2.1   脐带间充质干细胞来源外泌体鉴定、示踪结果   外泌体表面标志蛋白TSG101、CD9通过蛋白免疫印迹技术检测呈阳性表达，见图1A；透射电镜发现整个外泌体结构为类圆形双层膜囊泡状，直径在30-150 nm之间，形状为茶托状，见图1B。免疫荧光结果显示NeuN标记的神经元为绿色，在海马区神经元中可见红色荧光，即说明间充质干细胞外泌体通过血脑屏障进入海马神经元，见图1C。



2.2   各组小鼠损伤侧海马组织内血红素加氧酶1表达及脐带间充质干细胞来源外泌体治疗能抑制炎症分子表达   与假手术组相比，在脑出血后24 h，4 d以及30 d血红素加氧酶1表达显著升高(均P < 0.05)，见图2；与脑出血组相比，脑出血+外泌体组小鼠海马组织中血红素加氧酶1、高迁移率组蛋白B1和Toll样受体4的表达在脑出血后第4天显著降低(均P < 0.05)，见图3。







2.3   慢病毒稳定感染HT22细胞    以感染复数值为30的慢病毒感染HT22细胞，在倒置荧光显微镜下观察细胞荧光表达。阴性对照慢病毒及血红素加氧酶1基因干扰慢病毒感染HT22细胞，图4中可见第3天荧光表达最明显，转染效率约为80%，细胞状态良好，表明转染效率稳定，可进一步实验。
2.4   体外验证脐带间充质干细胞来源外泌体通过血红素加氧酶1介导发挥作用   蛋白免疫印迹结果显示，与对照组比较，氯高铁血红素刺激HT22细胞后血红素加氧酶1蛋白表达量显著升高，但予以外泌体预处理后血红素加氧酶1表达明显降低(均P < 0.05)，见图5；当慢病毒转染HT22细胞敲低血红素加氧酶1表达后，与阴性对照慢病毒组相比，血红素加氧酶1基因干扰慢病毒组血红素加氧酶1的表达显著下降(P < 0.05)；血红素加氧酶1基因干扰慢病毒+氯高铁血红  素+PBS组与血红素加氧酶1基因干扰慢病毒+氯高铁血红素+外泌体组血红素加氧酶1的表达差异无显著性意义(P > 0.05)，见图6。











2.5   生物相容性   脐带间充质干细胞来源外泌体生物相容性较好，小鼠无明显不良反应。

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脑出血是一种高致死率和致残率的疾病[1]，全球每10万人中就有10-20个人发生脑出血[2]，脑出血在中国占所有住院脑卒中患者的18.8%-47.6%[3]，该疾病发病凶险，预后效果差，给社会和家庭都带来了沉重的负担。虽然目前仍缺乏有效降低死亡和残疾发生的治疗方案，但间充质干细胞治疗有望促进脑出血患者的神经功能恢复。间充质干细胞可以通过神经发生、血管生成、抗炎症和抗凋亡机制促进神经网络重建和神经功能恢复[4]，但其具有多分化潜能，存在形成肿瘤的风险。间充质干细胞分泌的外泌体是一种囊泡状结构，内含丰富的生物活性物质，这些物质被验证可作为有用的治疗剂、药物输送工具等，此外，外泌体具有抗冻融的特性使其使用极为方便，并且它可以穿过血脑屏障，用于神经系统疾病治疗更占优势[5-6]，而且具有更高的安全性[7]。目前脐带间充质干细胞是外泌体来源的理想选择，其在基因表达层面差异最小，且采集脐带的过程不会对人体造成伤害[8]。近年来有研究证实间充质干细胞来源外泌体能一定程度上改善脑出血后白质纤维完整性及促进神经功能恢复，并且外泌体的蛋白质组学分析确定了2 000多个可能与大脑修复功能有关的蛋白质[9]。目前间充质干细胞来源外泌体治疗脑出血的潜在机制主要是通过外泌体内的miRNAs产生抗凋亡、神经发生、血管生成和抗炎症作用[4，10-11]。

