软骨下骨局部注射常山酮抑制转化生长因子β1信号通路缓解犬骨关节炎

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2539

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (14): 2147-2152.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2539

• 软骨组织构建 cartilage tissue construction • 上一篇下一篇

软骨下骨局部注射常山酮抑制转化生长因子β1信号通路缓解犬骨关节炎

任姜栋¹，沙力塔娜提·乌尔曼别克¹，努尔艾力江·玉山¹，吾湖孜·吾拉木¹，曹力²

新疆医科大学第一附属医院，¹关节外科，²骨科中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054

收稿日期:2019-06-11 修回日期:2019-06-13 接受日期:2019-08-09 出版日期:2020-05-18 发布日期:2020-03-13
通讯作者: 曹力，主任医师，教授，新疆医科大学第一附属医院骨科中心，新疆维吾尔自治区乌鲁木齐市 830054
作者简介:任姜栋，男，1980年生，山东省莱西市人，汉族，2018年新疆医科大学毕业，博士，副主任医师，主要从事骨与关节疾病研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(U1503221)

Local injection of halofuginone into the subchondral bone relieves canine osteoarthritis by inhibiting transforming growth factor beta 1 signaling pathway

Ren Jiangdong¹, Shalitanati • Wuermanbieke¹, Nuerailijiang • Yushan¹, Wuhuzi • Wulamu¹, Cao Li²

¹Department of Joint Surgery, ²Center of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China

Received:2019-06-11 Revised:2019-06-13 Accepted:2019-08-09 Online:2020-05-18 Published:2020-03-13
Contact: Cao Li, Chief physician, Professor, Center of Orthopedics, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
About author:Ren Jiangdong, MD, Associate chief physician, Department of Joint Surgery, First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. U1503221

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
Micro-CT：即微型计算机断层扫描，遵循的是与用于医疗的计算机断层扫描相同的原理，但可提供更高分辨率，Micro-CT和高分辨率外周定量计算机断层扫描系统是目前最有用的且拥有高分辨率的骨小梁和皮质骨超微结构成像，目前用于评估骨形态特征，作为传统组织学分析的补充替代方案。
X型胶原蛋白α1链(COL10A1)：为X型胶原蛋白的特异性裂解片段，X型胶原蛋白是软骨细胞肥大分化的典型标志，在骨关节炎进展过程中，软骨细胞肥大及其合成的促炎细胞因子助软骨破坏。

背景：研究表明随着破骨细胞骨吸收的增加，过度激活了的转化生长因子β1使骨吸收和骨形成解偶联，最终导致骨关节炎动物模型中软骨下骨的硬化表型，且可通过抑制转化生长因子β1信号传导减弱骨关节炎的进展。

目的：检测前十字韧带横切比格犬骨关节炎模型中局部注射常山酮是否可以延缓骨关节炎进展。

方法：将18只雄性比格犬分为假手术(对照组)、骨性关节炎组及治疗组，后两组通过前十字韧带横切构建骨关节炎模型，治疗组造模后于软骨下骨局部注射常山酮37.8 ng。在造模术后4，8，12，16周纵向测量血清Ⅱ型胶原C端肽(CTX-Ⅱ)和X型胶原蛋白α1链血清标志物的水平；术后16周Micro-CT扫描观察软骨下骨微结构；番红固绿染色及OARSI-Modified Manking评分评估关节软骨退变程度；免疫组织化学染色对比转化生长因子β1、基质金属蛋白酶13的表达情况。实验方案经新疆医科大学第一附属医院动物实验伦理委员会批准(批准号为IACUC20160304-07)。

结果与结论：①造模后8，12周，骨关节炎组X型胶原蛋白α1链水平高于治疗组和对照组(均P < 0.01)；②造模后8，12，16周，骨关节炎组CTX-Ⅱ水平均高于对照组和治疗组(均P < 0.05)；③骨关节炎组软骨下骨的骨体积分数较治疗组和对照组增加，骨小梁分离度降低，骨小梁模式因子减小(均P < 0.05)；④骨关节炎组OARSI-Modified Manking评分较对照组和治疗组更高(均P < 0.01)；⑤骨关节炎组基质金属蛋白酶13及转化生长因子β1的表达量较对照组和治疗组更高(均P < 0.01)；⑥对照组与治疗组上述各指标比较差异均无显著性意义(均P > 0.05)；⑦结果说明，局部注射常山酮可通过抑制软骨下骨中异常升高的转化生长因子β1，阻断异常骨重塑来减轻前十字韧带横切诱导的骨关节炎，表明这可能是骨关节炎的一种新的治疗选择。

ORCID: 0000-0003-1388-5541(任姜栋)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词:

骨性关节炎, 常山酮, 局部注射, 转化生长因子β, 软骨下骨

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that the increase of bone resorption in osteoclasts over-activates transforming growth factor beta 1 (TGF-β1), and uncouples bone resorption and bone formation, ultimately leading to a hardened phenotype of the subchondral bone in an animal model of osteoarthritis. Progression of osteoarthritis can be attenuated by inhibiting TGF-β1 signaling pathway.

