从骨形态计量学上看，与对照组相比，模型组小鼠的骨小梁相对体积、骨小梁厚度和骨小梁数量均有显著降低(P < 0.000 1)；与模型组相比，实验组小鼠的骨小梁相对体积、骨小梁数量更低(P < 0.001)；从骨小梁分离度指标上分析可见，实验组小鼠的骨小梁疏松程度较模型组明显增加(P < 0.000 1)，见图3。

综上，此次实验结果显示，内皮细胞特异性敲除Piezo1可以加速激素性股骨头坏死的进程，并加重股骨头病变程度。
2.3   苏木精-伊红染色结果分析    苏木精-伊红染色结果可见，激素性股骨头坏死的病理学征象为空骨陷窝数量增加、骨细胞核被挤向边缘或固缩溶解和骨髓腔被脂肪组织所占据等；与模型组相比，实验组各项观测指标均有明显加重的表现，并且股骨头明显塌陷，见图4。综上，此次实验结果显示内皮细胞特异性敲除Piezo1具有影响激素性股骨头坏死发生和发展过程的可能。

激素性股骨头坏死是由于糖皮质激素使用过度引起的，好发于30-50岁青壮年的难治性疾病，它严重影响髋关节功能从而引起髋部残疾，是造成劳动能力丧失的主要疾病之一[1]。由于中国人口基数大，激素使用不规范，股骨头坏死高危人群的数量庞大而且呈逐年增多的态势，估计每年有20万新发的激素性股骨头坏死患者[2]。很显然，激素性股骨头坏死不仅给患者本人及家庭带来沉重负担，而且已经成为影响社会的公共卫生事件[3]。目前对于激素性股骨头坏死的治疗靶点尚不明确，因此找到激素性股骨头坏死的治疗新靶点是亟待解决的问题。

研究表明，糖皮质激素所导致的凝血系统异常与内皮细胞的损伤有关。血管内皮细胞分泌的前列腺素F1α在兔子股骨头坏死模型中显著减少，这就直接影响了正常的血管舒张并抑制了血小板聚集，最终导致血栓的形成。Piezo1是一种新发现的钙离子渗透性非选择阳离子通道蛋白，这种蛋白可以对血流摩擦力作出应答并调控血管结构[4-7]。血管内皮生长因子是一种促进血管生成的刺激因子，有研究发现，在缺少Piezo1蛋白的情况下，人脐静脉内皮细胞的迁移趋势被抑制，并且人脐静脉内皮细胞的生长也受到影响。在动物实验中，Piezo1基因敲除具有胚胎致死性，其原因是内皮细胞结构紊乱和大血管的缺失。内皮细胞特异性敲除Piezo1基因后，小鼠同样表现出生长迟滞和血管结构的异常。由此可见，内皮细胞中的Piezo1在促进血管生成和血管结构稳态方面具有重要的作用[4]。

