2.1   实验动物数量分析   30只大鼠随机分为3组，各组大鼠在造模过程中无死亡，均符合造模标准，全部纳入实验。
2.2   各组大鼠的神经功能评分比较   假手术组神经行为学评分为0分；在术后3 h，脑缺血缺氧模型组和HSP70组大鼠的神经行为学评分没有显著变化(P > 0.05)；给药后1，3 d时，HSP70组大鼠的神经功能评分较脑缺血缺氧模型组显著降低(P < 0.05)，见表1。



2.3   各组大鼠氧化应激指标比较    和假手术组相比，脑缺血缺氧模型组丙二醛水平显著升高，超氧化物歧化酶活性显著降低(P < 0.05)；和脑缺血缺氧模型组相比，HSP70组丙二醛水平显著降低，超氧化物歧化酶活性显著提升(P < 0.05)，见图1。



2.4   各组大鼠脑积水含量比较   和假手术组相比，脑缺血缺氧模型组大鼠脑积水含量显著增多(P < 0.05)；和脑缺血缺氧模型组大鼠相比，HSP70组大鼠脑积水含量显著降低(P < 0.05)，见表2。



2.5   各组大鼠脑梗死面积比较   和假手术组相比，脑缺血缺氧模型组大鼠的梗死面积显著增加(P < 0.05)；和脑缺血缺氧模型组大鼠相比，治疗后的HSP70组大鼠脑组织梗死面积显著减少(P < 0.05)，见表2及图2。



2.6   苏木精-伊红染色比较各大鼠脑组织形态变化   假手术组大鼠脑组织细胞分布均匀，且基本无坏死细胞；脑缺血缺氧模型组细胞分布散乱，且数量缺失明显增多，坏死细胞较多；和脑缺血缺氧模型组相比，HSP70组大鼠海马区细胞分布较为均匀，且坏死细胞较少，见图3。



2.7   Western blot检测比较各组大鼠脑组织中血红素氧化酶1蛋白表达   和假手术组相比，脑缺血缺氧模型组大鼠脑组织中血红素氧化酶1蛋白的表达量显著降低(P < 0.05)；和脑缺血缺氧模型组大鼠相比，HSP70组大鼠脑组织中血红素氧化酶1蛋白表达量显著升高(P < 0.05)，见图4。

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目前，缺血性脑疾病人数随着全球老龄化的加剧而不断增加，且患病人群逐渐呈年轻化趋势，在所有缺血性脑疾病患者中急性缺血性脑卒中占比最大，至今仍是临床防治的难题[1-2]。脑组织会因脑动脉血流出现短暂或持续减少而发生缺血缺氧的情况，脑组织缺血会对脑组织的功能造成一定损害[3-4]。急性缺血性脑卒中会引发脑内一系列应激反应的发生，导致脑内出血，进而激活多种应激蛋白，例如血红素氧化酶1和热休克蛋白70(heat shock protein 70，HSP70)等[5-6]。热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是生物体或体外培养细胞在高温或应激情况下产生的一组具有高度保守性的特殊蛋白质[7-8]。在非应激状态下，HSPs有一定的基础表达；在应激条件下，HSPs能迅速合成并成倍增加，以保护机体或细胞免遭有害刺激造成的损伤，促进受损细胞的自身修复，并具有多种生物学功能[9-10]，如可以提高细胞对应激原的耐受性、抗细胞凋亡作用及免疫作用。根据其分子质量大小可以分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSP及泛素等多个亚家族[11-12]。由于HSP70在正常细胞中表达水平较低，在应激状态下可显著升高，因此成为热休克蛋白中最受关注的一种。血红素氧化酶是生物体内催化血红素分解成一氧化碳、铁离子和胆红素的限速酶，广泛存在于人类和哺乳动物的组织内[13-14]，在体内有血红素氧化酶1、血红素氧化酶2、血红素氧化酶3三种形式，血红素氧化酶1为诱导型，主要分布于网状内皮细胞含量丰富的组织中，脾、肝内的含量最高[15-16]。目前有研究认为血红素氧化酶1对组织细胞的保护作用主要是通过抗氧化、抗炎和抗凋亡实现的。有学者研究发现，血红素氧化酶1的表达会因缺血而导致的应激反应发生而增加，从而减轻机体神经元的损伤，同时对体内氧化应激带来的损伤进行抑制，且其在缺血性脑损伤等神经系统疾病中有重要作用[17]。以往研究表明，HSP70参与脑缺血缺氧的发生发展，但其对脑缺血缺氧疾病神经功能及血红素氧化酶1的影响尚不清楚[18]，因而此文旨在探究HSP70对脑缺血缺氧神经功能及脑组织中血红素氧化酶1蛋白表达的影响。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，神经功能等级评分采用秩和检验。
1.2   时间及地点   实验于2020年5-12月在青海大学附属医院实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   清洁级健康雄性SD大鼠30只，体质量250-300 g，均购自常州卡文斯实验动物有限公司，许可证号：SCXK(苏)2016-0003。在恒温的动物房内饲养，大鼠均自由饮水摄食，适应新环境7 d。此次实验符合一般动物实验伦理学原则(2020-016)，实验方案经青海大学附属医院动物实验伦理委员会批准，批准号为GMC201805018。
1.3.2   试剂和仪器   重组腺病毒vAd-HSP70悬液(美国Santa Cruz公司)；血红素氧化酶1蛋白(Bioworld 公司)；β-actin 抗体(上海康成公司)；PVDF膜(Millipore公司)；离心机、电子天平(德国Eppendorf公司)；显微镜、超低温冰箱(日本Sanyo公司)。
1.4   方法   
1.4.1   动物分组与模型建立   按照体质量、性别随机法，将30只大鼠随机分为3组，即假手术组、脑缺血缺氧模型组及HSP70组(脑缺血缺氧大鼠模型加HSP70干预组)，每组10只。腹腔麻醉大鼠，取仰卧位，将四肢固定于手术板上，体积分数75%的乙醇消毒颈部皮肤，颈正中切口，分离右颈总动脉并用丝线永久性结扎，缝合切口并再次消毒皮肤。术后放回鼠笼内2 h进行缺氧处理：将大鼠放入2 000 mL密闭容器，该容器置于37 ℃水浴中，以1.5 L/min的速度输入含体积分数8%氧气和92%氮气的混合气体，持续2 h。实验结束后放回鼠笼内继续饲养。脑缺血缺氧模型组和HSP70组大鼠均按照上述方法制备脑缺血缺氧大鼠模型，大鼠出现明显左旋症状即为造模成功；假手术组大鼠除不进行结扎外，其他步骤同其他两组相同。

