高温高湿环境下重度中暑模型猪的建立

doi:10.12307/2022.534

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (17): 2678-2684.doi: 10.12307/2022.534

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高温高湿环境下重度中暑模型猪的建立

杨彦文，张静，毛玉玲，倪军，毛利宾，姚璐，王会英，刘秋明，马珍珍

中国人民解放军陆军第八十三集团军医院，河南省新乡市 453000

收稿日期:2020-12-22 修回日期:2021-01-27 接受日期:2021-09-13 出版日期:2022-06-18 发布日期:2021-12-24
通讯作者: 倪军，硕士，副主任医师，副教授，中国人民解放军陆军第八十三集团军医院，河南省新乡市 453000
作者简介:杨彦文，男，1984年生，河南省新乡市人，汉族，2009年成都中医药大学毕业，主治医师，主要从事血液净化专业研究。
基金资助:
军队后勤科研计划项目(CLJ20J026)，项目负责人：倪军

Establishment of a severe heatstroke pig model under high-temperature and high-humidity environment

Yang Yanwen, Zhang Jing, Mao Yuling, Ni Jun, Mao Libin, Yao Lu, Wang Huiying, Liu Qiuming, Ma Zhenzhen

The 83rd Army Hospital of Chinese PLA, Xinxiang 453000, Henan Province, China

Received:2020-12-22 Revised:2021-01-27 Accepted:2021-09-13 Online:2022-06-18 Published:2021-12-24
Contact: Ni Jun, Master, Associate chief physician, Associate professor, The 83rd Army Hospital of Chinese PLA, Xinxiang 453000, Henan Province, China
About author:Yang Yanwen, Attending physician, The 83rd Army Hospital of Chinese PLA, Xinxiang 453000, Henan Province, China
Supported by:
PLA Logistics Scientific Research Project, No. CLJ20J026 (to NJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
重度中暑：暴露于高温(高湿)环境和(或)剧烈运动一定时间后，新出现下列临床表现中的任意一条，且不能用其他原因解释：①中枢神经系统损害表现(如昏迷、全身抽搐、谵妄、行为异常等，格拉斯哥昏迷评分≤14分)；②核心温度≥40 ℃；③多器官(≥2个)功能障碍表现(肝脏、肾脏、横纹肌、胃肠、循环、呼吸功能损伤等)；④严重凝血功能障碍或弥漫性血管内凝血。
高温高湿环境：温度在35 ℃以上的生活环境和32 ℃以上的生产环境一般被定义为高温环境，相对湿度在60%以上的环境一般被定义为高湿环境。

背景：重度中暑小型动物模型由于体积小，限制了血液净化等临床干预手段实施，而大型动物模型国内外多采用狒狒等灵长类动物，成本高。研究采用的巴马小型猪，其遗传稳定性较好，与人的体温调节、心血管反应相近，容易获取，成本低廉。
目的：建立高温高湿环境中猪重度中暑模型，为实施血液净化等干预治疗提供实验平台。
方法：雄性实验小型猪12头，随机分2组，分组实验条件为：A组温度35-37 ℃(做对照)；B组温度44-47 ℃(建立高温高湿环境中猪重度中暑模型)，两组湿度均为(65±5)%；实验观察时间为4 h。详细记录小型猪的自主状态、结膜及提肛反射变化；采用多通道生理记录仪连续监测生命体征；造模前后检测实验动物全血细胞计数、肝肾功能、肌酸激酶等变化；实验终止后，取实验动物的重要脏器组织行病理检查。实验方案经解放军第八十三集团军医院医学伦理委员会批准。
结果与结论：①热暴露前(T-1 h)、热暴露(造模)结束实验前后B组猪自主行为和生命体征出现明显变化，B组小型猪实验后全血白细胞、活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间、血钾、肌酐及尿素氮、转氨酶及肌酸激酶水平均出现明显异常(均P < 0.05或P < 0.01)，6头小型猪尿常规均出现不同程度的变化，病理形态学观察显示多个脏器损伤；A组猪自主行为无显著异常，生命体征及实验室检查结果有轻微改变；②结果表明，实验动物猪在温度44-47 ℃、湿度(65±5)%的恒温恒湿环境中4 h，自主行为、生命体征及实验室检查均出现显著异常，达到重度中暑标准；实验动物猪重度中暑模型可重复性好，能满足临床重度中暑血液净化等研究需求。

https://orcid.org/0000-0001-6732-4489 (杨彦文)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 重度中暑, 大型动物, 多脏器衰竭, 模型, 猪, 高温, 高湿, 热损伤

