通络生骨胶囊对激素性股骨头坏死模型大鼠Toll样受体4信号通路的影响

doi:10.12307/2021.113

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (26): 4150-4155.doi: 10.12307/2021.113

通络生骨胶囊对激素性股骨头坏死模型大鼠Toll样受体4信号通路的影响

刘金富1，曾平2，农焦2，范思奇2，钱晓芬1，冯程钦1，雷志强1，罗钧1，黄佳兴1

1广西中医药大学研究生学院，广西壮族自治区南宁市 530299；2广西中医药大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530023

收稿日期:2020-07-14 修回日期:2020-07-16 接受日期:2020-09-01 出版日期:2021-09-18 发布日期:2021-04-28
通讯作者: 曾平，教授，主任医师，广西中医药大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530023
作者简介:刘金富，男，1994年生，广东省叶潭镇人，汉族，广西中医药大学在读硕士，主要从事中医药防治股骨头坏死的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81960876)，项目负责人：曾平；广西地区自然科学基金项目(2017GXNSFAA198296)，项目负责人：曾平；大数据库时代广西股骨头坏死临床数据库的建设(2018XK073)，项目负责人：曾平

Effect of Tongluo Shenggu Capsule on toll-like receptor 4 signaling pathway in rats with steroid-induced osteonecrosis of the femoral head

Liu Jinfu1, Zeng Ping2, Nong Jiao2, Fan Siqi2, Qian Xiaofen1, Feng Chengqin1, Lei Zhiqiang1, Luo Jun1, Huang Jiaxing1

1Graduate School, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530299, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2First Affiliated Hospital, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2020-07-14 Revised:2020-07-16 Accepted:2020-09-01 Online:2021-09-18 Published:2021-04-28
Contact: Zeng Ping, Professor, Chief physician, First Affiliated Hospital, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Liu Jinfu, Master candidate, Graduate School, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530299, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
The National Natural Science Foundation of China, No.81960876 (to ZP); the Natural Science Foundation of Guangxi, No. 2017GXNSFAA198296 (to ZP); the Clinical Database Construction for Femoral Head Necrosis in Guangxi in the era of large databases, No. 2018XK073 (to ZP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
Toll样受体4(TLR4)信号通路：TLR4信号通路的激活有助于宿主消除入侵病原体，但其过度激活也可以干扰免疫平衡而导致一些疾病的发生，如自身免疫性疾病、慢性炎症性疾病或癌症等。
骨稳态：是指在骨骼系统内，骨组织能够通过自我调节，维持骨重建中成骨细胞及其主导的骨形成和破骨细胞及其主导的骨吸收平衡，进而维持骨的各项生理指标及其功能活动在正常范围，保持骨骼系统整体功能的稳定和有序。

背景：前期药理学研究发现通络生骨胶囊修复激素性股骨头坏死的机制多样，但对Toll样受体4(Toll-link receptors 4，TLR4)信号通路的影响未见报道。
目的：基于TLR4信号通路探讨通络生骨胶囊治疗激素性股骨头坏死的分子机制。
方法：将60 只雌性SD大鼠随机分为正常组20 只和造模组40只，采用内毒素联合甲强龙建立大鼠激素性股骨头坏死(SONFH)模型，正常组注射等体积生理盐水；造模完成后随机抽取正常组5只、造模组10只在光镜下观察造模效果。将造模成功的30只大鼠随机平均分为2组，分别为造模组和干预组，每组15只。干预组予通络生骨胶囊水溶液0.4 g/kg每天灌胃1次，连续4周；激素组、正常组予等剂量生理盐水每天1 次灌胃4周。干预结束后取各组大鼠两侧股骨头，观察股骨头外形，进行病理学组织检测，采用Western Blot检测各组大鼠股骨头TLR4、MyD88、肿瘤坏死因子α和核因子κB蛋白表达。实验方案经广西中医药大学动物实验伦理委员会批准。
结果与结论：①正常组大鼠股骨头可见外观润滑有光泽，无变形塌陷；激素组大鼠股骨头无光泽，呈紫色，面积较大；干预组大鼠股骨头趋于正常；②苏木精-伊红染色结果发现，激素组股骨头骨小梁稀疏甚至断裂骨细胞核固缩溶解、消失，空骨陷窝数量最多，与正常组和干预组相比空骨陷窝率差异有显著性意义(P < 0.05)；干预组可见骨小梁粗大、规则，细胞形态大多正常，较激素组有改善；③Western Blot检测结果显示，与激素组相比，正常组、干预组核因子κB、肿瘤坏死因子α、MyD88、TLR4蛋白表达量均明显降低(P < 0.05)；干预组与正常组TLR4和MyD88的表达量差异无显著性意义(p > 0.05)；④结果说明，通络生骨胶囊治疗激素性股骨头坏死的机制可能与抑制TLR4信号通路MyD88依赖型传递途径有关。

https://orcid.org/0000-0001-8312-0224 (刘金富)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 骨, 股骨头坏死, 激素性股骨头坏死, 通络生骨胶囊, TLR4, 信号通路, 大鼠

