利用免疫荧光染色，观察了距股骨髁近端20 cm坐骨神经，1 cm各断面神经束的数目和性质。阳性对照选取纯运动神经束(腓深神经肌支)，经Anti-HB9/HLXB9 Antibody特异性染色，放大50倍镜下观察显示神经纤维内均有特异性染色，见图1C；阴性对照选取纯感觉神经束(腓肠神经)，经Anti-HB9/HLXB9 Antibody特异性染色，观察显示神经纤维内没有特异性染色，见图1D。而实际的人坐骨神经样本，区别于坐骨神经内运动神经束及其他神经束，观察发现，此段坐骨神经内大部分纤维束均有特异性染色，小部分未被染色，此段坐骨神经纤维束由被特异性染色的纯运动神经束、混合神经束及纯感觉神经束组成，见图1E，坐骨神经神经束的数量总共有50束。 

标本的坐骨神经平面位于大腿中段，坐骨神经在大腿中部该横切面的神经纤维束数目较多；纤维交叉较频繁，由于重建坐骨神经长度为1 cm，该段坐骨神经纤维束形态、大小变化频率不高；以混合束为主。神经束数目较大腿上部减增多。该横切面总共有50个神经束，其中运动及混合神经束44个，感觉神经束6个，神经束断面形状无规律，见图1F。



2.2   通过CINEMA 4D软件三维立体重建人坐骨神经可视化   运用CINEMA 4D软件进行三维重组，重建人坐骨神经三维形态。根据假设，神经纤维束可看作管道结构，该管道的表面是由球心沿着中轴线的球包络滚动而成。用管道沿着横断面连续切片，获得该管道的某一段结构的连续200张平行切片，利用显微成像技术将管道横断面保留为可处理图像，记录管道与切片的多组信息，图像按照切片的先后顺序依次命名为0-199.bmp，为方便数据导入和图像编辑，均保留成BMP格式，分辨率宽和高均为512 pixel。每个球的半径固定；切片间距以及图像象素的尺寸均为1[13-14]。取垂直于切片的坐标系为Z轴，平面Z=0代表第1张切片，以此类推，平面Z=199代表第200张切片，那么，坐标所代表的Z=z切片在文件中的先后次序为：(-256，-256，z)，(-256，-255，z)，…(-256，255，z)，(-255，-256，z)，(-255，-255，z)，…(-255，255，z)。

按照之前的假设，管道是由一组等径的圆球，其圆心按中轴线滚动所形成的包络。每张切面与中轴线有且仅有一个交点，并且这个交点就是切片图像上最大内切圆的圆心，也就是球心的位置。因此，所要寻找的中轴线与半径，就是找图像中最大内切圆的圆心和半径，其解决方案就是求任意一个骨架上的点到所有轮廓点的最小距离，再取所有骨架点对应的最小距离的最大值，此最大值即最大内切圆的半径，对应的点即为最大内切圆的圆心。求出了最大内切圆的半径和球心后，通过拟合的方式来获取中轴线的图像，将最大内切圆的半径取平均值，得到管道半径。在计算得到最大内切圆的球心和半径的基础上，通过拟合的方式获得中轴线的图像，再根据CINEMA 4D软件排列平面的投影图。

按照以上思路，200张切片的最大内切圆圆心坐标及半径，结合体质量的信息，中轴线的z轴从1-200，得到中轴线在空间中的坐标。放样制作得到管道模型。

此次用创建神经管道的模型，主要应用到放样命令的操作。整个神经模型就应用不同切片路径，按照一定到等比间隙进行排列，依次链接，形成某段神经到重建复原。

打开CINEMA 4D导入切面图转化来到路径，将该路径转换为可编辑多边形，按照一定到等比间隙进行排列，依次链接，内部及轮廓做一个组，见图2A。

先选取内部所有轮廓，在快捷菜单栏展开中找到“放样”工具，将轮廓线处于放样的子级中。工作区即可看到一个生成的实体模型，将运动纤维及混合纤维识别出并进行重新建，见图2B。同理生成没有被抗体特异性结合的感觉纤维，见图2C。同理生成此段坐骨神经内部的滋养血管，见图2D。此模型为实体模型无法看到内部结构，对该层赋予半透明材质，点击材质求，对参数进行调节，包含颜色，半透明，在透明图层上加上噪波纹理，使其更加具有真实感，见图2E。将得到的2组模型拼合到一起，配合灯光，见图2F；调节好渲染参数进行渲染，得到效果，见图2G。