Abstract: BACKGROUND: Due to the small size of severe heatstroke small animal models, there is a limitation to the implementation of blood purification and other clinical interventions, while mostly used large animal models, such as baboon, are expensive. The Bama miniature pig used in this study has good genetic stability, and is similar to the human body in terms of body temperature regulation and cardiovascular response, which is also easy to obtain and has low cost.
OBJECTIVE: To prepare the pig model of severe heatstroke under high temperature and high humidity environment, thereby providing an experimental platform for blood purification and other intervention treatments.
METHODS: Twelve male experimental miniature pigs were randomly divided into two groups (n=6 per group): group A (control) and group B in which a pig model of severe heatstroke was established. The experimental conditions are as follows: group A: temperature 35-37 °C; group B: temperature 44-47 °C; the humidity was (65±5)% in both groups; and the experiment in each group lasted for 4 hours. The autonomic state, conjunctiva and levator ani reflex were recorded in detail. The vital signs of experimental animals were continuously monitored by multi-channel physiological recorder. The whole blood cell count, liver and kidney function, creatine kinase, blood coagulation function and urine routine were detected before and after modeling. After the end of the experiment, the important organs and tissues of the experimental animals were taken for pathological examination. The study protocol was approved by the Medical Ethics Committee of the 83rd Army Hospital of Chinese PLA.
RESULTS AND CONCLUSION: Pigs in the two groups were exposed to different environmental conditions for 4 hours. There were significant changes in autonomous behaviors and vital signs of pigs in group B before and after the experiment, and also in laboratory examination results, including whole blood white blood cells, activated partial thromboplastin time, prothrombin time, blood potassium, creatinine and urea nitrogen, aminotransferase and creatine kinase levels (P < 0.05 or P < 0.01). Pathomorphological observations showed multiple organ injuries. There was no significant abnormality in autonomous behaviors of pigs in group A, and there were slight changes in vital signs and laboratory examination results. To conclude, after being exposed to the constant environment of 44-47 °C and humidity of (65±5)% for 4 hours, the pigs present with significant abnormalities in autonomous behaviors, vital signs and laboratory tests, which can reach the standard of severe heatstroke. The pig model of severe heatstroke has good repeatability, which can meet the needs of blood purification for clinical severe heatstroke.

Key words: severe heatstroke, large animals, multiple organ failure, model, pig, high temperature, high humidity, heat injury

中图分类号:

杨彦文, 张静, 毛玉玲, 倪军, 毛利宾, 姚璐, 王会英, 刘秋明, 马珍珍. 高温高湿环境下重度中暑模型猪的建立[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(17): 2678-2684.

Yang Yanwen, Zhang Jing, Mao Yuling, Ni Jun, Mao Libin, Yao Lu, Wang Huiying, Liu Qiuming, Ma Zhenzhen. Establishment of a severe heatstroke pig model under high-temperature and high-humidity environment[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(17): 2678-2684.

图/表（结果） 16

2.1 实验动物数量分析实验随机分A、B组各6头猪分别对实验前、后数据进行结果分析。
2.2 一般行为学观察 A组小型猪入舱后4 h步态行为无明显异常；B组小型猪入舱后行为出现变化，见表1。

2.3 两组小型猪在持续热应激时生命体征的动态变化两组小型猪在进入热舱后，在热暴露期间A组各实验动物核心温度无明显升高，维持在40 ℃左右的水平。在120 min时，出现呼吸频率32次/min，心率128次/min，直至实验结束，各实验猪呼吸及心率较前无明显变化，考虑各实验动物逐渐适应高温高湿环境。
B组在热暴露期间各实验小型猪表现出相似的体温调节反应，前90 min上升速率较快，核心温度从基础体温迅速上升到41 ℃，此后30 min内，核心温度上升速率有所下降，随后平稳上升；180 min时上升至42 ℃以上。热暴露60 min后出现呼吸加快，约40次/min，并伴有心率逐渐加快约112次/min；随后的90-120 min时，心率快速上升并达高峰180次/min左右，呼吸深快，氧饱和度98%左右，持续60 min，出现心率开始下降，呼吸由深快变为浅快，氧饱和度缓慢降低，见图1；120 min后血压迅速上升至峰值，平均动脉压在160 mmHg左右，见图2。随着热应激的延长，血压、心率、氧饱和度开始缓慢下降，当平均动脉压下降25 mmHg后，呼吸、心率、氧饱和度迅速降低。