有研究表明，在坏死的股骨头内，新生的血管、新生骨组织的重塑与血管内皮细胞生长因子在机体内的表达水平具有相关性，因此，作者提出科学假设，内皮细胞Piezo1蛋白可以介导小鼠激素性股骨头坏死的发生发展过程。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1   设计   随机对照动物实验，两组间数据比较采用独立样本t检验。
1.2   时间及地点   动物繁育、饲养、干预及标本采集于2017年6-12月，在广州中医药大学动物实验中心及岭南医学实验中心完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   SPF级Piezo1fl/fl小鼠、SPF级Cdh5 (PAC)-CreERT2转基因鼠(受赠于广州中医药大学李静教授)，8周龄，体质量22-24 g。动物繁育、饲养、干预在广州中医药大学实验动物中心完成，使用许可证号：SYXK (粤) 2018-0034。实验方案经广州中医药大学动物实验伦理委员会批准，批准号：2017030543。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2   实验药品及试剂   PBS(Gibco公司，美国)；40 g/L多聚甲醛(Biosharp公司，中国)；苏木精-伊红染色试剂盒(碧云天公司，中国)；脂多糖(Sigma公司，美国)；甲泼尼龙琥珀酸钠(Pfizer公司，美国)。
1.3.3   主要仪器   倒置荧光显微镜 (Olympus，日本)；micro-CT(Bruker，比利时)。
1.4   实验方法   
1.4.1   内皮细胞Peizo1基因敲除小鼠的构建   采用Cre/loxP重组酶原理特异性敲除内皮细胞中的Piezo1基因，将Cdh5 (PAC)-CreERT2转基因鼠与Piezo1fl/fl杂交，杂交后得到Piezo1-Cdh5-Cre- ( Piezo1fl/fl )及 Piezo1-Cdh5-Cre+ ( Piezo1ΔEC ) 小鼠，具体构建方案参考前期研究[8]，杂交所得的Piezo1ΔEC小鼠经过特异性基因鉴定后，见图1，经腹腔注射Tamoxifen后诱导Cre重组酶基因表达，特异性敲除内皮细胞上loxP标记的Piezo1基因。 

1.4.2   股骨头坏死模型的构建   分别选取10只8周龄雄性Piezo1fl/fl小鼠按随机数字表法分为对照组和模型组；再选取5只8周龄雄性Piezo1ΔEC小鼠作为实验组。实验组和模型组小鼠造模方案为：连续2 d腹腔注射脂多糖20 μg/kg后，连续4周肌肉注射甲泼尼龙琥珀酸钠40 mg/kg；对照组处理方式为肌肉注射等量PBS。

12周龄时取材，向所有小鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉，分离双侧股骨，将骨骼周围组织剔除干净，置于40 g/L多聚甲醛中固定。

实验方案经广州中医药大学动物实验伦理委员会批准，批准号：2017030543。
1.4.3   Micro-CT扫描   使用Micro-CT对双侧股骨头进行扫描处理。扫描时，将样本置于直径约10 mm的标本管中，将标本管垂直置于扫描转盘上，并用蘸有体积分数75%乙醇的医用纱布包裹。扫描仪的参数设定为：电压80 kV，电流100 μA，总旋转角度360°，旋转角增量0.4°，层面厚度9 μm。使用Skyscan NRecon 软件对扫描后的结果进行处理，并利用Feldkamp圆锥束算法将二维图像的序列重建为15.9 μm各向同性体素大小的3D模型，并使用Custom Analysis 程序分析骨小梁相对体积、骨小梁厚度、骨小梁数量和骨小梁分离度等参数。
1.4.4   苏木精-伊红染色   左侧股骨头采用新鲜配制的0.5 mol/L EDTA进行脱钙处理，1周后，直至针头可刺穿为止。梯度乙醇脱水，进行石蜡包埋，在股骨头横径最大处切成厚度为4 μm的切片，在二甲苯中脱蜡，梯度乙醇复水，加苏木精染色5 min，伊红染液中染色2 min，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固，在光学显微镜下观察。 
1.5   主要观察指标   干预4周后于12周龄时获取各组小鼠双下肢骨骼样品，固定后进行Micro-CT扫描、三维重建、数据分析。脱钙，石蜡包埋切片后的骨骼样品行苏木精-依红染色，于倒置荧光显微镜下观察。
1.6   统计学分析   使用SPSS 19.0对实验测算的数据进行独立样本t检验，所有测算值均使用x±s的方式表示，当P < 0.05时认为差异有显著性意义。文章统计学方法已经广州中医药大学生物统计学专家审核。

非创伤性股骨头坏死有着十分复杂的病理变化，具体发病机制有待更深入的研究。作为非创伤性股骨头坏死的一员，激素性股骨头坏死已知的发病机制非常多样，比较常见的有血管内凝血学说、脂肪代谢紊乱及骨内高压学说、动脉血管炎学说、骨质疏松学说等，目前认为激素性股骨头坏死的发生是多因素综合作用的结果。近年从细胞和分子层面着手研究发现的激素相关内皮细胞异常、骨髓基质干细胞脂肪分化、破骨细胞的异常激活和非编码RNA介导的表观遗传机制及细胞自噬等亦被认为是导致股骨头缺血坏死的重要因素[9-11]。

