2.1   浓缩生长因子对骨髓间充质干细胞增殖的影响   第1天时，各实验组吸光度值与对照组相比均无显著差异；第3天时，各实验组的吸光度值与对照组相比，均有上升趋势，但无显著差异；第5，7天时，各实验组的吸光度值较对照组显著升高，差异均有显著性意义(P < 0.01或P < 0.05)。在各时间点，体积分数为5%，10%，20%浓缩生长因子组间比较，差异均无显著性意义，见图1。



2.2   细胞划痕实验结果   划痕后立刻(0 h)，显微镜下观察各组划痕宽度基本无差别；在12 h时，各组划痕均较0 h缩窄，体积分数10%浓缩生长因子组细胞划痕宽度最小；在24 h时，各组均未见明显划痕，见图2。



2.3   Transwell迁移小室实验结果    细胞接种Transwell上室后12 h，各实验组迁移至下室的细胞数目均明显高于对照组，且体积分数10%浓缩生长因子组的细胞迁移数量更多，组间差异有显著性意义(P < 0.01，P < 0.000 1)，见图3。



2.4   茜素红钙结节染色结果   茜素红染色后，其中无定形物质均呈深红色结节状，形态各异，实验组均比对照组形成更多的钙结节，这进一步说明浓缩生长因子能够促进大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化，见图4。

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临床上许多疾病会导致骨骼破坏，进而造成骨缺损，骨再生是近年来临床上的研究热点与难点[1-2]。在治疗骨缺损的策略上，骨组织材料不断创新，从最开始的自体骨到后期同种异体骨等材料，但由于自体骨的获取会增加患者的手术创伤，且往往获取量受限而在临床上应用受到一定的限制，异体骨由于其免疫排斥性，也给临床应用带来了一定的困扰[3]。骨组织工程对骨缺损修复至关重要，用于骨缺损治疗的骨组织工程材料主要由两部分构成，即具有骨传导、骨诱导特性的生物支架材料和各类成骨诱导因子或种子细胞。由于骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)是一种来源简便、分化能力强的细胞，因而成为目前研究的热点[4-5]。

在组织再生领域，自体血液浓缩物的出现提供了新的策略，1984年富血小板血浆的出现，作为第1代产品，在临床应用最广，2000年第2代富血小板纤维蛋白的出现，也表现出色。2006年提出的浓缩生长因子(concentrated growth factor，CGF)被定义为新一代产品，内含丰富的血小板、白细胞和各类生长因子[6-7]。通过提前设定的变速离心程序激活其有效成分，缓释各类生长因子，达到促进组织再生的目的[8-10]。

目前研究表明浓缩生长因子具有促进大鼠骨髓间充质干细胞增殖及成骨分化的作用[12-13]，但尚未有研究探讨不同体积分数浓缩生长因子对大鼠骨髓间充质干细胞迁移能力的影响。该研究通过检测不同体积分数浓缩生长因子对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、分化及迁移能力的影响，为浓缩生长因子的基础研究和临床应用提供理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   设计   体外细胞增殖、成骨分化、迁移实验。两组之间采用独立样本t检验，3组或3组以上则采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Turkey检验。
1.2   时间及地点   实验于2021年1-10月在广州中医药大学岭南医学研究中心实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验试剂和仪器   α-MEM完全培养基(含体积分数为10%胎牛血清和1%双抗)及成骨诱导培养基(广州赛业公司，中国)；0.25%胰酶-EDTA(Gibco公司，美国)；CCK-8试剂盒(合肥Biosharp公司，中国)；茜素红染色液(广州赛业公司，中国)；倒置荧光显微镜(Olympus，日本)；Medifuge MF200离心机(Thermo公司，美国)；其他常规实验设备与实验耗材均由广州中医药大学岭南医学研究中心提供。
1.3.2   实验动物   选用SPF级SD大鼠，10只4-6周龄大鼠用于提取骨髓间充质干细胞，雌雄各半，体质量100-200 g；20只8-10周龄大鼠用于制备浓缩生长因子，雌雄各半，体质量360-420 g；均购于广州中医药大学实验动物中心，许可证号：SCXK(粤)2018-0034，动物合格证号：44002100029100。实验方案经广州中医药大学第一附属医院伦理委员会批准，批准号为TCMF1-2020033。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.4   实验方法   
1.4.1   骨髓间充质干细胞的提取与培养   麻醉后颈椎脱臼法处死4-6周龄SPF级SD大鼠，使用体积分数为75%乙醇浸泡10 min，超净台内剥离大鼠股骨，尽可能剥离股骨上附着的肌肉组织，并剪除骨骺端，用内含完全培养基的注射器从长骨一端开口处进入，反复冲洗骨髓腔至直至股骨发白，整个过程保持无菌，避免污染，用完全培养基重悬细胞，种于10 cm培养皿中，在37 ℃、体积分数为5%CO2恒温培养，每3 d换液1次，细胞培养到第3代用于后续实验[14]。 
1.4.2   大鼠浓缩生长因子的制备   SD大鼠用1%戊巴比妥钠麻醉，腹下腔静脉采血并放置离心机内，两边采血管配平后启动离心，离心后将中间白色凝胶取出，-80 ℃冷冻1 h，4℃解冻后离心(1 200 r/min，10 min)，加入足量完全培养基，37 ℃孵育24 h，离心(1 500 r/min，5 min)，取上清液5 mL，0.22 μm过滤器过滤后备用[15]。

