2.1   骨质疏松模型建立   术后3个月，使用Micro-CT扫描和3D重建观察去卵巢组和假手术组大鼠的骨组织形态结构。重建结果显示去卵巢组大鼠骨量明显下降，骨小梁数目明显降低，见图1A。去卵巢组的骨密度、骨容积比都低于假手术组，差异有显著性意义(P < 0.01)，见图1B，C，说明去卵巢组大鼠已患骨质疏松。



2.2   去卵巢组大鼠骨髓间充质干细胞内活性氧水平有明显升高   与假手术组大鼠骨髓间充质干细胞相比，来源于去卵巢组大鼠的骨髓间充质干细胞内活性氧水平显著增高，说明细胞内存在着高水平的氧化应激，见图2A，B。针对线粒体内的活性氧，采用MITOSOX RED这一特异性荧光探针，结果显示去卵巢组大鼠骨髓间充质干细胞线粒体内活性氧水平也有明显升高，证明去卵巢组大鼠骨髓间充质干细胞线粒体内存在着过多的未能被清除的活性氧，见图2C，D。



2.3   去卵巢组大鼠骨髓间充质干细胞的线粒体功能受损明显    通过JC-1染色，使用流式细胞仪分析比较两种来源骨髓间充质干细胞内的线粒体膜电位水平，可见去卵巢组大鼠骨髓间充质干细胞的线粒体膜电位下降明显，证明过多的活性氧对线粒体膜的通透性有伤害，见图3A，B。同时，检测两种来源骨髓间充质干细胞ATP含量，结果发现相比于假手术组大鼠骨髓间充质干细胞，去卵巢组大鼠骨髓间充质干细胞的ATP含量显著下调，见图3C。



2.4   去卵巢组大鼠骨髓间充质干细胞中呼吸链复合体上关键基因的表达下降   对于呼吸链复合体Ⅰ，Ⅱ，Ⅳ，Ⅴ，分别选取了其关键基因ND-4，SDHA，COX-4和ATP5A，对其进行mRNA和蛋白水平的双重检测。在去卵巢组大鼠骨髓间充质干细胞中，这4个关键基因的mRNA都有不同程度的低表达，见图4A；同样，这4个关键基因的蛋白水平也有不同程度的低表达，见图4B，C。



2.5   去卵巢组大鼠骨髓间充质干细胞线粒体内抗氧化酶的表达下降   选取线粒体内重要的抗氧化酶超氧化物歧化酶2及其上游调控因子沉默信息调节因子1，对两者进行mRNA水平和蛋白水平的双重检测。在去卵巢组大鼠骨髓间充质干细胞中沉默信息调节因子1的mRNA表达下降，同时其下游的抗氧化酶超氧化物歧化酶2的mRNA表达也下降，见图5A。同样，沉默信息调节因子1和超氧化物歧化酶2两者在去卵巢组大鼠骨髓间充质干细胞中的蛋白水平都有所下降，见图5B，C。



2.6   去卵巢组大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化潜能下降   成骨诱导14 d，去卵巢组大鼠骨髓间充质干细胞的钙结节明显减少，见图6A。茜素红定量分析结果与上述一致，见图6B。成骨相关基因检测显示，去卵巢组大鼠骨髓间充质干细胞中RUNX2，SP7，BGLAP的mRNA表达量低于假手术组大鼠骨髓间充质干细胞，见图6C。

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骨质疏松症是一种常见的全身代谢性疾病，以骨量减少和骨组织微结构恶化为特征，易导致骨脆性和骨折风险的增加[1-2]。年龄和以雌激素缺乏为主的内分泌或营养因素是骨质疏松性发病的主要危险因素。因此，绝经后妇女一直是骨质疏松性的高发人群[3-4]。同时随着中国人口老龄化的加剧，骨质疏松症已成为中国面临的重要公共健康问题[5]。

多项研究发现，在骨质疏松人群体内存在着高水平的氧化应激[6-7]。相较于同龄健康人群，骨质疏松患者体内的活性氧自由基明显增多[8]。而线粒体是细胞内氧化应激发生的主要场所，是活性氧自由基的主要来源，过多的活性氧自由基会损伤其功能[9-10]，包括损伤线粒体内膜的呼吸链使得相关的抗氧化酶活性降低，促使线粒体DNA产生突变以及改变线粒体膜的通透性，使其膜电位水平下降[11-12]。这些线粒体损伤对于细胞内的氧化还原平衡有着严重的破坏。