Abstract:
BACKGROUND: Early pharmacological studies have found that Tongluo Shenggu Capsule has various mechanisms for repairing steroid-induced osteonecrosis of the femoral head (SANFH), but its influence on the toll-like receptor 4 (TLR4) signaling pathway has not been documented.
OBJECTIVE: To investigate the molecular mechanism of Tongluo Shenggu Capsule in SANFH treatment based on the TLR4 signaling pathway.
METHODS: A total of 60 female Sprague-Dawley rats were randomly divided into a normal group (20 rats) and a model group (40 rats). Endotoxin combined with methylprednisolone was used to establish the SANFH rat model. The normal group was injected with normal saline at the same volume. After modeling, 5 rats from the normal group and 10 rats from the model group were selected for observation under light microscope. The 30 rats successfully modeled were randomly divided into two groups: a hormone group and an intervention group with 15 rats in each group. The intervention group was given Tongluo Shenggu Capsule solution 0.4 g/kg once a day for 4 weeks. The hormone group and the normal group were given the same dose of normal saline for 4 weeks, once a day. The hormone and normal groups were given the same amount of normal saline once a day for 4 weeks. After the end of intervention, bilateral femoral heads of rats in each group were taken for morphological observation and pathological detection. Expressions of TLR4, MyD88, tumor necrosis factor-β and nuclear factor-κB proteins were detected by western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: The femoral head of rats in the normal group had a lustrous and smooth appearance without deformation or collapse. The femoral head of rats in the hormone group had a dull, purple appearance and a large area, while the femoral head of rats in the intervention group tended to be normal. Hematoxylin-eosin staining results showed that in the hormone group, trabeculae of the femoral head were sparse and even broken, bone nuclei were solidified, dissolved and disappeared, and the number of empty bone lacunae was the largest. Compared with the normal group and the intervention group, the difference in the rate of empty bone lacunae was significant (P < 0.05). In the intervention group, the bone trabeculae were large and regular, and the cell morphology was mostly normal, which was improved compared with the hormone group. Protein levels of nuclear factor-κB, tumor necrosis factor-β, MyD88 and TLR4 detected by western blot were significantly lower in the normal group and the intervention group than in the hormone group (P < 0.05). There was no significant difference in TLR4 and MyD88 expression between the intervention group and the normal group (P > 0.05). In conclusion, the mechanism of Tongluo Shenggu Capsule in SANFH treatment may be related to inhibition of MyD88-dependent TLR4 signaling pathway.

Key words: bone, osteonecrosis of the femoral head, steroid-induced osteonecrosis of the femoral head, Tongluo Shengu Capsule, TLR4, signaling pathway, rat

中图分类号:

刘金富, 曾平, 农焦, 范思奇, 钱晓芬, 冯程钦, 雷志强, 罗钧, 黄佳兴. 通络生骨胶囊对激素性股骨头坏死模型大鼠Toll样受体4信号通路的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(26): 4150-4155.

Liu Jinfu, Zeng Ping, Nong Jiao, Fan Siqi, Qian Xiaofen, Feng Chengqin, Lei Zhiqiang, Luo Jun, Huang Jiaxing. Effect of Tongluo Shenggu Capsule on toll-like receptor 4 signaling pathway in rats with steroid-induced osteonecrosis of the femoral head[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(26): 4150-4155.

图/表（结果） 3

2.1 实验动物数量分析 SD大鼠60只，其中15只用于模型验证；其余大鼠分为3组，实验过程无脱失，45只进入结果分析。
2.2 大鼠股骨头形态观察正常组大鼠股骨头均可见外观无变形塌陷，股骨头软骨表面润滑有光泽。激素组大鼠股骨头可见关节软骨表面色泽较正常组略暗，失去光泽，呈紫色，面积较大，骨质较脆。干预组大鼠股骨头关节软骨表面部分出现色暗无光泽，坏死面积较模型组小，外观无明显变形塌陷。见图1。