1.4.3   细胞增殖实验   取96孔板，每孔加入100 μL(约5 000个细胞)第3代骨髓间充质干细胞悬液，观察细胞贴壁后，依据所加培养液不同，将其分为4组(第1组为对照组，第2-4组为实验组)：分别添加含体积分数为0%，5%，10%，20%浓缩生长因子的完全培养基。在培养第1，3，5，7天收板，每孔加入10 μL CCK-8液，孵育1 h，酶标仪检测450 nm波长的吸光度值。以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标，制作增殖曲线。
1.4.4   细胞划痕实验   取6孔板，每孔加入2 mL(约105个细胞)第3代骨髓间充质干细胞悬液，待单层细胞贴壁(背面画有标记线)，用无菌移液枪头在细胞生长的中央区域划线，PBS冲洗，弃去漂浮死细胞，将其分4组培养：分别添加含体积分数为0%，5%，10%，20%浓缩生长因子的完全培养基。在划痕后0，12，24 h于显微镜下观察划痕宽度并拍照记录。
1.4.5   Transwell迁移小室实验   在24孔板Transwell小室的下层分别加入500 μL含体积分数为0%，5%，10%，20% 浓缩生长因子的完全培养基；第3代骨髓间充质干细胞，加入胰酶消化，离心并吸掉上层培养液，培养基重悬细胞，取200 μL(2×108 L-1)细胞悬液加入Transwell小室，放入培养箱培养12 h，用甲醛固定30 min，将小室适当风干，1 g/L结晶紫染色液20 min，用棉签轻擦上层未迁移细胞，PBS清洗3遍，显微镜下观察细胞并拍照计数，30%醋酸脱色，洗脱液在酶标仪上570 nm波长处测其吸光度值。
1.4.6   茜素红钙结节染色   取6孔板，以1×108 L-1的细胞浓度接种第3代骨髓间充质干细胞 (每孔约2×105个细胞)，每个板4孔，待细胞生长至80%-90%融合后，每个板的4个孔分别从左往右加入体积分数为0%，5%，10%，20%浓缩生长因子，同时加入成骨诱导液。实验分组为(第1组为对照组，第2-4组为实验组)：成骨诱导液组、体积分数为5%浓缩生长因子+成骨诱导液组、体积分数为10%浓缩生长因子+成骨诱导液组、体积分数为20%浓缩生长因子+成骨诱导液组。在培养箱培养并每3 d全换液，至7 d后进行茜素红染色，具体步骤为：吸去上层培养液，PBS清洗3次，乙醇固定20 min，再用PBS清洗细胞3次，加入0.1%茜素红染液，孵育30 min，PBS洗3次，显微镜下观察并拍照。
1.5   主要观察指标   ①不同体积分数浓缩生长因子对骨髓间充质干细胞增殖、迁移能力的影响；②各组骨髓间充质干细胞成骨诱导分化7 d的细胞矿化水平。
1.6   统计学分析   采用SPSS 20.0软件进行统计分析。两组之间采用独立样本t检验，3组或3组以上则采用单因素方差分析，两两比较采用Turkey检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过广州中医药大学统计学专家审核。