骨形成的重要条件之一是骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向的分化[13-14]。在体外培养成骨细胞分化过程中伴随着能量代谢、细胞内ATP的合成和线粒体膜电位的变化[15-16]。那么，这种高水平的氧化应激而导致的线粒体损伤，是否会对骨髓间充质干细胞的成骨分化能力有影响？具体作用机制是什么？有待进一步探索。该实验针对骨质疏松大鼠骨髓间充质干细胞的线粒体功能和线粒体抗氧化能力进行研究，探索骨质疏松状态下骨髓间充质干细胞内线粒体功能和相关抗氧化酶发生的变化，以及这种变化对于其成骨分化能力的影响。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   设计   动物模型建立和细胞学体外观察，统计差异分析使用成组t检验比较。
1.2   时间及地点   实验于2020年9月至2021年8月在苏州大学骨科研究所完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   8周龄雌性SD大鼠10只，体质量(200.0±5.6) g，购自苏州大学动物中心，动物质量合格证号：SYXK(苏)2017-0043，大鼠饲养于特定的无病原体环境中，22-24 ℃恒温，50%-60%湿度，12 h光照/12 h黑暗交替循环，自由获取所需饮食。所有动物手术和实验程序均在苏州大学伦理委员会的批准下进行(批准号为SUDA20211206A01)，同时严格遵守实验室动物护理和使用的指导方针。
1.3.2   实验试剂和仪器   胰酶、胎牛血清、PBS、α-MEM培养基(Hyclone，美国)；红细胞裂解液(碧云天，中国)；抗坏血酸、地塞米松、β-甘油磷酸钠、茜素红、TRIzol(Sigma，美国)；反转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(Takara，日本)；JC-1、活性氧、ATP检测试剂盒(碧云天，中国)；MitoSOX RED 检测试剂盒(Invitrogen，美国)；酶标仪(Bio-Tek，美国)；倒置荧光显微镜(Olympus，日本)；流式细胞仪(Beckman Coulter，美国)。
1.4   实验方法   
1.4.1   动物模型建立   8周龄雌性SD大鼠10只，随机分成假手术组和去卵巢组，每组5只。采用腹腔内注射3%戊巴比妥钠30 mg/kg对大鼠进行麻醉，麻醉成功后在大鼠两侧髂嵴水平处沿后正中线向上作一长约1 cm的纵形皮肤切口，钝性分离皮下组织、肌肉并充分暴露手术视野，可见粉红色桑葚样卵巢及淡红色输卵管。去卵巢组大鼠建立大鼠骨质疏松模型，即在距卵巢 5 mm 处结扎输卵管及伴随血管，切除卵巢及周围脂肪组织，然后按相同的方法摘除对侧卵巢，在确保摘除双侧卵巢后，逐层缝合腹膜及皮肤，碘伏消毒并连续注射3 d青霉素G (每只大鼠肌肉注射80 000单位)。假手术组大鼠实施和去卵巢组大鼠相同的手术操作但是保留双侧卵巢。
1.4.2   μCT分析   在摘除卵巢手术3个月后，使用Micro-CT(Skyscan1176，Kontich，比利时)检测远端股骨的微观结构特征。骨骼以高分辨率(18 µm)扫描，能量为65 kV和385 µA，利用NRecon v1.6和CTAn v1.13.8.1软件进行三维重建。选定股骨远端的松质骨作为感兴趣区域。采用骨密度、骨容积比2个指标评价骨微结构。
1.4.3   骨髓间充质干细胞的体外培养   假手术组和去卵巢组大鼠在3个月后实施安乐死并在无菌条件下取股骨，用α-MEM培养基冲洗骨髓腔，加红细胞裂解液充分裂解去除红细胞，从中分离骨髓间充质干细胞，然后将细胞接种于标准培养基(含体积分数10%胎牛血清、1%双抗的α-MEM培养基)中，放置在二氧化碳培养箱(37 ℃，体积分数为5%CO2)培养，每3 d换1次培养液，细胞融合至70%-80%用胰蛋白酶消化，按1∶3比例进行传代。在以下实验中使用的所有细胞都是第2代骨髓间充质干细胞。

