稳定性，加速mRNA的降解。在此次研究中，JAK1-STAT1的表达与m6A修饰的mRNA水平恰好相反，创伤性颅脑损伤中甲基化修饰比例明显低于假手术组，而创伤性颅脑损伤中JAK1/STAT1信号的表达明显增高。有研究发现，降低斑马鱼胚胎中YTHDF2的表达，可以减弱发生m6A修饰mRNA的降解能力，导致合子基因组的激活受阻，细胞周期暂停，影响正常发育[22]。有研究表明，YTHDF2缺失可促使大脑皮质中的神经干细胞发生不对称分裂，使神经前体细胞数量减少，最终分化成熟的神经元数量明显低于正常发育脑组织中的成熟神经元数量，导致大脑皮质发育缓慢且伴随功能异常[23]。说明YTHDF2与中枢神经系统发育过程中的m6A RNA甲基化修饰关系密切，同时发挥重要作用，因此二者在颅脑损伤中同样可能会起到重要作用。有研究已证实，神经祖细胞中神经突触的生长表现为m6A RNA的表达增加，而且与YTHDF2有直接关系[24]。在此次研究中，YTHDF2的mRNA和蛋白水平都在颅脑损伤后显著降低，而且颅脑损伤后总m6A RNA甲基化修饰比例明显降低，推测在颅脑损伤后YTHDF2的表达水平降低与m6A RNA甲基化修饰有关。
最新研究对YTHDF2-/-神经干细胞的m6A甲基组进行了分析，发现JAK/STAT信号的抑制基因有助于神经保护作用[24]。多数情况下，JAK依赖于STAT来调节生理过程[25-26]，因此，STAT蛋白可能在脑组织的转录控制中发挥重要作用[27-28]。
JAK一般分2个亚型——JAK1和JAK2，而STAT有3个亚型——STAT1，2，3[29-30]。据报道，JAK1/STAT1通路在脑颅损伤的早期被激活，p-STAT1从细胞质转移到细胞核[31]。JAK/STAT通路在介导多种细胞命运中发挥重要作用，例如细胞凋亡、分化和增殖，而抑制JAK/STAT信号传导可导致体内异位神经干细胞的分化，表明JAK/STAT的抑制剂类药物可能具有修复神经损伤功能[24，32-33]。在此次研究中，颅脑损伤6 d后脑组织JAK1和STAT1的基因和蛋白水平明显增加，提示颅脑损伤发生后JAK1/STAT1被激活。有趣的是，当在颅脑损伤模型中连续给予6次STAT1抑制剂NSC118218后，明显修复了颅脑损伤的异样并发挥了神经保护作用。在建模后的1-6 d，每日1次注射NSC118218，持续6次，尽管也检测到蛛网膜下腔出血及偶见的一侧脑室少量出血，但较创伤性颅脑损伤组出血量明显减少；而NSC118218可明显促进损伤神经组织的修复，同时减少坏死性凋亡的神经元数量、降低炎症因子水平和脑含水量。此次研究结果进一步证实了创伤性颅脑损伤神经损伤发展依赖于JAK1/STAT1信号通路的激活，说明YTHDF2表达的降低激活了JAK/STAT信号通路。因此，颅脑损伤后总m6A RNA甲基化修饰比例明显降低，YTHDF2表达降低激活了JAK/STAT信号通路，增加了JAK1和STAT1的表达，可促进颅脑损伤后细胞坏死性凋亡的进程。
综上所述，大鼠颅脑损伤可引起脑含水量增加、脑部炎症损伤和神经元坏死，降低m6A RNA甲基化修饰水平，而抑制JAK1/STAT1信号通路可促进损伤神经组织的修复，减少坏死性凋亡，恢复神经元数量和m6A RNA甲基化修饰水平，降低炎症因子水平和脑含水量，通过调控JAK1/STAT1信号通路干预坏死性凋亡进程对治疗颅脑损伤具有重要意义。此次研究为颅脑损伤的基因调控机制、临床颅脑损伤的发生发展及预后的分子机制提供了新的见解，具有重要的理论和现实意义。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程