2.4 两组实验前后小型猪血液和尿液相关指标变化
2.4.1 热应激状态下机体炎症因子的变化与实验前比较，A组小型猪实验后全血白细胞水平轻度异常(P > 0.05)；B组小型猪实验后全血白细胞水平明显异常(P < 0.05)，见表2，图3。

2.4.2 热应激状态下对凝血的影响与实验前比较，A组小型猪实验后凝血指标活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间无明显异常(P > 0.05)；B组实验后凝血指标活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间明显异常(P < 0.05)，见表2，图3。
2.4.3 热应激状态下对电解质的影响随着热应激时间的延长，A组小型猪实验后血K+水平与实验前比较无明显异常 (P > 0.05)；B组实验后血K+水平明显异常(P < 0.05)，见表2，图3。
2.4.4 肾功能的影响与实验前比较，A组小型猪实验后小型猪肾功能指标未见明显异常(P > 0.05)；B组小型猪实验后肾功能相关指标肌酐及尿素氮均出现明显异常(P < 0.05)，见表2，图3。
2.4.5 热应激状态下对酶学指标的影响随着热应激时间的延长，A组小型猪实验后转氨酶及肌酸激酶水平与实验前比较，未见明显异常(P > 0.05)，见表2；B组实验后转氨酶及肌酸激酶水平出现明显异常(P < 0.05)，见表3。

2.4.6 热应激状态下对尿常规的影响 A组6头小型猪在热应激状态下，尿常规未出现明显异常，其中2头猪出现尿蛋白弱阳性，其余尿蛋白阴性；B组6头小型猪尿常规均出现的不同程度的变化，6头猪均出现尿蛋白阳性，其中3头猪出现潜血阳性及尿糖阳性，并有1头猪出现尿酮体阳性。表明在热应激状态下存在不同程度的肾功能损伤，见表4，5。

2.5 建模后B组小型猪各主要脏器病理改变
2.5.1 苏木精-伊红染色结果
(1)肺脏：可见肺泡腔明显扩张、水肿、肺间质散在出血，见图4。

(2)肝脏：肝中央静脉及肝血窦稍充血，在汇管区可见炎症细胞浸润，肝细胞轻度水肿，排列紊乱，可见点状出血，见图5。

(3)肠道：可见轻微黏膜水肿，淋巴滤泡增生，黏膜上皮未见变性、坏死，少量炎性细胞浸润，见图6。

(4)肾脏：肾小球毛细血管及肾间质血管扩张，神经节区可见轻度水肿，散在出血，肾小管受压变形，管腔狭窄，血管内可见血栓形成；少量炎性细胞浸润，见图7。

(5)心肌：心肌间血管出现扩张充血，肌细胞轻度变性，见图8。

(6)胰腺：可见被膜下出血，细胞水肿及少量炎性细胞浸润，见图9。

2.5.2 透射电镜观察超微结构
(1)肾脏：毛细血管内皮细胞明显空泡变性，节段性内皮细胞未见增生，部分毛细血管襻管腔狭窄。肾小囊壁层无明显增厚，壁层细胞空泡变性。基底膜：无明显增厚，厚度为 150-230 nm。脏层上皮细胞：上皮细胞肿胀，空泡变性。足突节段性融合。肾小管-间质：肾小管上皮细胞明显空泡变性。肾间质无特殊病变，见图10。

(2)肝脏：肝细胞轻度肿胀，细胞核无明显改变。肝胞浆内见轻度溶解现象，部分肝细胞可见少量小脂滴及空泡形成。肝细胞粗面内质网扩张，滑面内质网轻度增生、扩张，线粒体未见明显肿胀，偶见少量结晶形成。毛细胆管未见明显扩张、淤胆。肝窦内皮细胞肿胀。肝细胞间及 Disse 间隙未见明显胶原纤维沉积。未见明显炎性细胞浸润，见图11。