1.4.4   成骨分化和茜素红染色   从两组大鼠中提取的第2代骨髓间充质干细胞以1×104/cm2密度接种在12孔板中，待细胞生长至60%密度后，在成骨诱导培养基(α-MEM培养基、体积分数为10%胎牛血清、100 nmol/L地塞米松、50 mg/L L-抗坏血酸、10 mmol/L β-磷酸甘油)中培养，成骨诱导培养基每3 d更换1次。成骨培养分化14 d用茜素红染色检测矿化水平。将细胞在40 g/L多聚甲醛(pH=7.4)中固定30 min，随后在0.1%茜素红溶液(pH≈4.3)中室温孵育约15 min，用Olympus IX5显微镜拍摄茜素红染色图片。在对茜素红染色进行定量分析时，每孔加入200 μL 5%高氯酸溶液来溶解钙化层，用酶标仪测定每孔在420 nm波长处的吸光度值。
1.4.5   实时定量反转录-聚合酶链式反应(qRT-PCR)   使用Trizol试剂提取第2代骨髓间充质干细胞内总RNA，按反转录试剂盒说明制备同等浓度的RNA体系，再借助反转录仪经反转录得到cDNA，根据iTaq Universal SYBR Green Supermix试剂操作指导，开展扩增测定。相关引物，见表1。

1.4.6   线粒体膜电位检测(JC-1)   采用JC-1线粒体膜电位检测试剂盒测定线粒体膜电位(ΔΨm)。根据试剂盒使用说明，用JC-1工作液37 ℃避光孵育待检测细胞30 min，孵育结束后用缓冲液清洗2次，然后用流式细胞仪检测，在488 nm处激发JC-1，用580 nm的长通滤波器检测，当线粒体膜电位水平高时，JC-1聚集在线粒体基质中，形成聚合物(J-aggregates)。当线粒体膜电位水平低时，JC-1为单体(monomer)。线粒体膜电位水平是根据聚合物(J-aggregates)的相对比例表示，使用FlowJo 10.7 软件(TreeStar, San Carlos, CA, USA)进行分析。
1.4.7   线粒体ATP水平检测   根据制造商说明，使用增强型ATP检测试剂盒测定ATP水平。将细胞悬液在4 ℃ 12 000×g离心5 min，收集上清液，每20 μL上清液加入100 μL的ATP检测工作液，一起放入黑色不透光96孔板，使用Centro LB 960 (Berthold Technologies, Germany)进行分析。根据说明绘制标准曲线，计算每孔的ATP水平，然后用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度，对每孔的ATP水平进行标化。
1.4.8   细胞内活性氧水平检测   使用活性氧检测试剂盒测定细胞内活性氧水平。首先，用0.25%胰酶-EDTA消化细胞，得到细胞悬液，然后在细胞悬液中加入10 µmol/L DCFH-DA试剂，37 ℃孵育10 min，使用流式细胞仪计数10 000个细胞进行活性氧水平检测，波长488 nm/530 nm，FlowJo 10.7软件进行分析。
1.4.9   线粒体特异性活性氧检测   采用特异性的线粒体荧光探针MitoSOXTM Red (Molecular ProbesTM, Invitrogen)来检测线粒体内的活性氧水平。首先，用0.25%胰酶-EDTA消化细胞，随后加入 5 μmol/L MitoSOXTM Red 37 ℃避光孵育10 min，使用流式细胞仪计数10 000个细胞进行活性氧水平检测，FlowJo 10.7 软件进行分析。
1.4.10   蛋白印迹实验   首先，使用RIPA裂解液从骨髓间充质干细胞中提取蛋白，然后在4 ℃，12 000×g条件下离心30 min得到上清液，使用BCA检测试剂盒测量样品的蛋白浓度，10%SDS-PAGE凝胶电泳分离等量的蛋白，然后选用硝酸纤维素膜进行转膜，封闭液封闭30 min后使用沉默信息调节因子1，超氧化物歧化酶2，ND-4，SDHA，COX-4，ATP5A和TUBLIN一抗(表2)孵育过夜，第2天二抗孵育1 h后曝光，用ImageJ 软件(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)进行定量分析。