2.3 大鼠股骨头组织苏木精-伊红染色结果病理学检查是验证造模成功的金标准，动物处死后取股骨头制作病理切片。电镜下观察正常组细胞结构正常，空骨陷窝较少；激素组空骨陷窝数量最多，骨细胞中脂滴充满，细胞核被挤向边缘，骨髓造血组织减少，脂肪细胞堆积，骨小梁稀疏、变细变薄，甚至断裂，骨细胞核固缩溶解、消失，成骨细胞消失，脂肪组织和增大的脂肪细胞占据骨髓区，按ARCO标准，为0期股骨头坏死；干预组可见骨小梁粗大、规则，细胞形态大多正常，空骨陷窝较少。见图2。

2.4 空骨陷窝率的计算在光学显微镜下计算各组股骨头空骨陷窝率(空骨陷窝数/骨陷窝数×100%)，正常组空骨陷窝率为(9.26±2.80)%，激素组为(29.56±8.41)%，干预组为(15.83±4.13)%。激素组、干预组空骨陷窝率明显高于正常组空骨陷窝率(P < 0.05)，干预组与正常组和激素组比较的差异有显著性意义(P < 0.05)。
2.5 大鼠股骨头组织中核因子κB、Myd88、肿瘤坏死因子α和TLR4的蛋白表达量 Western-blot结果显示与激素组相比，正常组、干预组核因子κB、肿瘤坏死因子α、MyD88、TLR4蛋白的表达量均明显降低，差异有显著性意义(P < 0.05)；正常组与干预组中TLR4和MyD88蛋白的表达量差异无显著性意义(P > 0.05)。见图3。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验。
1.2 时间及地点实验于2019年5至12月在广西中医药大学第一附属医院分子实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物选取6周龄清洁级雌性SD大鼠，体质量250-300 g，共60只，采用随机数字表法分为造模组及正常组2组，造模组共40只；正常组共20只。适应性喂养1周，将60只大鼠分笼，每笼5只，共12笼，需在环境保持通风、适时进行光照、温度控制在23-26 ℃、相对湿度在40%-70%范围内饲养大鼠，所以大鼠均在同一环境标准执行，均可自由获取食物及水源。实验动物来源于长沙市天勤生物技术有限公司；许可证号码：SCXK(湘)2014-0011。合格证编号：43006700014844。
1.3.2 主要实验药物及试剂通络生骨胶囊(浙江海正药业股份有限公司，批号：Z20040001)；甲基强的松龙(天津药业焦作，批号：H20080285)；大肠杆菌脂多糖(Sigma，批号：111M4035V)；ECL显色剂(索莱宝，PE0010)一抗：Anti-NF-kB p65 antibody (ab16502)，Anti-MyD88 antibody [EPR590(N)] (ab133739)，Anti-TNF alpha antibody (ab6671)，Anti-TLR4 antibody (ab13556)，Anti-beta Actin antibody (ab8227)，二抗：Goat Anti-Rabbit IgG H&L(HRP) (ab6721)均由Abcam公司提供。
1.4 实验方法
1.4.1 动物造模采用内毒素联合甲基强的松龙建立大鼠激素性股骨头坏死(SONFH)模型[9]。适应性喂养1周，取雌性大鼠40只，以10 μg/kg剂量的脂多糖尾静脉注射2次，每次间隔24 h，末次注射24 h后于两侧臀肌交替注射甲基强的松龙40 mg/(kg•d)，每24 h注射1次，连续注射3次。正常组予等体积的生理盐水注射。
1.4.2 模型鉴定建模完成4周后，随机抽取正常组5只，造模组10只，取双侧股骨头组织在光镜下观察，若与正常组相比，造模组有空骨陷窝形成、骨细胞核固缩、周围骨髓细胞坏死则认为造模成功[10]。

1.4.3 药物干预及分组模型鉴定后将造模组剩余30只大鼠随机平均分为2组作为激素组和干预组，正常组余15只。根据人和动物体表面积折算的等效计量，按照成人65 kg，大鼠300 g，通络生骨胶囊的成人用量为6 g/d，则大鼠的正常灌胃量为0.4 g/(kg•d)，每天灌胃1次，连续4周。激素组、正常组予等剂量生理盐水灌胃4周，每天1次。