Piezo1蛋白在机体的器官和组织中分布广泛，作为机械敏感离子通道的明星分子和重要蛋白发挥着重大的作用。Piezo1蛋白介导不同力学形式的刺激，对机体各部分有不同的作用，主要集中于骨骼、软骨、牙齿、血管内皮细胞、软骨细胞、髓核细胞和膀胱尿路上皮细胞[12]。LI等[13-14]研究证实，全基因敲除Piezo1将导致胚胎致死，表明Piezo1基因在胚胎血管形成中起着关键的作用，而血管内皮细胞内 Piezo1缺失则会导致血管紊乱。Piezo1可以将机械应力转化为生物电信号，在哺乳动物心血管系统中，动脉血管、毛细微血管、心脏和红细胞等都可感受来自细胞外环境的机械应力刺激，Piezo1通过介导血管内皮细胞的重塑而改善血管形态，还可以促进血管新生[15-17]。Piezo1能根据血液流动时对内皮细胞的不同作用力，而对血管产生相应的影响[18]。研究表明，特异性敲除内皮细胞Piezo1基因可以显著减轻由于血流动力学改变导致的血管炎症[19]。此外，赵璨[20]结合前人经验总结指出，Piezo1在脂肪组织中表达丰富，可增强脂肪细胞可塑性，抑制炎症反应，有望成为新的抑炎靶标。高血压状态下，血流激活阻力血管Piezo1通道，使钙内流增加，激活血管平滑肌细胞的谷氨酰胺转移酶，导致血管重构，表明Piezo1参与高血压引起的小血管重构[21]。刘蕾[22]证明血小板膜表面存在机械离子通道Piezo1蛋白，其可感受血流剪切力，影响Ca2+内流，从而抑制血小板的活化聚集和抗血栓的形成。基于Piezo1在血管形成、炎症反应、血小板活化、脂肪分化等的作用，内皮细胞特异性敲除Piezo1可加速激素性股骨头坏死的发展进程。

此外，Piezo1也参与了骨代谢过程。研究表明，Piezo1是间充质干细胞中的一种力学感受蛋白，流体剪切应力处理成骨细胞及增加小鼠的机械负荷可上调Piezo1的表达水平，而成骨细胞的微重力处理及减轻小鼠的机械负荷将得到相反的结果。Piezo1可以促进间充质干细胞的成骨分化并且抑制脂肪分化[23]，通过ERK1/2及p38MAPK信号通路促进间充质细胞向成骨细胞分化[24]。激活的Piezo1可以诱导 TRPV4 依赖性 Ca2+反应调节成骨细胞的增殖，并可能通过 Wnt/Ctnnb1途径对成骨细胞的分化起调节作用。除了影响成骨活性，Piezo1对破骨细胞活性的影响可能更加明显。WANG等[25]的研究发现，Piezo1可以通过YAP等途径减少Ⅱ，Ⅸ型胶原蛋白的生成，Ⅱ，Ⅸ型胶原蛋白通过其Arg-Gly-Asp (RGD)共有序列与破骨细胞表面表达的整合素相互作用，进而提升破骨细胞的活性，加重骨骼的破坏，这或许是Piezo1缺乏小鼠出现骨质疏松的重要原因之一。