1.5   主要观察指标   ①μCT分析骨密度及骨容积比参数；②各组细胞线粒体膜电位和ATP产生水平；③各组细胞矿化能力和成骨基因的表达。
1.6   统计学分析   采用SPSS 13.0进行统计分析，各项数据以均值±标准误表示。统计差异分析使用成组t检验，P < 0.01为各组间差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过苏州大学生物统计学专家审核。

此次研究中，先建立假手术组和去卵巢组大鼠模型，随后提取假手术组和去卵巢组大鼠骨髓腔内的细胞并进行贴壁培养，因为在细胞传代时，骨髓间充质干细胞更容易被胰酶消化，利用这一特征从而分离并纯化得到骨髓间充质干细胞。利用活性氧检测试剂盒对假手术组和去卵巢组的骨髓间充质干细胞进行细胞内的活性氧水平检测，发现去卵巢组大鼠骨髓间充质干细胞的活性氧水平明显高于假手术组大鼠骨髓间充质干细胞，这证明了去卵巢组大鼠骨髓间充质干细胞内的确存在着高水平的氧化应激。另外有研究表明，除了活性氧，活性氮在细胞内的氧化应激中也发挥重要作用，其作为一种强大的氧化剂，通过与超氧化物反应形成过氧亚硝酸盐，对细胞内相关代谢酶产生损伤[17]。

近年来研究表明，骨质疏松的发生与氧化应激关系密切，这可能与骨细胞线粒体内氧化还原稳态相关[18-20]。体内自由基的含量决定着氧化应激水平的高低。活性氧主要产生于线粒体，正常状态下，活性氧可被过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等抗氧化酶分解，从而保持着动态平衡。相关文献报道，与对照组相比，绝经后骨质疏松患者血清/血浆中的过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性有明显下降[21-22]。在氧化应激条件下，线粒体内过量的活性氧则会攻击线粒体，从而导致线粒体DNA的突变，损伤呼吸链使相关酶活性降低，损伤线粒体内膜的通透性使其膜电位水平下降，破坏氧化还原平衡[23-25]。对此，选取了MitoSOX Red这一新型的线粒体荧光探针，它可特异性靶向线粒体从而针对线粒体内的超氧化物进行检测[26-27]。与作者预想的一样，相较于假手术组，去卵巢组骨髓间充质干细胞中线粒体活性氧水平有着明显的提升，这证明去卵巢组大鼠骨髓间充质干细胞的线粒体内存在过多未被清除的活性氧。那么，这些多余的活性氧是否对线粒体的功能产生影响呢？为此，作者首先选择了JC-1这一阳离子染料，它可以在线粒体内聚集，当线粒体膜电位正常时，它通过线粒体膜极性进入线粒体基质内，形成发射红色荧光的聚合物(J-aggregates)；相反，当线粒体跨膜电位去极化时，它则表现为绿色荧光的单聚体[28-29]。对假手术组和去卵巢组大鼠骨髓间充质干细胞进行JC-1流式检测发现，去卵巢组的聚合物(J-aggregates)比例下降，说明过量的活性氧攻击了线粒体内膜，使其膜电位水平下降。在骨髓间充质干细胞的成骨分化过程中，是由信号通路、转录因子和表观遗传机制多种因素共同参与的，其中能量代谢扮演着重要角色。线粒体是公认的细胞内能量代谢的中心[10]。因此，针对线粒体合成ATP为细胞供能这一重要的生物学功能，使用了增强型ATP检测试剂盒[30-31]，分别对假手术组和去卵巢组大鼠骨髓间充质干细胞进行检测，发现去卵巢组大鼠骨髓间充质干细胞的ATP产量有明显下降。膜电位水平和ATP产量的下降，证明去卵巢组大鼠骨髓间充质干细胞的线粒体功能严重受损。在年龄引起的骨质疏松症中，根据LV
等[32]研究证实，老年小鼠骨髓间充质干细胞内冗余的活性氧，同样导致了线粒体功能的受损，包括线粒体超微结构异常和氧化磷酸化产能不足。这与该研究结果是相似的。