造模成功后HSP70组大鼠尾静脉注射0.5 mL重组腺病毒vAd-HSP70悬液(1×1011 PFU/mL)，假手术组和脑缺血缺氧模型组大鼠分别注射等量的生理盐水，每天1次；3组大鼠连续注射3 d后进行后续实验。 

1.4.2   收集指标   依照实验设计，各组大鼠于实验结束后麻醉处死，迅速断头取脑组织，将脑组织置于冰盒上，去掉脑膜、小脑，取出大脑。分离两侧脑组织，左脑组织固定于40 g/L多聚甲醛，右脑组织置于-80 ℃的环境中保存用于蛋白检测。
1.5   主要观察指标   
1.5.1   神经行为学评分   分别测量3组大鼠术后3 h、给药后1，3 d的神经行为学评分。所有大鼠最后测定的评分在1-3分之间被选用进入下一步实验，把没有损伤和损伤太严重的大鼠全部剔除，并予以补充。评分标准：0级为无神经功能缺损；1级为缺血病灶对侧的前肢不能完全伸展；2级为向缺血病灶对侧转圈；3级为向缺血病灶对侧倾倒；4级为不能行走，出现意识障碍。
1.5.2   ELISA检测细胞因子浓度   末次给药后麻醉各组大鼠，经腹主动脉取血，置于抗凝离心管中，3 000 r/min离心10 min，分取血清，-20 ℃保存备用。按照ELISA试剂盒说明书检测大鼠血清中超氧化物歧化酶活性及丙二醛含量。
1.5.3   脑组织水含量的测定   药物处理后，采用干湿质量法检测脑组织含水量。麻醉断头处死大鼠后，沿矢状缝切开，取出脑组织，去掉脑膜、小脑，取出大脑并称质量，即为湿质量；称湿质量后进行烘干并称取脑组织质量，即为干质量。
1.5.4   脑组织梗死面积的测定   末次给药后处死大鼠，取出完整新鲜的脑组织，在-20 ℃的环境中冷藏20 min。取出冷藏后的脑组织，将大脑平均冠状切为6片。为使着色均匀，将脑片放于TTC溶液中，37 ℃温育8 min后翻面再孵育10 min，其中梗死区呈白色，正常脑组织为红色。拍照后，用软件分析大鼠的脑组织图像，并且对正常区域和梗死区域的面积进行测定。
1.5.5   脑组织病理学形态观察   各组大鼠灌注取左脑组织，动脉夹夹闭腹主动脉，经左心室插入灌流针并固定，剪开右心耳；先快速灌流生理盐水10 min，再用40 g/L多聚甲醛灌流20 min。灌流后大脑较正常大脑发白变硬为灌流成功。取脑后，切取视神经根部与脑四叠体之间的部分，行苏木精-伊红染色，置于显微镜下观察。放入40 g/L多聚甲醛中固定，4 ℃保存备用。固定后的脑片经脱水、包埋等步骤后，制成石蜡连续切片，取连续的2片，厚度为4 μm，进行苏木精-伊红染色后，显微镜下观察。
1.5.6   Western blot检测大鼠血红素氧化酶1蛋白的表达   取出大鼠的右脑组织50 mg，用蛋白裂解液提取总蛋白，1 200 r/min离心5 min，采用CBA法测定蛋白浓度。每孔以50 μm蛋白样品上样，经SDS-PAGE电泳分离，将电泳版内的蛋白样品全部转到PVDF膜上，在PVDF膜上加入脱脂奶粉封闭，时长为1 h。在加入一抗(1∶500)前，用TTBS溶液进行洗涤漂洗后再把二抗(1∶1 000)加入，稀释后封闭1 h。最后把PVDF膜取出后，用TTBS溶液再次漂洗，DAB溶液显示后观察。
1.6   统计学分析   文章统计学方法已经青海大学附属医院生物统计学专家审核。采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料以x±s表示；多组间比较采用单因素方差分析；两两比较采用LSD-t检验；神经功能等级评分采用秩和检验，以P < 0.05为差异有显著性意义。

