2.1   大鼠成骨细胞原代培养   原代成骨细胞大多呈梭形且有多个长的胞浆突起，细胞核较大呈圆形或椭圆形，后期向成纤维化细胞形态发展，见图1A。第2代细胞形态多样，呈梭形、菱形、多边形或不规则形状，见图1B。第3代细胞呈梭形或不规则的多角形，见图1C，第3代的细胞成骨细胞典型特征明显，故后续实验选取稳定性和均一性较好的第3代细胞作为观察对象[18]。



2.2   SAW-A和SAW-B对成骨细胞的毒性分析   结果显示，用不同质量浓度SAW-A、SAW-B干预成骨细胞后，SAW-A的最大无毒质量浓度为312.50 mg/L，SAW-B的最大无毒质量浓度156.15 mg/L，详见图2。SAW-A的IC50值为1 009 mg/L，SAW-B的IC50值为554 mg/L。



2.3   SAW-A、SAW-B对成骨细胞凋亡的影响    结果显示，经SAW-A、SAW-B干预后，成骨细胞的凋亡率下降(P < 0.001)，提示SAW-A和SAW-B具有抑制成骨细胞凋亡的作用，其中SAW-B组的凋亡细胞最少，详见图3。



2.4   SAW-A、SAW-B对碱性磷酸酶活性的影响   结果显示，SAW-A、SAW-B组染色区域明显增大，且SAW-B组更明显，说明SAW-A和SAW-B均可提高碱性磷酸酶活性，详见图4。



2.5   成骨细胞钙化结节染色结果   与对照组相比，经SAW-A、SAW-B干预后细胞中钙化结节的数量和面积明显增多，且SAW-B干预组更明显，说明SAW-A、SAW-B均可促进成骨细胞向成骨分化，详见图5。



2.6   SAW-A、SAW-B对成骨细胞增殖的影响   结果显示，与对照组相比，SAW-A、SAW-B均可显著促进成骨细胞的增殖，作用在48 h及72 h尤为明显(P < 0.05)，且SAW-B的作用要强于SAW-A，详见图6。



2.7   SAW-A、SAW-B对成骨细胞分化基因表达的影响   结果显示，与对照组相比，SAW-A、SAW-B处理后，成骨细胞分化基因RUNX2、骨涎蛋白、骨钙蛋白和Ⅰ型胶原蛋白A1相对表达量均明显上升(P < 0.05-0.01)，并且SAW-B对骨涎蛋白和Ⅰ型胶原蛋白A1基因表达的促进作用强于SAW-A，详见图7。

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骨质疏松是一种骨形成和骨吸收动态失衡导致的代谢性骨疾病[1]。该病与年龄呈正相关，目前国内人口老龄化日趋严重，骨质疏松症已成为一个公共健康问题[2-4]。骨质疏松性骨折是老年患者致残和致死的主要原因之一，有研究表明，髋部发生骨折后1年之内，20%患者死于各种并发症，有50%患者因致残生活质量显著降低，造成家庭和社会的负担[5-6]。在骨骼组织微环境中，成骨细胞和破骨细胞的动态平衡维持着骨骼的稳态和重塑。成骨细胞主要负责骨形成，而破骨细胞主要负责骨吸收，健康状态下，二者的功能和活性处于平衡状态[7]。当成骨细胞的数量不足或者功能有障碍时，将出现骨吸收量高于骨形成量的情况，导致骨质流失骨密度减少、矿物质含量降低、骨骼脆性升高，导致骨质疏松，进而增加骨折的风险[8]。成骨细胞是骨形成时的重要功能细胞，成骨细胞的矿化是骨形成的早期标志，所以促进成骨细胞的增殖、分化和矿化，有利于改善成骨细胞的功能，对促进骨形成有重要意义，是防治骨质疏松的有效途径。目前临床上骨质疏松的治疗方案主要是使用双膦酸盐和降钙素类药物来抑制破骨细胞的活性，使骨吸收进程减慢，但是长期应用会导致破骨细胞处于“无应答”状态，临床效果不尽人意[9-10]。近年来以增强成骨细胞的活性进而加快骨形成的方法引起学者注意，有望成为理想的治疗方法[11]。