1.4.4 组织病理学观察干预结束后麻醉各组大鼠取两侧股骨头，用体积分数10%水合氯醛按4 μL/g腹腔注射麻醉成功后，切开双侧髋关节取出双侧股骨头，将股骨头标本置于40 g/L多聚甲醛液固定48 h，10%EDTA-2NA缓冲液脱钙完成后，PBS冲洗，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，切片，常规苏木精-伊红染色。光镜下观察股骨头组织病理学改变，如空骨陷窝率，骨小梁结构，骨细胞、骨髓细胞形态变化。
1.4.5 Western-blot技术检测股骨头组织核因子κB、Myd88、肿瘤坏死因子α和TLR4的蛋白表达量取30 mg组织块置于离心管中，加入RIPA-PMSF裂解液200-400 μL，组织匀浆机匀浆后4 ℃，12 000 r/min离心5 min，取上清采用BCA法测定蛋白含量。加入4×蛋白上样buffer 100 ℃变性5-10 min。蛋白电泳：80 V恒压电泳约20 min，待样品进入分离胶层后，换用100 V恒压电泳1-1.5 h；转膜：200 mA恒流转膜60-90 min。抗体孵育：用TBST配制8%脱脂奶粉作为封闭液，将膜放入封闭液中封闭3 h。按抗体说明书上的推荐比例使用封闭液将一抗(Anti-NF-kB p65 antibody，Anti-MyD88 antibody，Anti-TNF alpha antibody，Anti-TLR4 antibody，Anti-beta Actin antibody)进行稀释，将膜放入稀释后的一抗中4 ℃ 孵育12 h。一抗孵育完成后，使用TBST洗膜3次，每次15 min。将膜放入按1：3 000比例稀释的二抗[Goat Anti-Rabbit IgG H&L(HRP)]中37 ℃ 孵育1 h，使用TBST洗膜3次，每次15 min，使用ECL显色剂对膜进行显色，于凝胶成像仪中进行曝光成像。
1.5 主要观察指标 ①大鼠股骨头形态观察；②大鼠股骨头组织苏木精-伊红染色结果；③空骨陷窝率；④大鼠股骨头组织中核因子κB、Myd88、肿瘤坏死因子α和TLR4的蛋白表达量。
1.6 统计学分析数据统计学分析采用SPSS 22.0软件完成，各组间股骨头空骨陷窝率和蛋白的表达属于完全随机设计资料，应在统计数据前检测数据的方差，若数据属于正态性且方差齐性数据，组间比较应采用单因素方差分析；若数据属于正态性但方差不齐，则采用Dunnett’s T3检验，