Micro-CT能清晰地显示小鼠的骨微结构，还能对骨骼组织形态学进行定量分析，在标本研究领域已成为评价骨骼形态及微观结构的“金标准”[26-27]。作者结合Micro-CT及苏木精-伊红染色的方法观察小鼠股骨头坏死的严重程度，以探究内皮细胞特异性敲除Piezo1对激素型股骨头坏死的影响。从Micro-CT的扫描结果上看，经腹腔注射脂多糖及肌肉注射甲泼尼龙琥珀酸钠后，模型组的骨质遭到了明显的破坏，表现为骨小梁数量减少，骨小梁间间隙增大，骨小梁形态变细、变圆，由正常的扁平板状向细柱状转变。这种骨微结构的破坏使股骨头、股骨颈结构在受力时更不稳定，股骨头形态出现异常，进而导致造模组股骨头出现塌陷的概率增高。实验组Piezo1ΔEC小鼠表现出更疏松且不稳定的骨微结构，从三维重建图中可以看出，实验组小鼠的骨小梁短而细，排列紊乱，许多骨小梁的排列方向与受力方向不一致，股骨头形态异常，顶部凹陷，骨皮质变薄、空洞增加，骨髓腔内壁阴影增多，粗糙程度更高。苏木精-伊红染色进一步证实了Micro-CT中所看到的结果：造模组出现明显的骨质疏松改变，而实验组股骨头明显萎缩，骨小梁连续性更差；在切片上还能看到实验组的空骨陷窝明显增加。

自19世纪发展起来的Wolff’s定律认为机械压力对骨骼的生理健康起着十分重要的作用。但是，机械应力如何从分子水平对骨骼的生理病理产生影响则知之甚少，而机械敏感性蛋白的发现为机械应力-骨骼的研究注入了新的希望。既往的研究中表明，内皮细胞Piezo1对骨形成有十分重要的影响。由此可以猜测，内皮细胞Piezo1的缺失通过影响成骨细胞-破骨细胞作用网络从而导致骨骼在发育的过程中出现了结构紊乱，这种结构变化使骨骼承受外力的能力大幅下降。该骨骼特性使骨结构在面对激素等异常刺激时更加脆弱，当出现骨组织缺血、软骨下骨损伤时更易出现坏死、塌陷。另一方面，Piezo1在血管重塑及血管稳定方面有重要的作用。当Piezo1缺失时，股骨头内血管可能存在生理发育上的异常，这可能降低了股骨头的血液供应。内毒素脂多糖及激素等均可导致血管炎症使血管受到损伤，Piezo1缺失所导致的血管稳定性下降可能使血管更易闭塞或硬化，进一步加重股骨头缺血，从而增加坏死的可能。

综上，特异性敲除内皮细胞Piezo1基因可以加速激素性股骨头坏死小鼠的病变程度，Piezo1可以通过多种方式参与到激素性股骨头坏死的发生和发展过程中。然而，需要进行体内和体外的深入研究才能探讨内皮细胞中Piezo1介导股骨头坏死的具体分子机制。
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文题释义：
激素性股骨头坏死：是一种临床常见的、与激素相关的非创伤性股骨头坏死，主要表现为髋关节病变和活动功能减退。既往的研究表明，血液供应异常及骨代谢紊乱是导致股骨头缺血坏死的重要病理变化。
Piezo1：是一种新发现的机械敏感型通道蛋白，在压力、剪切力的作用下非选择性地介导 Na+、Ca2+等阳离子的转运。Piezo1在多种内皮细胞上表达，与血管生成、血管紧张度调节及血管结构稳定等密切相关。

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激素性股骨头坏死是由于糖皮质激素使用过度引起的，好发于30-50岁青壮年的难治性疾病。它严重影响髋关节功能从而引起髋部残疾，是造成劳动能力丧失的主要疾病之一。由于中国人口基数大，激素使用不规范，股骨头坏死高危人群的数量庞大而且呈逐年增多的态势，估计每年有20万新发的激素性股骨头坏死患者。很显然，激素性股骨头坏死不仅给患者本人及家庭带来沉重负担，而且已经成为影响社会的公共卫生事件。目前对于激素性股骨头坏死的治疗靶点尚不明确。因此，找到激素性股骨头坏死的治疗新靶点是亟待解决的问题。

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