缺血性脑血管病是严重危害人类健康的常见病与多发病[19-20]。随着人们生活水平提高和人口老龄化加剧，缺血性脑疾病的发病率也不断上升，不仅影响患者的生活和社会能力，也给家庭和社会带来沉重负担。有研究显示，脑组织发生缺血缺氧时，损伤脑组织氧化防御系统，打破产生氧自由基和清除氧自由之间的平衡，让体内累积大量活性氧，进而导致体内发生氧化应激反应[21-22]。虽然目前虽然对脑血管疾病、脑缺氧性损伤及继发性脑损害的研究已涉很多方面，但由于其发病机制较复杂，至今仍无理想的治疗药物。热休克蛋白是生物体或体外培养细胞在热刺激、缺血缺氧、病毒感染、创伤等应激条件下产生的一组特殊蛋白质，其在细胞对应激原的耐受性、细胞凋亡、免疫应答中有重要作用[23-24]。此次研究采用较为传统的脑缺血缺氧模型[25]，大鼠脑组织的颈内动脉和椎动脉在大脑底部形成Willis环，单纯结扎一侧动脉不能造成理想的缺血缺氧病变，只有同时缺氧才能在结扎侧大脑形成缺血缺氧改变。大鼠脑组织的血供和人类相似，因此该模型适用于研究人类脑缺血缺氧。

HSP70对脑缺血缺氧后神经细胞有一定保护作用，增加神经细胞的存活率，同时促进受损细胞的恢复，其机制是通过抗细胞凋亡、坏死，抗蛋白凝聚等作用来实现的[26-27]。此次实验研究结果显示，脑缺血缺氧模型组大鼠的神经功能评分升高，脑积水量和脑梗死的面积均显著增大，HSP70组大鼠的神经功能评分明显降低，脑积水量和脑梗死的面积明显减小，提示HSP70可通过降低神经功能评分、减少脑组织积水量及梗死面积来改善缺血缺氧脑组织损伤。祝淑贞等[28]研究发现，神经细胞结构会受到短暂性脑缺血的影响，同时会增加缺血区HSP70的表达，脑组织发生梗死后，会产生缺血耐受，并且会受到缺血预处理的诱导，从而导致HSP70发生改变，缺血耐受也会因此而产生，可见HSP70会有效提高神经细胞的耐受能力。赵宗刚等[29]研究证实，脑组织发生梗死时HSP70的表达会受到一定的影响，可见HSP70的表达和脑梗死的严重程度密切相关。由此提示，HSP70的表达在基础状态和氧化应激状态下都显著升高，进而保护神经元。氧化应激是脑缺血缺氧性损伤的重要病理机制之一[30-31]，正常情况下，机体的氧化与抗氧化之间处于动态平衡；当缺血缺氧时，导致大量活性氧聚集，对生物膜形成破坏作用，引起神经细胞坏死和凋亡，加重脑组织的损伤[32-33]。机体自由基和脂质过氧化产物增多，在一定程度上机体的抗氧化酶也会增多来清除过多的氧自由基，主要有超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、丙二醛等[34-35]。此文检测了丙二醛水平和超氧化物歧化酶活性，结果显示脑缺血缺氧大鼠超氧化物歧化酶活性降低，丙二醛水平增加；HSP70干预后大鼠超氧化物歧化酶活性升高，丙二醛表达得到抑制，提示HSP70对脑缺血缺氧大鼠体内氧化应激水平有明显调控作用，进而保护脑组织。夏洁等[36]通过对氧化应激反应的研究发现，在正常的细胞内，氧自由基的产生和清除应保持平衡，而这种平衡受到氧化应激会遭到破坏，说明活性氧族发生损伤是导致细胞损伤的主要因素。ZHANG等[37]研究表明，HSP70可显著抑制体内氧化应激反应，和此次研究得出的结论一致。