P < 0.05为差异有显著性意义。所得数据使用GraphPadprsim 8.0.1进行整理制图。

讨论

激素性股骨头坏死归属中医学“骨蚀”“骨萎”“骨痹”等范畴，早在黄帝内经就有了相关描述，《素问•长刺节论篇》曰：“病在骨，骨重不可举，骨髓酸痛，寒气至，名曰骨痹”。《灵枢•刺节真邪篇》曰“虚邪之入身也深，寒与热相传，久留而内著……内伤骨为骨蚀”。中医认为，糖皮质激素本属温燥之品，大量、长期使用则会助阳生热，伤津耗气，引起湿热塞结，困于脾土，久而生痰，经脉凝滞，血行不畅，筋骨失养，髓死骨枯，最终导致股骨头血流阻滞而发生坏死[11]。2019年版股骨头坏死中医辨证标准指出，早、中期股骨头坏死多为“瘀”症[12]，因此治理宜以活血化瘀止痛为主。通络生骨胶囊的主要成分是木豆叶，主要含有牡荆苷、异牡荆苷、木犀草素等多种黄酮类成分[13]，具有活血健骨、解毒消肿、化瘀止痛的功效[14]。药理研究发现木豆叶提取物不仅能抑制破骨细胞样细胞的形成和骨细胞活性[15]，并对成骨细胞骨形成有明显的促进作用[16]，对股骨头坏死有一定的改善作用，可能与骨髓间充质干细胞向成骨分化能力有关[17]。此次实验通过建立大鼠激素性股骨头坏死模型，经过干预后发现通络生骨胶囊可以改善动物模型股骨头色泽和骨质，减小坏死面积，对于坏死股骨头有修复作用，与前期的研究及文献报道一致[18-19]。同时，实验结果表明通络生骨胶囊有效抑制激素性股骨头坏死大鼠模型股骨头组织中空骨陷窝率的形成和TLR4、MyD88、肿瘤坏死因子α和核因子κB及蛋白表达。
骨稳态有赖于成骨细胞和破骨细胞构成的“骨吸收-形成”偶联，一旦这种偶联失效，则有可能发生激素性股骨头坏死塌陷[20]。研究表明，长期大量使用糖皮质激素诱导成骨细胞凋亡增加和延长破骨细胞的生存时间，导致骨量丢失，骨小梁纤细、变薄[21]，负重下易发生破碎，再修复发生异常，长期受应力积累下导致股骨头塌陷，同时伴有血管内皮生长因子表达的减少，骨组织血运受到破坏，最终导致激素性股骨头坏死的发生[22]。
研究证实TLR4信号通路在激素性股骨头坏死的发病中起关键作用[23]，可能与调节骨代谢有关。Toll样受体(TLRs)是一个受体家族，在先天性和适应性免疫应答激活中发挥重要作用[24-25]，TLR4是研究最多的TLRs之一，属于PRRs家族，具有2个结构域，一个是由608个残基组成的胞外结构域，另一个是由187个残基组成的胞内结构域，在多种细胞表面均有表达[26-27]，已有研究表明骨细胞中过度表达的TLR4可以诱导破骨细胞形成[28]，并抑制成骨细胞分化[29]，进而影响骨代谢。TLR4作为脂多糖的受体与脂多糖相结合之后，需要MyD88从而正确发出信号反应，这是在模式连接后的第一阶段激活的重要衔接子，以促进免疫反应。
目前研究发现TLR4跨膜受体结构的激活主要通过2种方式传递信号，MyD88依赖型和MyD88非依赖型2种[30]。TLR4通路的信号转导中MyD88依赖型模式较多[31]，MyD88在MyD88依赖型的传递方式中发挥重要作用，在TLR4信号通路的下游介导核因子κB的激活，而核因子κB依次诱导共刺激分子表达以激活破骨细胞[32]。核因子κB转录因子家族包括5个成员p50 (核因子κB1)，p52 (核因子κB2)，RelA (p65)，RelB和c-Rel[33]，参与炎症和免疫反应相关基因调控[34]，位于TLR4信号通路下游，通过调节破骨细胞活性在骨形成中起重要作用[35-36]。核因子κB1(p50)和核因子κB2(p52)双敲除小鼠由于完全缺乏破骨细胞而表现出严重的骨质疏松，这表明破骨细胞的分化需要核因子κB的激活[37]。核因子κB在破骨细胞形成中主要有经典途径和非经典途径，经典途径是在破骨前体细胞对RANKL的应答中迅速启动，而非经典途径主要是IKKα作用于下游NIK分子而形成[38]。
肿瘤坏死因子α是炎症的关键调节因子之一，属于TNF配体超家族，是合成的Ⅱ型整合膜蛋白，存在于多种细胞类型中[39]，是TLR4信号通路下游重要的炎症因子，过度激活的TLR4信号通路促进肿瘤坏死因子α的合成和分泌，通过结合特异性受体导致核因子κB活化[26]，进而影响骨代谢。研究发现肿瘤坏死因子α是成骨细胞分化的抑制剂和破骨细胞形成的激活剂，通过诱导成骨细胞凋亡、促进破骨细胞前体细胞的增殖，打破骨吸收和形成之间的平衡[40-42]。有研究阐明了免疫系统和骨骼系统之间存在联系，这导致了一个新的研究领域——骨免疫学的发展，这是一个骨骼和免疫系统相互作用的跨学科研究[43]，因此，免疫与骨科疾病有关[44]，骨稳态受多种因素的控制，包括免疫系统。
前期药理学研究发现通络生骨胶囊修复激素性股骨头坏死的机制多样[18-19]，但关于TLR4信号通路未见报道。此次研究发现，在股骨头外形上，通络生骨胶囊可改善股骨头骨质情况和淤血环境；分子水平上，激素组TLR4信号通路关键因子表达量明显增加，中药组则有所改善，说明在TLR4信号通路在激素性股骨头坏死体内处于激活状态，通络生骨胶囊有效抑制TLR4信号通路的活性，减少炎症因子的释放，可能通过纠正骨代谢紊乱从而修复坏死股骨头，证实了激素性股骨头坏死中存在免疫相关机制[43-44]。实验中还发现正常组与干预组中TLR4和MyD88蛋白的表达量差异无显著性意义(P > 0.05)，说明通络生骨胶囊对TLR4和MyD88蛋白抑制较强，可能主要通过阻断MyD88依赖型的传递途径，改善炎症环境从而到达修复坏死股骨头的作用。
综上所述，此次通过动物实验验证了通络生骨胶囊治疗激素性股骨头坏死的作用机制可能与抑制TLR4信号通路MyD88依赖型传递途径有关，为临床疗效提供分子学依据发挥中医药的独特作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

通络生骨胶囊对激素性股骨头坏死模型大鼠Toll样受体4信号通路的影响

Effect of Tongluo Shenggu Capsule on toll-like receptor 4 signaling pathway in rats with steroid-induced osteonecrosis of the femoral head

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