(3)结肠镜下描述：上皮细胞排列相对整齐有序，胞表面可见少量微绒毛，局部微绒毛减少、缺失，上皮细胞间可见紧密连接，结构未见明显异常，局部可见杯状细胞，局部腔面可见杆菌，见图12。

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引言

近年随着全球气候变暖，中国各地连续高温天气频繁发生，中暑的发病率逐年增加，高温气候对公共健康安全已造成灾害性后果[1-3]。
国内外学者根据经济性、可靠性和实用性综合考虑，大鼠、兔子成为了最常用的重度中暑动物模型[4]，在热应激状态下对其病理生理学变化特点及炎症因子进行了大量相关研究。小型动物模型在重度中暑损伤机制研究方面有其优势，但在重度中暑早期干预治疗的研究中因其体积小而受到显著限制；重度中暑大型动物模型国内外甚少，国外多采用狒狒等灵长类动物，实验成本高，不易重复。此次研究选用的巴马小型猪是重要的实验动物品系，其温顺性好、可操作性强、易获取、成本相对低，且遗传稳定性较好，与人的体温调节及心血管反应相近，其肌肉、神经系统、血液循环系统以及胸腹腔的脏器特别是消化生理功能与人体有较好的相似性和可比性[5]，对于从细胞、组织到器官水平系统研究重度中暑对机体病理生理的影响提供了最理想的实验模型，也为早期实施血液净化等干预治疗提供实验平台。
国内外小型猪模型已经广泛用于消化系统、呼吸系统、心血管系统、泌尿生殖系统及神经系统等多个方面研究[6-10]，在探究人类疾病的预防措施、致病机制、治疗效果、药物筛选以及探索人类生命活动规律等方面均有重大的进展。
通过文献检索，实验动物猪重度中暑的诊断要点有：①自主行为显著异常，包括站立不稳、行走摇晃、躯体颤动、大汗、口腔分泌物增多等；②核心温度达到42 ℃以上；③生理反射的变化，包括角膜反射、提肛反射减弱或消失等。符合上述3点即可诊断重度中暑。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计完全随机构建模型猪实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2019年8-10月在解放军陆军第八十三集团军医院血液内分泌实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物健康雄性巴马小型猪12头，普通级小型猪(CV)级别，体质量10-15 kg，由泰州泰和生物科技有限公司动物实验中心提供，动物许可证号：SCXK(苏)2017-0010。正常体温范围为38-39 ℃(100-102 F°)，呼吸频率为12-18次/min，心率(103±14)次/min，收缩压(148±15) mmHg，舒张压(96±14) mmHg，平均动脉压(118±14) mmHg。所有动物均无感染和寄生虫，分别抽取血样进行常规检测，检验结果显示血细胞计数、凝血功能、肝肾功能、心肌酶均在正常范围[5，11-13]。实验前于解放军陆军第八十三集团军医院动物实验中心隔离间饲养１周，周围环境温度恒定在(23±1) ℃，湿度(50±5)%，提供正常饲料、饮用水。
1.3.2 实验用主要药品和仪器盐酸氯胺酮注射液(江苏恒瑞医药股份有限公司)；改良型F800-Z恒温恒湿气候舱(广东富宸电器有限公司)；多参数监护仪(PM-9000A，湖南省瑞博科技有限公司)、氧气浓度检测仪、高灵敏度电子体温计、一次性单通道婴儿无创血压袖带(湖南省瑞博科技有限公司)；高精度专业电子计数秤(蓉城电子，浙江永康)。
1.4 实验方法
1.4.1 实验分组实验前12头巴马小型猪均禁食、水(空腹12-24 h)。随机分A组与B组，每组6头，分别给予编码标记，A组：HS-A1，HS-A2，HS-A3，HS-A4，HS-A5，HS-A6；B组：HS-B1，HS-B2，HS-B3，HS-B4，HS-B5，HS-B6。
1.4.2 建立重度中暑猪模型
(1)核心体温及基础生命体征指标测量：用高灵敏度电子体温计测量小型猪核心温度，以Tc代表。于热应激前30 min内(-30、-15 和0 min)快速使用多参数监护仪(PM-9000A)快速连续监测3次核心温度(Tc)、呼吸(R)、心率(HR)、血压(BP)及氧饱和度(SO2%)，并做记录，作为基础核心体温及生命体征测量值。热应激开始后每30 min测量一次核心体温，直至达到42 ℃以上。