斯赤列(Sambucus adnata Wall.)为忍冬科接骨木属植物，干燥地上部分或全草，又名血满草、接骨药、接骨丹、大血草等，主要分布于云南、四川等地，具有活血散瘀、祛风除湿的功效，用于治疗骨折、跌打损伤等[12-14]。《云南中草药》中有记载：鲜斯赤列全草适量，捣烂，加酒或开水调敷可治骨折[15]。作者所在课题组前期从斯赤列中分离得到三萜类、黄酮类、木脂素等类型成分[16]，前期实验结果显示，斯赤列水提取物和75%乙醇提取物具有促进大鼠骨折愈合、减轻炎症及缓解疼痛的作用；活性物质基础研究表明，斯赤列的水提取物(SAW-A)和二氯甲烷提取物(SAW-B)为斯赤列治疗骨折的活性部位，但这两个活性部位是否具有促进成骨细胞增殖、分化作用尚不清楚，故进行了此次实验研究，现将结果报告如下。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   细胞学观察实验，计量数据组间比较采用单因素方差分析，方差齐者采用LSD或Tukey分析。
1.2   时间及地点   实验于2020年10-12月在云南中医药大学国家中医药管理局科研三级实验室中药药理实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   SD孕鼠若干只，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK(湘)2019-0004，在云南中医药大学动物实验室[许可证号：SYXK(滇)K2017-0005]饲养，实验操作符合云南中医药大学实验动物伦理学要求，审批号：R-06202009。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2   主要试剂与仪器   斯赤列植物2020年8月采于云南省曲靖市马龙区，经云南中医药大学普春霞副教授鉴定为斯赤列的干燥全草，由云南中医药大学化学实验室进行提取、备用。XMC-A、B；0.25%胰蛋白酶、青霉素/链霉素(美国Millipore公司)；体积分数75%的乙醇(西陇化工股份有限公司)；Ⅱ型胶原酶(美国Worthingtong)；胎牛血清(美国Gibco公司)；DMEM培养基(美国Hyclone公司)；CCK-8试剂盒(日本同仁研究所)； PBS、2%茜素红染色液、BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(索莱宝公司)；二氯甲烷(天津市风船化学试剂科技有限公司)；FDA/PI双染细胞活力检测试剂盒(上海泽叶)；引物(擎科生物)；Trizol(德国MRC公司)；SYBR Green Master with Rox、All-in-OnetmFirst-Strand cDNA Synthesis Kit(广州Genecopoeia，Inc)；超净工作台(美国AIRTECH公司)；CO2培养箱(美国Thermo公司)；流式仪(美国Millipore公司)；倒置显微镜(Motic公司)；定量PCR仪(美国应用生物系统公司)。
1.4   方法   
1.4.1   受试物SAW-A和SAW-B的制备   称取斯赤列样品100 g，置具塞锥形瓶中，加水50 mL，超声提取2次，每次1 h，抽滤，合并滤液减压浓缩得浸膏，所得浸膏经冷冻干燥后即得斯赤列水提物(SAW-A)样品(1.5 g，提取率为1.5%)。

称取斯赤列样品100 g，置具塞锥形瓶中，加二氯甲烷50 mL，超声提取2次，每次1 h，抽滤，合并滤液减压浓缩得浸膏，所得浸膏经冷冻干燥后即得斯赤列二氯甲烷提取物(SAW-B)样品(2.0 g，提取率为2.0%)。上述样品置于4 ℃冰箱保存、备用。
1.4.2   大鼠成骨细胞分离与培养   将新生SD大鼠用体积分数75%的乙醇浸洗，在超净操作台内解剖取出颅骨，去除其他组织后剪成1 mm×1 mm×1 mm大小组织块，组织块放入无菌离心管中并加入0.25%的胰蛋白酶在37 ℃下消化30 min，离心弃去上清液，加入2 g/mL Ⅱ型胶原酶在37 ℃下消化4 h，再次离心弃去上清液，加入体积分数为10%胎牛血清和1%抗生素混合物的DMEM培养基，调整细胞浓度为5×106 L-1，将细胞悬液接种于100 mm培养皿，每皿接种10 mL，置于37 ℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，1 d后更换培养基，弃未贴壁细胞，之后每3 d换液；待细胞基本融合后，用胰酶消化，以1∶2比例传代之后继续培养，选取生长良好的第3代成骨细胞进行下列实验。