脑出血后除血肿带来的原发性损伤外，继发性脑损伤更不容忽视，继发性损伤能进一步促进细胞凋亡、炎症发生以及神经元的变性与解体，而维持神经元正常的形态和功能对脑出血后的神经功能恢复有着重要作用[12]，因此有必要对脑出血后海马神经元损伤的机制进行研究。目前关于脑出血继发性损伤机制的研究较多[13]，脑出血后晚期脑水肿主要与血红素降解产物有关[14]，而血红素降解过程中所需的限速酶为血红素加氧酶1(heme oxygenase-1，HO-1)，一般情况下它在大脑中表达极低，而在脑出血后显著增加，且3-7 d达到峰值[15-16]。同时，血红素加氧酶1与氧化应激、炎症、细胞凋亡过程等密切相关。除此之外，抑制血红素加氧酶1表达可在一定程度上抑制脑出血炎症反应及其神经损伤[17]。该研究通过尾静脉注射脐带间充质干细胞来源外泌体治疗小鼠脑出血模型，采用蛋白免疫印迹法检测脑出血后损伤侧海马组织内血红素加氧酶1及炎性分子高迁移率组蛋白B1、Toll样受体4的表达；体外予以脐带间充质干细胞来源外泌体预处理小鼠海马神经元细胞(HT22细胞)，然后用氯高铁血红素刺激HT22细胞，采用蛋白免疫印迹法检测HT22细胞中血红素加氧酶1的表达；慢病毒转染敲低HT22细胞中血红素加氧酶1的表达，然后予以脐带间充质干细胞来源外泌体预处理HT22细胞，再用氯高铁血红素刺激HT22细胞，采用蛋白免疫印迹法检测HT22细胞中血红素加氧酶1的表达，通过上述实验探讨脐带间充质干细胞来源外泌体对脑出血后损伤侧海马神经元的保护作用及相关机制。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验及细胞学体外观察实验。多重比较分析采用单因素方差分析，使用最小显著性差异法(LSD)检验进行组间两两比较。
1.2   时间及地点   实验于2020年5月至2021年5月在西南医科大学饲养中心及神经外科实验室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物及分组   健康成年雄性C57BL/6小鼠，6-9周龄，体质量22-27 g，由西南医科大学动物实验中心提供。实验方案经西南医科大学动物实验伦理委员会批准(批准号2019-001)。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2   实验试剂及仪器   间充质干细胞专用培养基(友康恒业生物科技有限公司)；兔抗ACTB(中国爱博泰克公司，AC026，1∶100 000)；CD9单克隆抗体(美国Abcam，ab92726，1∶2 000)；TSG101单克隆抗体(美国Abcam，ab125011，1∶5 000)；兔抗血红素加氧酶1 (Proteintech，10701-1-AP，1∶1 000)；兔抗高迁移率组蛋白B1(Proteintech，10829-1-AP，1∶1 000)；鼠抗Toll样受体4(Proteintech，66350-1-lg，1∶4 000)；辣根过氧化物酶偶联二抗：山羊抗兔(赛默飞，31460，1∶25 000)和山羊抗小鼠抗体(赛默飞，31430，1∶50 000)；胎牛血清(美国Gibco公司)；胰蛋白酶-EDTA消化液(美国Gibco公司)；DMEM培养基(美国Gibco公司)；干扰血红素加氧酶1表达的慢病毒载体(PSLenti-U6-shRNA-Hmox1-CMV-EGFP-F2A-Puro)及其对照载体(PSLenti-U6-shRNA-NC- CMV-EGFP-F2A-Puro)；氯高铁血红素(Sigma，51280-1G)；标记蛋白使用Bio-Rad成像系统(Bio-Rad，美国加利福尼亚)；离心机(STl6R，美国赛默飞公司)；酶标仪(美国Bio-Rad)；小鼠海马神经元细胞(HT22细胞)为西安市中心医院实验室赠予。
1.4   实验方法   
1.4.1   脐带间充质干细胞培养及外泌体分离、鉴定   课题组前期已形成技术成熟的脐带间充质干细胞培养和外泌体分离、鉴定方法[18-21]，新生儿脐带组织由绵阳市第三人民医院产科提供，产妇知情同意。首先采用组织块贴壁法，分离脐带华通氏胶组织，采用标准培养基(含体积分数为10%胎牛血清的α-MEM培养基)培养，待细胞生长融合至70%-80%时传代。第3-5代脐带间充质干细胞融合至80%左右，换用无血清培养基培养24-48 h，然后收集细胞上清液进行外泌体的提取，即采用超速离心法在4 ℃，300×g离心10 min后留上清液，然后依次以2 000×g离心10 min，10 000×g离心20 min，100 000×g离心70 min后得到外泌体，PBS重悬，BCA试剂盒定量后储存于-20 ℃条件下备用。采用蛋白免疫印迹法检测外泌体表面标志物CD9和TSG101的表达，并在透射电子显微镜下观察外泌体的形态。 