(2)热应激方法及重度中暑实验终止标准：待基础核心体温及生命体征稳定后，分别将A组实验动物置于预热的恒温恒湿气候舱中保持在35-37 ℃，相对湿度(65±5)%；B组实验动物置于预热的恒温恒湿气候舱中保持在44-47 ℃，相对湿度(65±5)%。核心温度由可重复使用的高灵敏度体温计进行监测，该体温计的校准温度为0-50 ℃。每次测量体温时将体温计通过操作窗插入实验猪直肠内。一次性无创血压袖带套在实验动物后腿股内动脉处，对实验动物的血压进行监测。每30 min监测一次核心温度、呼吸、心率、血压、氧饱和度，记录各项指标变化。实验动物达到中暑诊断标准后终止实验，从恒温恒湿气候舱中取出。

1.4.3 大体观察及血液、尿液、组织取样 ①首先观察两组动物的精神状态、皮毛、皮肤、营养状况及运动状况；分别于热暴露开始前(T-1 h)、热暴露(造模)结束(T-0 h)取后肢外侧隐静脉血 2.0-3.0 mL(采用相应规格的EDTA-K2抗凝管)，离心并保存血清，并采集尿样；②高温高湿环境造模过程中每30 min观察一次猪神态、皮毛色泽、活动度，监测核心温度、呼吸、心率、血压、氧饱和度变化及生理病理反射情况；③造模结束取出动物后，采用氯胺酮注射液20 mg/kg耳后注射麻醉动物，固定于动物解剖实验台上，大剪刀备皮，碘伏消毒，沿腹部正中切开，游离周围组织并阻断主要血管后，立即取安乐死小型猪各主要脏器病理标本 (肺脏、肝脏、心脏、胰腺、肾脏、结肠)。
1.4.4 生化检测和组织制备室温放置30-60 min，3 000 r/min离心5 min，取血清使用经过适当校准和控制的自动化设备来测定全血细胞计数、肝肾功能、肌酸激酶、凝血功能和尿液分析；取固定在中性甲醛缓冲液中的各组织切片，进行光学显微镜分析及电镜超微结构分析；并将组织埋入石蜡中，切片，采用苏木精-伊红染色后观察各标本病理改变。
1.5 主要观察指标 ①观察动物的自主状态、结膜及提肛反射变化；②热应激下动物生命体征变化；③动物全血细胞计数、肝肾功能、肌酸激酶、凝血功能及尿液分析；④动物的肺脏、肝脏、心脏、胰腺、肾脏、结肠组织切片分析。
1.6 统计学分析实验数据使用计算机SPSS 22.0软件包进行统计分析。计量资料采用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