1.4.3   CCK-8检测   取第3代对数生长期的成骨细胞以5×103 个/孔接种于96孔培养板，培养24 h后更换分别含有SAW-A或SAW-B(78.125-20 000 mg/L)的L-DMEM培养基干预培养，受试物干预48 h后，进行CCK-8检测SAW-A和SAW-B的细胞毒性。确定两受试物的最大无毒浓度后，另取成骨细胞以5×103 个/孔接种于96孔细胞培养板内，各组细胞均同时设置3个复孔。分别加SAW-A和SAW-B干预24，48，72 h后，进行CCK-8检测。酶标仪测定450 nm处的吸光度值。
1.4.4   流式细胞仪检测   取第3代对数生长期成骨细胞以2×104 个/孔接种于6孔培养板，培养24 h后，分别加SAW-A(312.50 mg/L)和 SAW-B(156.15 mg/L)干预培养6 d，消化细胞，PBS洗3遍，将爬片置入FDA/PI混合液(FDA与PI工作终浓度分别为100，400 mg/L)中，避光染色5 min，流式细胞仪检测细胞活性。对照组为正常培养7 d的成骨细胞，实验方法同上。
1.4.5   碱性磷酸酶染色   取第3代对数生长期成骨细胞以2×104 个/孔接种于6孔培养板，培养24 h后，更换含不同质量浓度SAW-A和SAW-B的L-DMEM培养基，SAW-A的质量浓度为312.50 mg/L，SAW-B的质量浓度为156.15 mg/L，干预培养6 d，取出细胞爬片，PBS洗3遍，4 ℃下40 g/L多聚甲醛固定30 min，再次用PBS清洗3次，每次3-5 min。清洗完毕后，去除洗涤液，加入适量BCIP/NBT染色工作液，确保能充分覆盖样品，室温避光孵育5-30 min，显色至预期深浅后去除BCIP/NBT染色工作液，用蒸馏水洗涤2次，在光学显微镜下观察并拍照。对照组为正常培养7 d的成骨细胞，实验方法同上。
1.4.6   钙化结节(茜素红法)染色   取第3代对数生长期成骨细胞以2×104 个/孔接种于6孔培养板，24 h后，分别加SAW-A(312.5 mg/L)和SAW-B(156.15 mg/L)干预细胞；干预6 d后，取出细胞爬片，PBS洗3遍，4 ℃下40 g/L多聚甲醛固定30 min，然后用ddH2O清洗3次，每次3-5 min。清洗完毕后，将水完全吸干净，慢慢加入茜素红染色液，染色20-30 min，ddH2O洗3-5次，每孔加入适量ddH2O防止孔内干燥，光学显微镜下观察并拍照[17]。对照组为正常培养7 d的成骨细胞，实验方法同上。
1.4.7   实时荧光定量PCR(qPCR)   取第3代对数生长期成骨细胞以2 × 104 个/孔接种于6孔培养板，培养24 h后，分别加SAW-A(312.50 mg/L)和SAW-B(156.15 mg/L)干预细胞6 d后，总RNA提取采用Trizol法，PCR过程及相关程序操作参考说明书，相关引物序列见表1，进行实时荧光定量PCR检测成骨相关基因RUNX2、骨涎蛋白、骨钙蛋白和Ⅰ型胶原蛋白A1，采用 2-ΔΔCt 法并以β-actin为内参计算基因相对表达量。对照组为正常培养7 d的成骨细胞，实验方法同上。 

1.5   主要观察指标   ①成骨细胞的选取；②SAW-A和SAW-B的细胞毒性；③成骨细胞活性分析；④成骨细胞碱性磷酸酶活性分析；⑤成骨细胞茜素红染色情况；⑥成骨分化相关基因的表达。

1.6   统计学分析   文章统计学方法已经云南中医药大学生物统计学专家审核，采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，方差齐采用LSD或Tukey分析，P < 0.05为差异有显著性意义。

彝族是中国西南地区最古老和人口最多的少数民族之一，彝族人民在长期医疗实践中创立了独具民族和地域特色的民族医药。斯赤列是彝医治疗风湿痹痛、跌打损伤等骨病的常用药物，在云南彝族聚居地区药物资源非常丰富。现代研究显示，斯赤列所含的槲皮素、木犀草素、咖啡酸乙酯等成分具有抑制血管紧张素转换酶抑制及抗炎、镇痛等生物活性[19-21]。作者所在课题组前期对斯赤列抗骨质疏松作用及物质基础的研究中发现，斯赤列提取物具有明显改善骨质疏松的作用。相关活性研究结果表明SAW-A、SAW-B是斯赤列抗骨质疏松的活性部位，但两个提取部位的作用机制尚不清楚，此次研究结合成骨细胞增殖分化在改善骨质疏松中的重要作用，故对SAW-A、SAW-B对成骨细胞增殖分化的作用进行了研究。