将200张切片的二维图像按照上述方法处理后根据软硬定位重建1 cm坐骨神经内部结构，见图3A；单独重建的坐骨神经内部运动、混合神经纤维，见图3B；单独重建的坐骨神经内部感觉神经纤维，见图3C；单独重建的坐骨神经内部滋养血管，见图3D。

分别将单独重建的运动、混合神经纤维、感觉神经纤维及滋养血管按照原始空间比例组合成坐骨神经内部的三维立体结构，渲染神经比邻软组织逐张扫描、顺序存储输入计算机坐骨神经横断面二维信息，见图3E，F，利用CINEMA 4D软件逐张系统的进行排序、设置原点、比对、定位、匹配和合成；根据被Anti-HB9/HLXB9 Antibody特异性染色的神经束将坐骨神经内部不同类型的神经束及其功能进行区分，清晰准确地呈现各种类型神经束的三维结构；此外，CINEMA 4D软件能实现任意角度的旋转和不同平面的裁剪，较好地重建坐骨神经中各个神经束的三维立体结构，指导临床上对坐骨神经的手术操作以及模拟术后的恢复效果。将神经束简化为一条条中心线，可清楚观察神经束交叉重组的复杂结构。从三维重建的结果可以看到，此段坐骨神经标本出现错综复杂的交叉重组，最短的间隔0.04 mm出现了神经束的交叉，这可能与坐骨神经发出胫神经及坐骨神经支有关。运用CINEMA 4D三维可视化软件建模分析，重建坐骨神经内部神经束，结合免疫荧光染色，区分运动、混合神经束和感觉神经束。

人类坐骨神经来源于L4-L5神经和S1-S3神经根，出椎间孔后途经骨盆，并自坐骨大孔穿出，抵达臀部，然后沿大腿后面下行到腘窝上方，可分为胫神经和腓总神经[1]。坐骨神经直径粗、行程长、走行复杂，不易与周围组织分辨，易损伤；其内部神经立体结构交错复杂，神经功能束的相对位置在短距离内就会转变走向，其形态变化较大，很难借助常规的影像学方式获得坐骨神经内部纤维结构图像[2]，因而坐骨神经损伤的诊断和治疗是骨科临床研究的重难点之一。研究一种将神经内部不同功能束区分开并精确重建的方法，为后期探究功能束走向规律及外科精准治疗有着重大的临床意义。

早在20世纪40年代，英国的Sunderland大学通过解剖神经结合组织学的方法，制作出神经束在神经断面中分布的二维图像[3]。在臂丛神经，各神经束的组成多样，神经纤维的立体结构纵横交错，功能交叉混合，目前利用MRI、电子计算机断层扫描脊髓造影等影像诊断技术，得到的臂丛神经结构比较模糊，在临床诊断上无法精确判断[4]。WATCHMAKER等[5]使用三维重建实现内部神经结构可视化，获取了人前臂远段和手正中的神经结构，利用苏木精-伊红染色获得组织形态，通过三维重建清晰定位神经干内部的纤维结构，获得可视化资料，研究神经束的功能特征。张元智[6]将薄层断面图像与实际的神经切片配准切割，对臂丛神经的实际组织图像应用Amira 3.1软件进行面与体的三维重建，将臂丛神经内部结构用可视化三维模型展现出来，使臂丛神经的解剖结构较清晰完整地显示出来，也获取重建后的臂丛神经束与C4-T2椎体、右椎动脉、颈总动脉和锁骨下动脉的相对位置图像。陈增淦等[7]取健康成年人尸体的坐骨神经1例，以4根女性头发作定位标记，OCT包埋冷冻后行等距超薄切片，组织切片厚度参数为10 μm，切片间距为0.25 mm，共连续收集750张组织切片，经乙酰胆碱酯酶组织化学染色后，转化为数字图像拼接后，二维全景放大100倍采集图像信息；镜下观察神经束变化规律，人工判断功能束性质，图形处理软件配准分割后，利用3D nerve软件进行三维重建，使坐骨神经束内部的纤维结构实现可视化，较真实再现内部功能束组的三维立体行径，精确展示了坐骨神经的神经束断面、分布和走行。