1.4.2   外泌体的标记与示踪   参照课题组前期研究的方法[18，22]，首先在常温避光的条件下，外泌体悬液中加入Alexa FlourTM594 C5 Maleimide孵育1 h，然后在外泌体旋转柱中的树脂粉末水化20 min，常温条件下进行，离心去掉多余水分后将旋转柱放入1.5 mL离心管中，外泌体孵育完毕后，将其加入树脂中，离心5 min后收集标记的外泌体，然后通过尾静脉注射入3只脑出血小鼠体内，24 h后麻醉小鼠，然后灌注取脑固定，进行免疫荧光染色。
1.4.3   外泌体示踪免疫荧光染色   参考课题组前期实验方法[18]，在已标记的外泌体尾静脉注射24 h后，将小鼠麻醉后灌注取材，剥离脑组织后置于多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋后切片，然后浸入二甲苯及梯度乙醇中脱蜡、水化，再放于体积分数为3%过氧化氢溶液中室温孵育30 min，然后用TBS液洗3次，体积分数5%驴血清中室温封闭1 h，加入NeuN一抗(1∶500)4 ℃孵育过夜，TBS冲洗，加驴抗兔抗体(1∶200)室温避光孵育2 h，TBS清洗后加 DAPI染核，避光孵育5 min后TBS冲洗，封固后共聚焦显微镜观察。
1.4.4   实验动物分组   首先选取35只C57BL/6小鼠随机分成7组：正常对照组、假手术组、脑出血后12，24 h及4，7，30 d组，每组5只，通过蛋白免疫印迹法筛选出血红素加氧酶1表达升高的时间点之后，再选取40只C57BL/6小鼠随机分成假手术组5只、假手术+外泌体组5只、脑出血组15只、脑出血+外泌体组15只，脑出血组和脑出血+外泌体组再分为24 h及4，30 d亚组，每亚组5只。脑出血造模术后死亡4只，饲养过程中死亡1只，均补充C57BL/6小鼠完成实验。
1.4.5   小鼠脑出血模型的制备   将小鼠自体血注入右侧基底神经节建立脑出血模型[23-24]。首先将小鼠麻醉后固定于脑立体定位仪上，手术过程中使用湿纱布遮盖小鼠双眼，消毒后沿中线位置切开头皮，去骨膜，显露前囟，使用高速牙科颅钻在颅骨标记处钻孔至硬脑膜(孔径约1 mm)，从股动脉收集动脉血并迅速转移至微量注射器(美国Hamilton公司)，在坐标位置(前囟前0.2 mm，右旁开2.2 mm，深3.5 mm)以3 μL/min的速度用输液泵输注总体积为30 μL的动脉血，注射完毕留针10 min，之后缓慢拔针。假手术组的操作过程同脑出血模型组，仅空针插入脑内并留针10 min后缓慢拔出，用骨蜡封闭骨孔，仔细消毒并缝合伤口，密切观察动物至完全清醒。造模后8 h，假手术+外泌体组和脑出血+外泌体组通过尾静脉注射50 μg/150 μL外泌体悬液，假手术组和脑出血组尾静脉注射等量生理盐水，分别于脑出血后24 h及4，30 d取海马组织，采用蛋白免疫印迹实验检测血红素加氧酶1、高迁移率组蛋白B1和Toll样受体4的表达。
1.4.6   体外脑出血模型建立及外泌体干预   将HT22细胞分为对照组、氯高铁血红素+PBS组以及氯高铁血红素+外泌体组。应用氯高铁血红素刺激HT22细胞建立体外脑出血模型[25-26]，先将HT22细胞接种于6孔板，每孔细胞数约4×105，用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基培养，其中氯高铁血红素+外泌体组HT22细胞培养24 h后加入5 mg/L脐带间充质干细胞来源外泌体预处理12 h[18，27]，然后用60 μmol/L氯高铁血红素刺激HT22细胞6 h[19，23]，蛋白免疫印迹实验检测血红素加氧酶1蛋白表达。