近年来研究发现血红素氧化酶1(HSP32)是热休克蛋白家庭成员之一，属于小分子量HSP家族，能稳定细胞组织蛋白、线粒体膜及细胞膜，减轻神经细胞损伤，在正常组织中几乎不表达[38-39]。血红素氧化酶1及其代谢产物的产生作为一种对伤害性刺激的适应性和保护性反应，在多种疾病的病理生理过程及防治方面起积极作用，这些作用与血红素氧化酶1及其代谢产物广泛参与抗氧化应激、抗炎症损伤、抗细胞增殖、抗凋亡及细胞内信号传递等过程有关[40-42]。此次实验通过蛋白质印迹法检测脑缺血缺氧性脑组织中血红素氧化酶1蛋白表达，结果显示脑缺血缺氧大鼠脑组织中血红素氧化酶1蛋白表达显著降低，HSP70组大鼠中血红素氧化酶1蛋白的表达明显增加，提示HSP70可促进血红素氧化酶1蛋白表达，降低脑组织的氧化应激损伤，进而对缺血缺氧大鼠的脑组织发挥保护作用。DUKAY等[43]通过对急性局灶性脑缺血大鼠研究发现，HSP会有效减少脑组织的梗死面积，从而对缺血脑组织进行早期保护。

综上，HSP可有效降低缺血缺氧大鼠的氧化应激损伤，提高神经功能，改善脑梗死面积及脑积水含量，其作用机制可能与提高血红素氧化酶1蛋白表达有关。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
热休克蛋白：是生命体在高温、发热、缺血、缺氧、病毒感染及炎症等不良环境因素作用下产生的一组蛋白质，能保护机体或细胞不受或少受伤害，这一反应过程称为热休克反应。热休克蛋白70对脑缺血缺氧后神经细胞有一定保护作用，可增加神经细胞的存活率，同时促进受损细胞的恢复。
血红素氧化酶1(热休克蛋白32)：是热休克蛋白家庭成员之一，属于小分子量热休克蛋白家族，能稳定细胞组织蛋白，稳定线粒体膜及细胞膜，减轻神经细胞损伤，在正常组织中几乎不表达。血红素氧化酶1及其代谢产物的产生作为一种对伤害性刺激的适应性和保护性反应，在多种疾病的病理生理过程及防治方面起积极作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

急性缺血性脑卒中会引发脑内一系列应激反应的发生，导致脑内出血，进而激活多种应激蛋白，例如血红素氧化酶1和热休克蛋白70(HSP70)等。热休克蛋白是生物体或离体培养细胞在高温或应激情况下产生的一组具有高度保守性的特殊蛋白质。由于HSP70在正常细胞中水平较低，在应激状态下可显著升高，因此成为热休克蛋白中最受关注的一种。血红素氧化酶是生物体内催化血红素分解成一氧化碳、铁离子和胆红素的限速酶，广泛存于人类和哺乳动物的组织内。目前研究认为血红素氧化酶1对组织细胞的保护作用主要是通过抗氧化、抗炎和抗凋亡实现的。有学者研究发现，血红素氧化酶1的表达会因缺血而导致的应激反应发生增加，减轻机体神经元的损伤，同时对体内氧化应激带来的损伤进行抑制，且其在缺血性脑损伤等神经系统疾病中有重要作用。以往研究表明，HSP70参与脑缺血缺氧的发生发展，但其对脑缺血缺氧疾病神经功能及血红素氧化酶1的影响尚不清楚，此文旨探究HSP70对脑缺血缺氧神经功能及组织中血红素氧化酶1蛋白表达的影响。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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