组织再生是当前医学的热点与难点问题之一，在过去几十年里，血小板浓缩物在促进伤口愈合和组织再生方面的功能一直是再生医学研究的重点，血小板在再生医学领域越来越受重视。血小板成分复杂，但是富含生长因子群，如血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子、成纤维细胞生长因子等，与细胞的增殖、成骨、成软骨、成血管、成纤维等密切相关。这些生长因子虽然可以单独发挥作用，但更多是协同发挥作用，因为人体是一个复杂的生物环境，干细胞的成骨分化不是由单一的生长因子单独调节的，所以生长因子群的协同作用对治疗骨缺损起着关键作用，血小板还分泌纤维蛋白原，凝块形成过程中纤维蛋白链的广泛交联极大地增强了组织再生所必需的间充质细胞迁移，所以浓缩生长因子与骨髓间充质干细胞联合应用于骨再生的研究日益受到重视[7-8，16]。

浓缩生长因子作为最新一代的血小板浓缩提取物，在组织再生领域扮演着重要角色，目前有将浓缩生长因子单独或者与其他材料联合使用于皮肤创伤、美容、口腔、骨再生等方面，取得了一定的临床疗效[17-21]。1998年首次出现血小板浓缩物，也就是第1代的富血小板血浆，以及后面出现的第2代富血小板纤维蛋白，它们都富含自体生长因子，具有促进组织再生、促凝血等作用[22-24]。

与前二代产品相比，浓缩生长因子作为最新一代的血制品材料有其独特的优势，它通过一次特定的离心程序过程，可避免纤维蛋白原的丢失，同时因为不加入任何添加剂，减少了免疫排斥、传染病传播的风险，离心后可形成纤维网状支架，还具有高致密、高强度等优点，所以它也是生物支架材料的研究重点[25-26]。在浓缩生长因子制备过程中，血小板能最大程度的被激活，在长达20 d内缓慢释放各类生长因子，从而诱导血管生成，帮助伤口愈合，实现组织再生。同时它的纤维网状支架结构又为新生组织提供了一定的生长空间[27-30]。

目前一些研究表明，将浓缩生长因子单独或者与骨髓间充质干细胞联合应用可有效促进骨再生，如在大鼠颅骨缺损模型中，联合使用浓缩生长因子和骨髓间充质干细胞在12周内几乎完全修复了骨缺损，显示浓缩生长因子是骨髓间充质干细胞修复骨缺损模型的良好支架。使用浓缩生长因子作为支架的优点：第一，浓缩生长因子含有促进细胞生长、成熟和基质产生的细胞因子；第二，制备浓缩生长因子快速、简单；第三，浓缩生长因子是安全的，因为它只含有自体血液成分[7，15，31]。已有研究证明浓缩生长因子可促进多种细胞的增殖、迁移与分化[32-39]。有学者提出浓缩生长因子对细胞增殖的影响呈现浓度依赖性，但浓缩生长因子体积分数增加并不总是促进细胞增殖，会存在一个最佳的体积分数值，这时增加或减少体积分数对细胞增殖都无法达到最佳效果。虽然已有报道浓缩生长因子促进骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化[12-13]，但该研究首次报道了浓缩生长因子具有促进骨髓间充质干细胞迁移的作用，通过设置体积分数0%，5%，10%，20%浓缩生长因子组，来探讨不同体积分数浓缩生长因子对骨髓间充质干细胞增殖、分化及迁移的影响。