重度中暑合并多系统、多器官功能损伤为主要死亡原因，对于如何降低重度中暑患者的致残率和病死率、改善预后尤为重要。此次研究拟建立一个重复性和操作性良好的大型动物重度中暑模型，研究临床血液净化治疗对重度中暑患者预后的影响，为制定临床血液净化治疗时机和治疗指征提供实验依据。
因动物热暴露条件不同、种系不同、对热暴露耐受程度不同等因素影响，国内外研究中针对不同动物形成的重度中暑标准也有差异。LIN等[14]、周京江等[15]研究在大鼠热射病发病早期免疫状态的观察中提出：当试验舱中温度(38.0±0.5) ℃，湿度(80±10)%，直肠温度达到42 ℃为造模成功的标志。王楠[16]在高温季节猪中暑的原因、临床症状、治疗和预防措施研究中指出：当猪发生中暑，一般会无法稳定站立、出现行走摇晃、躯体颤动、呼吸急促、呈现间歇性呼吸、明显喘气、伴有呕吐、口吐白沫及心律不齐等症状，体温明显升高，往往可超过42 ℃，瞳孔先放大后缩小，眼角膜充血，症状严重时四肢软弱无力，倒地后无法站起，四肢呈游泳状划动；部分病猪会有血样泡沫从鼻内流出，肺部出现严重浮肿，脑部明显充血，皮肤、肛门以及角膜反射都消失，最终失去意识。BOUCHAMA等[17]在研究中暑狒狒实验模型中，麻醉幼狒狒在恒温箱中承受44-47 ℃的热应激，直至直肠温度达到42.5℃(中度中暑)或收缩期动脉压下降到90 mmHg(重度中暑)为诊断中暑的标准。
此次实验结果发现，两组小型猪在自主行为、生命体征等方面表现出显著的不同：A组小型猪在热暴露过程中均无明显步态行为异常，核心温度无明显升高，在120 min时，出现呼吸频率加快(约32次/min)，心率加快(约138次/min)，直至实验结束，各实验猪呼吸及心率较前无明显变化；B组小型猪随着热应激时间的延长，出现大汗、行走不稳、精神淡漠、情绪低落、眼神迷茫，球结膜潮红或充血，角膜反射、提肛反射减弱或消失，呼吸频率浅快，心率加快，血压升高、氧饱和度下降。考虑在热应激情况下，实验猪出现行为的异常，早期即可出现神经系统严重功能障碍，持续高热对脑细胞造成的损害往往是不可逆的。对实验猪的尸体解剖发现，各实验猪存在不同程度的脑水肿。在热应激状态下，呼吸功能受影响显著，出现了通气障碍，且随中暑过程的演变，逐渐加重，尤其至发展至重度中暑阶段，呼吸运动明显减弱，呼气时相明显延长，提示氧气吸入明显下降，并伴有明显的 CO2潴留，出现了明显的呼吸衰竭，肺脏病理可见肺泡腔明显扩张、水肿、肺间质散在出血。表明高温对机体造成不可逆性损伤，因高热引起的全身性炎症反应[18]、肺血管内皮细胞损伤、弥漫性血管内凝血(DIC)等因素相互影响是诱发急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的主要原因。有研究表明，热损伤可导致呼吸系统功能损伤和多器官衰竭[19-21]，与此次研究结果一致。
此次研究发现，小型猪核心体温达42 ℃以上时，其血液中白细胞数显著增加；病理提示肠黏膜层轻度充血水肿，呈节段性改变，黏膜上皮可见变性、坏死，少量炎性细胞浸润，出现炎症反应。考虑因热应激可以直接激活炎症反应系统，释放大量白细胞及中性粒细胞、多种炎症递子和氧自由基而引起。有研究表明，热射病发病机制也是以“类脓毒症反应”[22-23]。肠道病理可见轻微黏膜水肿，淋巴滤泡增生，黏膜上皮未见变性、坏死，少量炎性细胞浸润，重度中暑患者在热应激下胃肠道黏膜上皮细胞受损，细胞通透性增加，致肠道菌群易位，继发性内毒素血症和全身炎症反应可能是导致血清白细胞介素水平显著升高的重要原因，内毒素血症中炎性细胞因子加重了肠黏膜损害[22]。由于高热所引起的全身炎症反应综合征明显增加多器官功能障碍综合征的发生风险，多器官功能衰竭是重度中暑发生的关键。
凝血功能障碍是弥漫性血管内凝血发生和发展过程中的重要病理改变，凝血因子的不断消耗会造成血管内凝血以及继发性凝血功能障碍、纤溶亢进，小型猪实验前后凝血功能指标比较发现，B组小型猪实验后活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间显著延长。分析认为：凝血酶原时间和活化部分凝血活酶时间分别反应内源性凝血功能和外源性凝血功能的指标，时间延长说明实验猪同时存在显著的内源性和外源性凝血功能障碍。在人类和动物中暑模型中检测到高水平的促炎和抗炎细胞因子，这些细胞因子与器官衰竭和死亡结果相关[24-25]。通过冷却使体温正常化并不能阻止炎症、凝血激活和进展到多器官功能障碍综合征[25]。此外，关于脓毒症研究的新证据表明，炎症和凝血在体内可互相作用，抑制炎症和凝血途径的治疗可以降低死亡率[23-24，26]。这些发现表明，炎症可能是发生血管内凝血的主要的病理机制。