1.4.7   慢病毒感染HT22细胞   按照上海和元生物技术公司的慢病毒操作手册，首先将病毒原液按10倍稀释成4个梯度，感染复数分别选取10，20，30，40，采用逐孔稀释滴度测定法，将HT22细胞接种在96孔板中，每孔接种细胞数为1×103，12 h后分别在不同感染复数值所对应孔中加入病毒原液，12 h后将病毒原液换为DMEM培养基，每隔24 h换液1次，72 h后在倒置荧光显微镜下观察转染效率，最终筛选出感染复数为30时慢病毒的转染效率达到最佳状态，接下来进行慢病毒感染HT22细胞及外泌体干预实验，第1天取对数生长的HT22细胞接种于6孔培养板中，每孔接种数约5×104，每孔细胞融合度约50%，第2天将血红素加氧酶1基因干扰慢病毒及阴性对照慢病毒以30×感染复数感染HT22细胞，加入1 mL DMEM培养基，加入5 mg/L凝聚胺5 μL，提高病毒的感染效率，然后于37 ℃，体积分数为5% CO2培养箱孵育过夜，转染72 h后将含慢病毒的培养液更换为普通完全培养液，每8-12 h更换培养液，转染后第1，2，3天在荧光显微镜下估计HT22细胞的感染效率，之后收集稳定感染细胞，一部分保存于-80 ℃用于后续实验，一部分接种于6孔板，分为阴性对照慢病毒组(NC)、血红素加氧酶1基因干扰慢病毒组(HO-1-)、血红素加氧酶1基因干扰慢病毒+氯高铁血红素+PBS组(HO-1-+Hemin+PBS)、血红素加氧酶1基因干扰慢病毒+氯高铁血红素+外泌体组(HO-1-+Hemin+MSC-Exo)，具体参照1.4.4体外脑出血模型建立及外泌体干预方法，最后进行蛋白免疫印迹实验检测血红素加氧酶1蛋白表达。
1.4.8   蛋白免疫印迹实验   提取小鼠海马组织及HT22细胞蛋白质，即于冰上剥离海马组织后加入RIPA裂解液行超声裂解4 min，在HT22细胞培养瓶中加入RIPA裂解液裂解30 min后，用细胞刮刮取细胞转移于EP管内，然后均在12 000 r/min下离心10 min，取上清液进行BCA定量，加上样缓冲液，加热10 min(95 ℃)，蛋白样品制备成功，用10%SDS-PAGE电泳，300 mA恒流转膜2 h，用5%脱脂牛奶封闭1 h，TBST洗膜，4 ℃下孵育CD9单克隆抗体(1∶2 000)、TSG101单克隆抗体(1∶5 000)、兔抗血红素加氧酶1抗体(1∶1 000)、兔抗高迁移率组蛋白B1抗体(1∶1 000)、鼠抗Toll样受体4抗体(1∶4 000)过夜，次日复温1 h，TBST缓冲液洗膜后孵育二抗2 h，Bio-Rad化学发光成像系统显像，使用Image Lab软件进行定量分析。
1.5   主要观察指标   ①小鼠脑出血后不同时间点损伤侧海马组织中血红素加氧酶1的蛋白表达量，筛选其表达明显增高的时间点；②在筛选出血红素加氧酶1表达增高的时间点后，观察脐带间充质干细胞来源外泌体治疗前后血红素加氧酶1、高迁移率组蛋白B1、Toll样受体4在不同时间点的表达量；③氯高铁血红素刺激的HT22细胞予以脐带间充质干细胞来源外泌体干预后血红素加氧酶1的蛋白表达量变化；④慢病毒转染技术敲低血红素加氧酶1表达水平后予以氯高铁血红素刺激HT22细胞，再予以脐带间充质干细胞来源外泌体干预后血红素加氧酶1的蛋白表达量。
1.6   统计学分析   采用SPSS 18.0进行统计分析，计量资料以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析；P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过绵阳市第三人民医院生物统计学专家审核。