组织连续切片后的计算机三维重建方法开始流行。首先，将获得的坐骨神经固定包埋后连续切片，切片染色前的图像作为参考，染色后的图像作为特异性识别信息，导入计算机图像处理，利用三维合成软件重建立体坐骨神经结构和神经束相对位置。重建后的神经结构可任意旋转，虚拟神经切割，观察和测量内部各个功能束组切割后的相对位置。目前，基于连续组织切片和计算机模拟技术的三维重建体系[8-9]，建立了多部位周围神经三维重建可视化模型，可多维度、多方位展示周围神经的复杂内部结构，实现任意旋转、缩放、交互观察和适时三维检测神经内部的纤维结构，为周围神经的解剖教学和科研探究提供了新素材和理念，为临床影像诊断和治疗方案选择提供了明确指导和依据[10-11]。

此次研究基于人坐骨神经连续切片和免疫组化、荧光染色区分功能束后采集的二维图像，经CINEMA 4D软件后期处理，得到人坐骨神经内部神经束的三维立体图像，重建坐骨神经内部神经纤维三维结构，可视化神经束的纤维结构，探索周围神经可视化的方法，有助于了解坐骨神经纤维的交叉重组走行规律，指导临床坐骨神经的修复治疗。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   三维重建可视化解剖学实验。
1.2   时间及地点   实验于2019年10月至2021年9月在四川大学华西医院科技园完成。
1.3   材料

实验材料：人坐骨神经标本来源于大腿中上段截肢的65岁男性患者，患者股动脉闭塞需行大腿中上段截肢，术前已签订知情同意书。该研究方案的实施符合《赫尔辛基宣言》和西藏自治区人民政府驻成都办事处医院对研究的相关伦理要求，医院伦理批件号：(2019)年科研第19号，审批时间：2019-05-23。

实验试剂：多聚甲醛、二甲苯、无水乙醇、乙醇、双氧水、苏木精、伊红、中性树脂、玻片、EDTA(pH 8.0)抗原修复液、D-PBS缓冲液、DAPI、抗荧光封固剂、BSA、鼠抗人荧光一抗Anti-HB9/HLXB9 Antibody、Cy3-山羊抗兔荧光二抗。