成骨细胞由骨髓间充质干细胞分化而成，参与骨形成和调控破骨细胞功能进而影响骨吸收，促进成骨细胞增殖与分化，改善骨的动态平衡，是预防和治疗骨质疏松的重要手段[22-23]。碱性磷酸酶主要由成骨细胞分泌，其活性的提高是骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的重要标志[24]，可反映成骨细胞的活性及状态，因此碱性磷酸酶是评价骨形成和骨转换的最常用、最经典的生化指标之一。矿化是细胞内钙盐的直接反映，钙盐形成越多则成骨分化越活跃[25]。碱性磷酸酶和钙化结节可分别作为成骨分化早期和晚期的标志，此次实验以这2个指标评价了SAW-A、SAW-B对成骨细胞增殖分化的影响。实验通过对成骨细胞用SAW-A、SAW-B进行干预，结果显示，二者具有明显促进成骨细胞增殖的作用，流式细胞仪分析结果显示二者具有抑制成骨细胞凋亡的作用(P < 0.001)。给予SAW-A、SAW-B干预后对细胞进行碱性磷酸酶染色和茜素红染色，结果均呈阳性，与对照组相比，两种活性部位均可提高碱性磷酸酶活性及促进钙化结节形成的作用，提示它们可促进成骨分化，同时抑制成骨细胞的凋亡。RUNX2被认为是早期激活成骨细胞分化和去分化的特异性转录因子，在成骨分化的多种信号中起到了中心作用，参与多种信号途径的，有研究已证实敲除RUNX2基因会导致小鼠的骨形成明显减少，甚至出生时会因呼吸衰竭而死亡[26-27]。此外RUNX2通过直接或间接调节众多的成骨细胞相关基因来调节成骨细胞分化，其表达增加能够刺激干细胞向成骨细胞分化[28-29]。而骨钙蛋白是RUNX2的下游转录因子，在骨细胞的成熟、形态和功能中起着重要作用；此外骨钙蛋白还是成骨细胞活性、组织矿化的重要指标，骨钙蛋白的表达是骨形成晚期高度特异性的成骨细胞标志物[30]。骨涎蛋白、Ⅰ型胶原蛋白A1均是骨形成过程中起关键调节作用的重要因子，近几年研究均表明其高表达与成骨分化成正相关，很多研究将骨涎蛋白、Ⅰ型胶原蛋白A1当成成骨细胞的标记物[31-33]。通过此次实验的研究，结果表明SAW-A和SAW-B均可上调RUNX2、骨钙蛋白、骨涎蛋白和Ⅰ型胶原蛋白A1的基因表达(P < 0.05)，其中对骨涎蛋白和Ⅰ型胶原蛋白A1基因表达的促进作用SAW-B强于SAW-A(P < 0.05)，以上实验结果提示，彝药斯赤列的活性部位SAW-A和SAW-B可通过促进成骨细胞增殖、分化和成熟相关基因的表达，促进成骨细胞的增殖和分化，这可能是两个活性部位调节成骨细胞/破骨细胞动态平衡的机制之一，此次实验的结果也提示，从活性差异上来看成，SAW-B的活性要强于SAW-A。

此次实验结果证实，彝药斯赤列中的活性部位SAW-A、SAW-B均具有明显促进成骨细胞增殖与分化的作用，它们的作用机制有待进一步深入研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
斯赤列：为忍冬科接骨木属植物血满草(Sambucus adnata Wall.)，干燥地上部分或全草入药，又名血满草、接骨药、接骨丹、大血草等，主要分布于云南、四川等地，为云南彝族、傣族等多个民族习用药物。其提取物中主要含有三萜、非类固醇等类型成分，具有抑制血管紧张素转换酶及抗炎、镇痛等生物活性，彝族人民习用其治疗风湿痹痛、跌打损伤等。
成骨细胞分化：包括细胞外基质的合成、矿化、成熟，整个过程中成骨细胞特异性地合成一些蛋白，参与细胞外基质的合成矿化、成熟。成骨细胞的分化能力是骨形成的关键，在骨重建过程中，成骨细胞主导的骨生成结束为骨重建周期终结的标志。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

骨质疏松是一种骨形成和骨吸收动态失衡导致的代谢性骨疾病。该病与年龄呈正相关，目前我国人口老龄化日趋严重，骨质疏松症已成为国内面临的公共健康问题。骨质疏松性骨折是老年患者致残和致死的主要原因之一，有研究表明，髋部发生骨折后1年之内，20%患者死于各种并发症，有50%患者因致残生活质量显著降低，造成巨大的家庭和社会负担。在骨骼组织微环境中，成骨细胞和破骨细胞的动态平衡维持着骨骼的稳态和重塑。成骨细胞主要负责骨形成，而破骨细胞主要负责骨吸收，健康状态下，二者的功能和活性处于平衡状态。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

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