OBJECTIVE: To detect whether osteoarthritis progression can be delayed by the local injection of halofuginone in Beagle models of osteoarthritis.

METHODS: Eighteen male Beagle dogs were randomized into a sham (control) group, a model (osteoarthritis) group, or a treatment (halofuginone) group. Animal models of osteoarthritis were made by anterior cruciate ligament transection in the latter two groups. Animals in the treatment group were given local injection of halofuginone (37.8 ng) into the subchondral bone. Serum levels of type II collagen C-terminal peptide (CTX-II) and type X collagen α1 chain (COL10A1) were measured at 4, 8, 12, and 16 weeks after modeling. The Beagle dogs were sacrificed at the 16th week after surgery, and the alterations of microarchitecture of the subchondral bone were detected by micro-CT. Articular cartilage degeneration was graded using safranin O and fast green staining combined with the Osteoarthritis Research Society International (OARSI)-modified Manking criteria. Immunostaining analyses were conducted to detect the expression levels of TGF-β1 and matrix metalloproteinase 13. The study protocol was approved by the Animal Ethics Committee of the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, with the approval No. IACUC20160304-07.

RESULTS AND CONCLUSION: The COL10A1 level in the model group was higher than that in the control group and the treatment group at 8 and 12 weeks after modeling (P < 0.01). The levels of CTX-II in the model group were higher than that in the control group and the treatment group at 8, 12, and 16 weeks after modeling (P < 0.05). Micro-CT examination showed that compared with the control and treatment groups, the bone volume fraction of the subchondral bone was increased in the model group, while the subchondral bone trabecular separation and the trabecular model factor were decreased significantly (all P < 0.05). The OARSI-modified Manking score was significantly higher in the model group than in the control group and the treatment group (both P < 0.01). Immunohistochemistry results showed that the expression levels of matrix metalloproteinase 13 and TGF-β1 in the model group were significantly higher than those in the control group and the treatment group (all P < 0.01). No significant differences in the above-mentioned indexes were found between the control group and the treatment group (all P > 0.05). Overall, local injection of halofuginon attenuates anterior cruciate ligament transection-induced osteoarthritis by inhibiting abnormally elevated TGF-β1 in the subchondral bone and blocking abnormal bone remodeling. Therefore, local injection of halofuginon may be a new therapeutic alternative for osteoarthritis.

Key words: osteoarthritis, halofuginon, local injection, transforming growth factor beta 1, subchondral bone

中图分类号:

任姜栋, 沙力塔娜提·乌尔曼别克, 努尔艾力江·玉山, 吾湖孜·吾拉木, 曹力 . 软骨下骨局部注射常山酮抑制转化生长因子β1信号通路缓解犬骨关节炎[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(14): 2147-2152.

Ren Jiangdong, Shalitanati • Wuermanbieke, Nuerailijiang • Yushan, Wuhuzi • Wulamu, Cao Li. Local injection of halofuginone into the subchondral bone relieves canine osteoarthritis by inhibiting transforming growth factor beta 1 signaling pathway[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(14): 2147-2152.

图/表（结果） 10

2.1 实验动物数量分析实验选用比格犬18只，分为3组，实验过程中无脱失，全部进入结果分析。

2.2 血清生化标志物变化骨关节炎组COL10A1水平在8周达到峰值，之后水平降低，但仍高于治疗组和对照组。骨关节炎组COL10A1水平在8周及12周显著高于对照组和治疗组(均P < 0.05)，而治疗组与对照组在各时间点COL10A1水平差异无显著性意义(均P > 0.05)，见图2。

骨关节炎组CTX-Ⅱ水平在12周达峰值，之后的16周时降低，但仍高于治疗组和对照组(均P < 0.05)；除术后4周外(P > 0.05)，骨关节炎组CTX-Ⅱ水平在术后8，12，16周均显著高于对照组和治疗组(均P < 0.05)。而治疗组与对照组在各时间点CTX-Ⅱ比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3。