实验仪器：组织脱水机、生物组织包埋机、石蜡切片机、组织摊片烤片机、涡旋混合器、免疫组化笔、倒置荧光显微镜等。CINEMA 4D可视化软件系统，德国Maxon Computer序列号14804002127-ZPTL-DTMF-WFNC-LLDM-XNXS-BVPG。
1.4   方法   
1.4.1   标本的获取及固定   大腿中上段截肢患者大腿后方解剖坐骨神经主干，股骨髁上20 cm，股二头肌长头深面与大收肌浅面，探查坐骨神经主干，精细剥离坐骨神经外膜的联系，向远端取下坐骨神经主干约1 cm，小腿下1/3处腓浅穿入皮下处取下腓浅神经皮支，于腓骨长肌深面靠近胫前动脉处探查到腓深神经，顺神经主干穿入肌肉处取下腓深神经肌支，经解剖腓肠神经肌支及腓浅神经皮支，40 g/L多聚甲醛固定，4 ℃冰箱放置，固定5-7 d。固定充分后，取下的坐骨神经前方标记定位线。
1.4.2   石蜡切片组织制作   组织固定完成后，切成约1 cm×1 cm×0.3 cm的小块放置包埋盒中，过夜冲洗固定液。梯度乙醇脱水后放入二甲苯，透明10 min，重复1次；将透明组织浸入蜡液五六小时；组织块迅速放入蜡液，最大组织切面朝下，冷却台上冷却。连续切片，间隔45 μm，5 μm厚度的病理切片，共200张；45 ℃温水中展开，平整铺于玻片；60 ℃恒温箱烘干，保存备用。
1.4.3   石蜡坐骨神经切片免疫组化染色   ①石蜡切片脱蜡至水；②0.3%triton-X100 37 ℃透膜20 min，D-PBS洗3次，5 min/次；③离子水冲洗，体积分数3%甲醇双氧水避光浸泡20 min去除过氧化物酶，去离子水清洗2次，浸入柠檬酸缓冲液，加热法进行抗原修复；④去离子水清洗切片2次，D-PBS浸泡10 min，擦干残液，滴加3%BSA覆盖，37 ℃恒温箱封闭30 min；⑤按实验的抗体最佳比例加入Anti-HB9/HLXB9 Antibody一抗(1∶100)，置于湿盒内，4 ℃冰箱孵育过夜；⑥置于D-PBS中脱色晃动洗涤3次，每次5-10 min；⑦按抗体最佳比例滴加二抗(1∶200)，37 ℃恒温箱孵育45-60 min；⑧D-PBS清洗；⑨滴加显色剂，避光孵育5-15 min；⑩浸入D-PBS，去除显色液；⑪苏木精染色5 min，去离子水洗净；⑫分化液中分化5-10 s，去离子水浸泡15 min，洗去分化液；⑬伊红染色两三分钟，去离子水浸洗3次；⑭乙醇梯度脱水；⑮放入二甲苯中5-30 min；⑯滴加中性树脂胶，盖玻片封固，观察，拍照。
1.4.4   石蜡组织切片免疫荧光染色   前期步骤同1.4.3的第①-⑧步，余下的步骤如下：⑨滴加DAPI染液，避光孵育10 min，复染细胞核；⑩D-PBS脱色摇床洗涤三四次，每次5-10 min，抗荧光淬灭封固剂封固，镜检拍照采集图像。
1.4.5   组织切片批量免疫荧光染色和扫描   染色组织切片采用3D HISTECH的组织切片扫描仪(型号Pannoramic MIDI)进行扫描，记录镜头扫描范围内的组织切片信息，采用配套的分析软件Quant center进行组织分析，识别分析出每个组织中包含的阳性细胞及阴性细胞的比例等一系列数据。
1.4.6   切片染色后二维图像的获取、储存、对比、预处理及分析   将染色后的切片使用同样的采集图片方式制作二维图像，储存于特定的硬盘中。染色前和染色后的二维图像进行比对，根据特异性免疫组化染色的分类区分神经纤维束并标记。调整图像的对比度、噪声、亮度、锐化等相关处理，易于精确识别。
1.4.7   二维图像转化为三维立体图形实现可视化   经CINEMA 4D软件系统排序、设置原点、比对、定位、匹配和合成，三维可视化坐骨神经内部神经束[12]。 
1.5   主要观察指标   ①前期固定人坐骨神经标本后，切片、组化染色、荧光染色、将染色后的切片使用同样的采集图片方式制作二维图像，储存于特定的硬盘中。②将染色前和染色后的二维图像进行比对，核对前后定位点的吻合及可靠性。③根据特异性免疫组化染色的分类区分运动神经纤维束和其他神经纤维束并标记。④最后调整二维图像的对比度、去除噪声、亮度、锐化等相关处理，使二维图像在三维重建时更精确并易于识别。

目前，坐骨神经内部神经纤维的三维结构重建和可视化研究在国内外凤毛麟角[15-16]，主要在于坐骨神经的复杂性和技术手段的限制。在所有神经中，坐骨神经直径最粗，行程也最长，而且走行复杂，与周围组织不易分辨开来，易受损伤，其神经纤维内部的立体结构也是交错复杂，而且在短距离内神经束的形态就会有很大的改变；难以利用常规影像学检查方法获得坐骨神经内部纤维结构满意的图像，传统的诊断方法不能分辨神经束的内部结构是其根本原因，无法明确损伤程度及性质，指导治疗时具有局限性和一定的盲目性[17]。