间充质干细胞具有较强的增殖和分化潜力、免疫原性较低及旁分泌活性等特性[28]，有研究证实它在脑出血后可减轻脑出血大鼠的神经功能缺损，激活轴突再生等，故可预见其在脑出血后神经损伤治疗中具有重大潜力[29]。间充质干细胞分泌的外泌体被认为是间充质干细胞治疗的主要机制[30]，其不仅携带丰富的生物活性物质等，而且无成瘤风险，更易保存和运输[6]。已有研究证实外泌体的释放可抑制神经炎症和脑出血损伤[31]，其机制主要包括抗凋亡、神经发生、氧化应激和抗炎作用等[10-11]，但尚无研究者对间充质干细胞来源外泌体通过血红素加氧酶1介导对小鼠脑出血后海马神经损伤的治疗机制进行研究。

血红素加氧酶1是脑出血后血红素分解的限速酶，在正常生理条件下，脑组织中血红素加氧酶1表达非常低或根本不表达，但在脑出血和其他脑损伤后迅速增加[32]。血红素在血红素加氧酶1催化作用下分解产生铁、一氧化碳和胆绿素，后两种被认为参与介导血红素加氧酶1的抗炎和抗氧化作用[33]，故血红素加氧酶1可能在脑出血后的早期阶段(1-3 d)作为抗氧化剂发挥保护作用，而在后期(4-7 d)可能是作为一种促氧化剂，其过表达可能通过产生过量的铁而引发脂质过氧化，加重继发性脑损伤[16]。该研究采用自体血注射建立小鼠脑出血模型，蛋白免疫印迹法检测血红素加氧酶1在脑出血后海马组织中表达情况，结果在脑出血后24 h，4 d及30 d时损伤侧海马组织内血红素加氧酶1表达明显升高，这与目前的研究结果相符合，在血红素加氧酶1明显升高的这3个时间点经小鼠尾静脉注射外泌体，结果显示脑出血后第4天血红素加氧酶1的表达明显降低，说明外泌体在脑出血后通过介导血红素加氧酶1参与相关通路发挥神经损伤治疗作用，且在脑出血后第4天治疗效果明显。