应用CCK-8法检测不同体积分数浓缩生长因子对骨髓间充质干细胞增殖的影响，第3天时，各浓缩生长因子组均具有促进骨髓间充质干细胞增殖的上升趋势，但无统计学差异；而在第5，7天时，各浓缩生长因子组较对照组显著促进骨髓间充质干细胞增殖，且差异均有显著性意义。在各个时间点，体积分数5%，10%，20% 浓缩生长因子促进骨髓间充质干细胞增殖能力无统计学差异，这也为研究不同体积分数浓缩生长因子在第7天时对成骨分化的影响提供了前提条件，这是因为需要在不影响骨髓间充质干细胞增殖的前提下检测不同体积分数浓缩生长因子对骨髓间充质干细胞成骨分化的影响。

细胞迁移能力是表征细胞生物学性能的一个重要指标，该研究同时应用了细胞划痕和Transwell迁移小室2种不同的检测手段探讨不同体积分数浓缩生长因子对骨髓间充质干细胞迁移的影响。细胞划痕实验结果发现，12 h观察到各组细胞划痕宽度均较0 h缩窄，且体积分数为10%浓缩生长因子组细胞划痕宽度最小，而24 h各组细胞划痕已消失，说明划痕12 h时10%浓缩生长因子促进骨髓间充质干细胞迁移的速度最快，而24 h时各组骨髓间充质干细胞均已充分迁移并充满了划痕，无比较意义。此外，Transwell迁移小室实验结果表明浓缩生长因子组迁移至下室的细胞数目均明显高于对照组，且体积分数10%浓缩生长因子组中细胞迁移数量最多，这与细胞划痕实验结果相吻合。实验结果表明，不同体积分数的浓缩生长因子均具有促进骨髓间充质干细胞迁移的作用，且体积分数10%浓缩生长因子的作用最强，说明浓缩生长因子促进骨髓间充质干细胞迁移不呈浓度依赖性。
CCK-8检测培养第7天时体积分数5%，10%，20% 浓缩生长因子促进骨髓间充质干细胞增殖的能力无显著差异，因此该研究使用茜素红钙结节染色，在加入成骨诱导液的前提下，比较各组在7 d的矿化结节情况。研究结果表明，在有浓缩生长因子存在情况下，骨髓间充质干细胞能够产生更多的钙结节，说明浓缩生长因子对骨髓间充质干细胞的骨向分化起到了显著促进作用，这和之前报道的实验结果一致[13]。

综上所述，该研究证实了在体外环境下，浓缩生长因子对于骨髓间充质干细胞的增殖、分化及迁移有较为明显的促进作用，并不完全具有浓度依赖性，体积分数10%浓缩生长因子对骨髓间充质干细胞迁移作用是最显著的，为浓缩生长因子的深入研究提供实验依据，但对于其在临床上使用效果及其具体作用机制仍需进一步研究与探讨。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：
浓缩生长因子：不含任何添加剂离心出来的一种高度浓缩生长因子的血纤维蛋白，又称血液中的“不老因子”，白细胞、血小板及各类生长因子是它的主要成分，如血管内皮生长因子、成纤维细胞生长因子等，具有组织再生、炎症调节、抗感染等特性，在骨科、口腔、美容等领域应用广泛。
细胞迁移：指细胞从一个地方移动到另一个地方的复杂而异构的过程，分为单细胞迁移和集体细胞迁移。单细胞迁移分伪足运动和间叶细胞运动，伪足运动的特征是细胞以圆形椭球体的形式运动，没有局部黏附和细胞附着，但有推进泡的帮助；间叶细胞运动则包括细胞外基质的强烈局部附着、细胞骨架的收缩等。集体细胞迁移主要特征是细胞队列通过细胞外基质运动，并保存功能细胞-细胞连接。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

浓缩生长因子是最新的血小板浓缩物产品，在制备方法、产品结构及生长因子的种类和含量上，与其它血小板浓缩物相比有着独特的优势，在美容、创伤、口腔等众多领域应用较广，取得了一定的临床效果。但因为制备方法、应用标准等尚不统一及成分复杂多样，还需要更多的研究数据来支持并推广，在组织修复和再生医学等领域具有一定的研究潜力。该研究的主要创新性和重要性在于探讨不同体积分数浓缩生长因子对大鼠骨髓间充质干细胞迁移能力的影响，且对浓缩生长因子促进大鼠骨髓间充质干细胞的增殖、成骨分化进行了验证。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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