周围神经及内部结构的三维立体重建和可视化方法经历了诸多探索和不断改进。GÜLEKON等[18]取材18周龄胎儿的骨骼肌内神经，针对神经分支的分布特征进行了可视化研究，定性比较了显微解剖、Sihler’s染色和计算机重建这3种方法的优势和不足，显微解剖简便易行，但人为判断的主观因素太大；染色法相对客观，但能够区别的类型比较有限，操作比较繁琐；依赖于计算机的三维重建在客观上保证了结果的一致性很高，但需要结合神经本身的图像信息，重建技术要求较高。张元智[6]将薄层断面图像与实际的神经切片配准切割，对臂丛神经的实际组织图像应用Amira 3.1软件进行面与体的三维重建，实现了臂丛神经内部结构的可视化，获取重建后的臂丛神经束与相邻组织的相对位置图像。孙廓等[19]经OCT包埋剂包埋带有头发标记的1例正中神经标本制成冰冻组织，连续切片后用乙酰胆碱脂酶进行染色，经扫描染色切片后拍照获取高分辨率图像，计算机处理加工形成二维信息后，应用3D-Nerve软件可视化正中神经的三维显微结构；结果显示，正中神经的内部结构在不同平面均有区别；连续断面观察显示，各神经束的组成都是混合束，未见纯粹的感觉束或运动束；该研究利用3D-Nerve动态展示了正中神经内部复杂的神经束结构，不仅真实再现了正中神经干全长及其内部精细的三维立体可视化结构，也为临床正中神经损伤后的修复工作提供了较精确的解剖图谱和参考。罗鹏等[20]取1例新鲜人体坐骨神经标本，采用人头发作为神经标记定位，连续冰冻切片后，使用乙酰胆碱酯酶染色的方法，切片经高分辨率扫描仪扫描后获取神经断面的数码信息，最后输入计算机进行三维重建；可显示坐骨神经中神经束全长的走行、交叉重组等复杂的解剖结构，直接直观地向临床医生展示出坐骨神经内部的复杂组成和走向。

随着计算机和信息处理技术的迅猛发展，以及医学数字影像设备的不断更新及推出新的DICOM传输标准，这使得基于连续组织切片图像的计算机三维重建和可视化技术塑造虚拟的周围神经内部神经束的三维结构成为可能[21]。数字化可视人体数据的不间断二维成像、或薄层二维断面图片、亦或是相连组织切片的二维图片可作为三维可视化研究的数据基础，使用先进的计算机技术重建出人体结构的三维立体可视化解剖模型[22-23]。医生利用此技术可更为直观、精确地观察和处理人体及其周围器官及组织，更精确地诊断、更个性化地制定外科手术计划、解剖教学等[24]。

MRI扫描利用断层扫描从人体中获得电磁信号，经数据处理和分析还原人体的信息，广泛应用于临床上人体组织的病理检测[25]。在神经病理诊断方面，MRI成像产生的图像的噪点、清晰度和分辨率均不尽人意[26]；因此临床医生只能凭个人临床经验想象周围神经内部结构的走行、走向和它们相互之间的毗邻关系进行“想象重建”[27]，这种主观重建缺乏严谨的科学依据和客观的准确性，增加了手术中损伤神经、血管和局部脏器的风险。常规的MRI仅能够粗略显示坐骨神经的外部形态，而弥散张量成像及神经纤维束示踪术则提供了新的显示及定量分析外周神经细微结构的方法[28]。弥散张量成像是在弥散加权成像的基础上，利用水分子运动的各向异性进行成像，从而精确显示神经纤维内部的细微结构，由此发展而来的影像检查方法[29]。研究显示，弥散张量成像主要通过检测周围神经中水分子的自由运动来探讨组织微观结构的完整性，因为水分子运动具有各向异性，因此可以检测弥散张量成像获得表观扩散系数及各向异性分数等数据[30-31]，对周围神经可能存在的病变提供诊断和疗效的评价信息。

德国Maxon Computer开发的CINEMA 4D软件是目前国际上最为流行的三维软件之一[32]。CINEMA 4D软件采用模块化的软件结构，支持实时三维绘图和UV坐标设置模块等复杂的个性化功能，具有广泛的受众面和应用范围[33-34]。在德国Maxon Computer开发的CINEMA 4D软件中，建模工作是以一种非线性的方式完成的，场景和各种操作是以层级结构的形式来组织的，提高了三位重建的工作效率和准确度[35]。