此次实验小型猪肾脏病理结果提示，早期即可出现轻度水肿，散在出血，血管内可见血栓形成，以炎症损伤为主，表明在热应激下肾脏存在不同程度的损害，可能因热应激引起急性炎症反应、血凝系列异常、低血容量性休克和肌红蛋白的机械阻塞作用导致急性肾损伤[27]。ROBERTS等[28]通过研究热射病狒狒发现严重的热射病狒狒表现出肾衰竭、横纹肌溶解、肝损伤等多脏器功能不全综合征，中等程度热射病狒狒相应器官损伤程度相对减轻。研究还发现中暑狒狒血清中的弥漫性血管内凝血标志物凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间延长，D-二聚体升高，血小板数量减少[17，25]。与此次实验研究高度相似性。
此次实验中B组小型猪因高温造成的大量出汗和摄入水分不足，心脏的前负荷下降，心输出量增加，心肌需氧量增加、心动过速，输送至皮肤血管的血量减少，影响机体的散热；而且肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、乳酸脱氢酶等血清酶学发生明显变化，心脏病理可见心肌间血管出现扩张充血，肌细胞轻度变性，表明高温环境可导致心肌细胞的损伤和调亡。黄泼泼等[29]认为血清心肌酶升高与心脏在热应激状态下心肌受损有密切联系相符合。
此次实验研究表明，肝脏病理可见炎症细胞浸润，肝细胞轻度水肿，排列紊乱，可见点状出血及肝功能指标(谷丙转氨酶，谷草转氨酶)的异常改变。肝脏是机体的重要产热器官，热应激状态下肝糖原快速分解，其产生的热能严重热蓄积，会引起或加重局部肝细胞及窦状隙的组织损伤。热射病时肠道菌群易位，内毒素(LPS)经门脉循环进入肝脏，可使肝巨噬细胞在吞噬、化学趋化、细胞毒性及代谢方面均有明显增加，各种致炎因素相互作用，造成肝损伤[30]。国外研究者LIN等[14]建立了热射病动物模型，结果发现当核心温度超过42 ℃时即可造成肝细胞损伤，表现为谷丙转氨酶、谷丙转氨酶/谷草转氨酶比值显著下降[31]。临床研究表明，磷酸肌酸肌酶升高、代谢性酸中毒、急性肾损伤以及肝脏转氨酶升高与多器官损害相关[32-33]。
此次实验将小型猪暴露于高温、高湿环境中，模拟经典型重度中暑的发病过程。A，B组小型猪分别热暴露于气温35-37 ℃与44-47 ℃，湿度均为(65±5)%的恒温恒湿箱中，经过热暴露4 h两组实验猪均无死亡。A组猪经过热暴露4 h均无明显步态行为异常，核心温度无明显升高，在120 min时，出现呼吸频率加快，约32次/min，心率加快，约138次/min，直至实验结束，A组各猪呼吸及心率较实验前无明显变化，检验指标轻度异常；B组猪热暴露于4 h出现出现大汗、大量分泌物、呼吸加深加快、精神无精打采、活动明显减少、眼神迷茫、角膜潮红、提肛反射和角膜反射减弱或消失等重度中暑症状。监测核心温度达42 ℃以上，而50 ℃以上，湿度在80%的极端自然环境不易达到，而且由于实验环境及恒温恒湿舱材质的限制，必须有外源性热源辅助加热，但过高的温度会导致恒温恒湿箱的破坏，所以实验没有对50 ℃以上，湿度在80%的极端环境进行实验。此次实验研究结果表明：当实验猪暴露于44-47 ℃，湿度为(65±5)%环境中，各实验猪已经出现了重度中暑症状，早期即出现步态不稳等行为异常，伴有结膜充血、角膜反射及提肛反射减弱或消失等体征改变，监测核心体温在42 ℃以上，说明猪重度中暑造模成功。
从整体环境模拟来看，仿真气候仓具有温度、湿度可控的特点，能够模拟自然环境，且建模过程中小型猪处于清醒状态，更接近自然发病过程及人类热损伤的现状。应排除因实验环境、动物惊扰及检验误差而导致统计学差异。
此次实验探索了大型实验动物在高温高湿环境中重度中暑的实验条件，成功建立了小型猪重度中暑模型，具有良好的可重复性和操作性，易于推广使用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

高温高湿环境下重度中暑模型猪的建立

Establishment of a severe heatstroke pig model under high-temperature and high-humidity environment

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