脑出血后继发性损伤对患者预后有更大的影响，其中部分是由于血红蛋白的分解产物血红素的毒性作用，即血红素通过引起细胞凋亡和诱导局部炎症或氧化应激反应从而对细胞产生毒性作用[34]。该研究通过HT22细胞建立了脑出血体外模型，用血红素刺激HT22细胞后血红素加氧酶1表达明显升高，予以外泌体治疗后血红素加氧酶1表达明显降低，当慢病毒转染敲低血红素加氧酶1表达后，外泌体的治疗效果消失，进一步验证外泌体是通过血红素加氧酶1介导发挥作用的，具体机制可能与氧化应激反应、炎症反应、细胞凋亡等相关，已有研究表明血红素加氧酶1在脑出血后与这些相关机制紧密相连[35-36]。抑制血红素加氧酶1表达可进一步抑制Toll样受体4/核因子κB信号通路，从而显著抑制脑出血后大鼠脑内神经细胞凋亡和炎症反应[23]，这说明血红素加氧酶1的表达可能与Toll样受体4/核因子κB信号通路密切相关[37]，而Toll样受体4是核因子κB信号通路的关键跨膜蛋白，将细胞外抗原识别系统向细胞内传递并引发炎症反应[38]，在小鼠脑出血后第4天损伤侧海马组织内Toll样受体4表达明显升高，外泌体治疗后Toll样受体4表达降低，说明外泌体对脑出血小鼠的神经保护作用可能是通过血红素加氧酶1介导Toll样受体4参与的信号通路调节，但这有待进一步探索。除此之外，高迁移率组蛋白B1也是炎症相关因子，它通过受体作用从损伤细胞中释放出来，从而引发炎症[39]。已有研究证明外泌体可通过抑制高迁移率组蛋白B1/Toll样受体4通路的激活，产生抗凋亡和抗炎作用，从而显著减轻脑出血早期的脑损伤[40]。该研究中小鼠脑出血后第4天海马组织内高迁移率组蛋白B1的表达明显升高，给予外泌体后高迁移率组蛋白B1的表达降低，外泌体可能通过血红素加氧酶1介导对高迁移率组蛋白B1相关炎性通路发挥治疗作用。该研究不足之处在于未进行免疫荧光标记，尚不能确定血红素加氧酶1的表达部位是否在海马神经元细胞，另外因实验条件限制，未进行动物行为学实验进一步验证外泌体对脑出血后海马神经功能的改善作用。

综上所述，小鼠脑出血后损伤侧海马组织内血红素加氧酶1表达明显升高，且在脑出血后第4天达高峰，脐带间充质干细胞来源外泌体对脑出血后损伤侧海马神经元具有一定的保护作用，具体机制可能与血红素加氧酶1介导的高迁移率组蛋白B1/Toll样受体4炎症通路有关，为脑出血所致海马神经损伤相关治疗提供新的方向。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：
外泌体：是指包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡(30-150 nm)，特指直径在40-200 nm的盘状囊泡，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。外泌体的功能取决于其所来源的细胞类型，其可参与到机体的免疫应答、抗原提呈、细胞迁移、细胞分化、肿瘤侵袭等方面。
血红素加氧酶1：是脑出血后血红素分解的限速酶，在正常生理条件下，脑组织中血红素加氧酶1表达非常低或根本不表达，但在脑出血和其他脑损伤后迅速增加。血红素在血红素加氧酶1催化作用下分解产生铁、一氧化碳和胆绿素，后两种被认为参与介导血红素加氧酶1的抗炎和抗氧化作用，故血红素加氧酶1可能在脑出血后的早期阶段(1-3 d)作为抗氧化剂发挥保护作用，而在后期(4-7 d)可能是作为一种促氧化剂，其过表达可能通过产生过量的铁而引发脂质过氧化，加重继发性脑损伤。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

目前有关血红素加氧酶1在脑出血方面的研究，主要是对血肿周围皮质区域炎症反应进行研究，较少对脑出血后海马组织损伤进行探索，由于脑出血后致残致死率较高，目前治疗脑出血后所致神经功能障碍效果不佳，迫切需要探索新的治疗策略，而间充质干细胞外泌体近年来成为研究热点，在神经损伤、神经再生等方面有着较好的治疗前景，以各种优势逐渐替代干细胞的治疗，成为多种神经系统疾病潜在的理想治疗方法，也有望在脑出血治疗上取得新的突破，为患者带来福利。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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