由于线粒体是通过呼吸链产生ATP为细胞供能，呼吸链也是氧化磷酸化和线粒体中一些重要的抗氧化酶如谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶的重要影响因子[33]。针对呼吸链复合体Ⅰ，Ⅱ，Ⅳ，Ⅴ，分别选取了其关键基因ND-4，SDHA，COX-4和ATP5A[34-35]，对其进行mRNA水平和蛋白水平的双重验证，发现在去卵巢组大鼠骨髓间充质干细胞中这些关键基因都有明显下调，证明过多的活性氧确实对线粒体的呼吸链产生了损伤，而受损的呼吸链则会对相关抗氧化酶产生影响。相对线粒体而言，超氧化物歧化酶2作为线粒体中一种重要的抗氧化酶，其活性中心是锰，可以催化超氧化物自由基分解为氧和过氧化氢[36-37]，因此，它在线粒体的氧化还原稳态的调节中有着至关重要的作用。同样对超氧化物歧化酶2的mRNA和蛋白水平的表达进行检测，发现在去卵巢组大鼠骨髓间充质干细胞中超氧化物歧化酶2的表达水平有明显下降，代表了线粒体清除活性氧能力的减弱，这证明线粒体抗氧化功能和呼吸链的损伤有着重大的关联。超氧化物歧化酶2表达的下调或许与沉默信息调节因子1对超氧化物歧化酶2的调控有关。对沉默信息调节因子1的mRNA和蛋白水平进行检测，发现在去卵巢组大鼠骨髓间充质干细胞内其表达是下调的，这与课题组先前的研究结果相符合[38]。另外，GAO等[39]研究表明，沉默信息调节因子家族的另一位成员沉默信息调节因子3也与超氧化物歧化酶2密切关联，其可以通过去乙酰化作用来增强超氧化物歧化酶2的活性，从而对抗过多的活性氧。沉默信息调节因子3通过对线粒体稳态的调节可以促进干细胞的成骨分化。因此，去卵巢组大鼠骨髓间充质干细胞中高水平的氧化应激、受损的线粒体功能、呼吸链关键基因的损伤和抗氧化酶表达的下降，这些可能是导致去卵巢组大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化能力下降的重要原因。

当然该实验还有很多不足之处：①对于成骨能力的评价缺乏蛋白层面的解释；②对于线粒体损伤，如MitoDNA的检测、线粒体形态结构损伤的观察等，有待进一步研究；③对于成骨分化能力缺乏相关病理检测，在后续实验中还将进行体内层面的补充说明。

结论：线粒体作为细胞内能量代谢的主要场所，参与骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的过程。此次研究证实，在骨质疏松情况下，骨髓间充质干细胞内高水平的氧化应激，使得线粒体正常生物功能受到损伤，包括通过氧化磷酸化产生ATP和清除自由基的能力，最终导致干细胞成骨分化潜能下降。作者认为，这种由线粒体损伤引起的能量代谢障碍和抗氧化系统的损伤，在骨质疏松症的发生中起着重要作用。或许以线粒体为靶点对骨质疏松进行有效防治是未来临床研究中的一个新方向。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：
骨髓间充质干细胞：是一种具有多种分化潜能的多能基质细胞，尤其是其成骨分化潜能，在骨形成和骨质疏松的发生发展中扮演着重要角色。由于氧化应激和代谢障碍等原因，骨质疏松患者的骨髓间充质干细胞和健康人的骨髓间充质干细胞相比，其成骨分化能力严重受损，这也直接导致了骨形成的减少。
线粒体：在干细胞的分化过程中，能量代谢扮演着重要角色，线粒体是公认的细胞内能量代谢中心，健康的线粒体功能有助于维持骨髓间充质干细胞的多能性。线粒体对能量代谢的调控和细胞内氧化应激平衡的维持，在骨髓间充质干细胞的成骨分化过程中至关重要。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

骨髓间充质干细胞成骨分化是骨形成的先决条件。骨质疏松来源骨髓间充质干细胞内的高水平氧化应激，会对线粒体正常生物功能产生损伤。这种线粒体功能障碍，包括ATP产生水平的下降和抗氧化调控能力的受损，会对骨髓间充质干细胞的成骨分化能力产生负性影响，这会导致骨形成的不足和骨质疏松症的发生。目前许多骨组织工程相关的研究报道了这种线粒体损伤和骨质疏松症之间紧密相关。该研究从线粒体生物功能和抗氧化功能两大方面，证实了骨质疏松来源骨髓间充质干细胞中的线粒体功能障碍，是导致其成骨分化能力下降的关键因素之一。或许，将来可以为骨质疏松症或者骨质疏松性骨折的临床治疗提供新的思路。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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