德国Maxon Computer开发的CINEMA 4D软件的优势之一是系统稳定强大，可满足医学上的要求；可实现直接文件转换，可兼容性强；其中的三维纹理绘画模块可以直接在三维模型上操作，支持多种笔触的压感和多图层功能；支持MoGraph系统，可将类似矩阵式的制图模式变得极为简单有效而且方便；拥有丰富而强大的预置库，可以轻松从预置中找到需要的参数，明显提高了工作效率[36]。对人坐骨神经固定后连续切片并染色，利用高分辨率纤维成像转换为电子信息二维图像，然后把这些切片染色前后的图像输入计算机，经处理之后再用三维合成软件进行重建，从而得到坐骨神经结构的三维形态。可以让临床医生任意旋转观察神经形态及走行，并模拟切割修复神经，观察坐骨神经内部各个功能束修复后进行对比。将二维图像利用计算机图像重建技术转换为三维立体数字模型，可以直观、精确地显示周围神经内部复杂的三维结构和众多组织之间的空间位置关系[37]。

在基础医学研究和临床领域，通过连续切片的三维重建技术，从多角度、多层次进行观察和分析，揭示组织内部精细的结构信息，理解更深层次的人体结构和功能；辅助受损或病变区域准确的判断和定量分析，提高临床诊断和治疗的准确性[38-39]。

到目前为止，研究者们通过研究建立了人体内部及外部的部分三维立体模型，但由于人体周围神经的信息量大、结构错综复杂，难以从组织中区分开来，从而还没有一套周围神经系统精整的立体可视化模型，怎样模拟周围神经的功能及走行仍然面临着不小的挑战[40]。三维立体可视化模型作为周围神经新的发展方向，目前的很多技术和方法仍处于起步阶段，还有许多待研究及解决的问题[41-50]。如周围神经二维平面图像的各种数据：定位点、断面与断面之间的距离、灰度、色彩、对比度、图像的清晰度及分辨率等决定了三维立体模型的可视化质量；同时二维图像数据的解析、配准、合成等同样是依赖计算机三维重建和可视化所必需的技术，因此该系统的三维立体重建技术在实际应用中有许多尚待解决的问题。更为困难的是，在人体框架上，周围神经不仅是不可或缺的结构组成，更是生理功能的承载体，如何建立结构和功能的直接联系，更有待深入探索。需要从功能入手，找到一种化学标记物可以直观区分周围神经系统的不同结构，区别神经内部功能束和周围组织，以便获取精确的神经定位，排除横断面中周围组织的干扰，再进行三维重建，提高周围神经三维可视化图像的纯度和质量；使周围神经的研究发展从定性转向定量，从二位平面图像转向三维空间和立体结构，从单纯的解剖结构向三维解剖结构与生理功能同步发展；三维可视化数字模型可进行动态模拟和定量分析，在术前进行准确的三维诊断、严谨分析和详细的手术模拟，在术后进行恢复效果的评判，不仅确立了科学的量化指标，也提高了手术的安全性和可靠性，减少并发症，未来周围神经损伤的诊断、治疗和研究均以上述技术作为新的突破口。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

文题释义：
免疫荧光技术：用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法，用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。主要特点是特异性强、敏感性高、速度快。
三维立体重建：英文术语名称是3D Reconstruction。是指对三维物体建立适合计算机表示和处理的数学模型，是在计算机环境下对其进行处理、操作和分析其性质的基础，也是在计算机中建立表达客观世界的虚拟现实的关键技术。
可视化分析：通过三维重建软件，将人体或动物组织的二维图片重建成为三维立体图像，结合免疫组化、荧光染色等方法进行标定后，再使用三维重建软件重建出精确组织内部结构，实现可视化。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

本实验研究以人坐骨神经连续石蜡切片和免疫组化、荧光染色区分内部功能束后采集的二维图像为基础，使用德国Maxon Computer开发的CINEMA 4D软件经后期处理，得到人坐骨神经内部神经束的三维立体图像的方法。

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