2.3 胫骨平台大体形态观察骨关节炎组内侧胫骨平台关节软骨表面出现溃疡，关节软骨光泽度下降，关节软骨从内侧胫骨平台前方脱落，关节软骨残留较少，磨损情况较为严重，部分区域关节软骨软骨缺损较重。与骨关节炎组相比，对照组和治疗组关节软骨光亮，关节软骨磨损程度不明显，大体观察关节软骨表面更完整，未见明显软骨下骨显露(图4)。

2.4 番红固绿染色及OARSI-Modified Manking评分通过番红固绿染色对照组及治疗组的标本中软骨细胞排列相对较整齐，排列相对疏松，软骨表面结构完整。而在骨关节炎组标本中软骨表面有中断，在部分软骨表面见明显的裂隙，并逐渐延伸到关节软骨深部，软骨细胞排列紊乱(图5A)。据OARSI-Modified Manking评分标准，对关节软骨的破坏程度进行量化，骨关节炎组评分高于对照组及治疗组(均P < 0.01)，而对照组与治疗组之间差异无显著性意义(P > 0.05)，见图5B。

2.5 关节软骨与软骨下骨中分子生物学指标分析与其他两组相比，基质金属蛋白酶13在骨关节炎组关节软骨中表达量更高(均P < 0.01，图6)；同时，与其他两组相比，转化生长因子β1在骨关节炎组关节软骨下骨中的表达量更高(均P < 0.01，图7)，而上述两指标在对照组与治疗组之间差异无显著性意义(P > 0.05)。

2.6 Micro-CT软骨下骨微观结构分析分别与治疗组、对照组相比，骨关节炎组软骨下骨的骨体积分数增加(图8)，骨小梁分离度(图9)及骨小梁模式因子减少(图10)，上述各指标与其他两组间差异均有显著性意义(P < 0.05)，而在对照组与治疗组间差异无显著性意义(P > 0.05)。各组标本软骨下骨微观结构见图11。

参考文献

[1] MCALINDON TE, BANNURU RR, SULLIVAN MC,et al. OARSI guidelines for the non-surgical management of knee osteoarthritis. Osteoarthr Cartil.2014;22:363-388.
[2] TANG X, WANG S, ZHAN S,et al. The prevalence of symptomatic knee osteoarthritis in China: Results from China Health and Retirement Longitudinal Study.Arthritis Rheumatol. 2016;68(3): 648-653.
[3] LEE S, KIM SJ.Prevalence of knee osteoarthritis, risk factors, and quality of life: The Fifth Korean National Health And Nutrition Examination Survey.Int J Rheum Dis. 2017;20(7):809-817.
[4] ELKIN M, ARIEL I, MIAO HQ, et al.Inhibition of bladder carcinoma angiogenesis, stromal support, and tumor growth by halofuginone. Cancer Res.1999;59(16): 4111-4118.
[5] YEE KO, CONNOLLY CM, PINES M, et al,Halofuginone inhibitstumor growth in the polyoma middle T antigen mouse via athrombospondin-1 independent mechanism.Cancer Biol Ther.2006;5(2):218-224.
[6] GNAINSKY Y, KUSHNIRSKY Z, BILU G, et al. Gene expression during chemically induced liver fibrosis: effect of halofuginone on TGF-βsignaling.Cell Tissue Res.2007;328(1):153-166.
[7] TURGEMAN T, HAGAI Y, HUEBNER K, et al.Prevention of muscle fibrosis and improvement in muscle performance in the mdx mouse by halofuginone.Neuromuscul Disord.2008;18(11): 857-868.
[8] JI B, ZHANG Z, GUO W, et al. Isoliquiritigenin blunts osteoarthritis by inhibition of bone resorption and angiogenesis in subchondral bone. Scientific Reports.2018;8(1):1721.
[9] CUI Z, CRANE J, XIE H, et al. Halofuginone attenuates osteoarthritis by inhibition of TGF- activity and H-type vessel formation in subchondral bone. Ann Rheum Dis. 2016;75(9):1714-1721.
[10] TANG Y, WU X, LEI W, et al. TGF-β1–induced migration of bone mesenchymal stem cells couples bone resorption with formation.Nat Med.2009;15(7):757-765.
[11] WENBO M, BOYONG X, HAIRONG M, et al.Halofuginone Attenuates Osteoarthritis by Rescuing Bone Remodeling in Subchondral Bone Through Oral Gavage.Front Pharmacol. 2018;9:269.
[12] LOESER RF, GOLDRING SR, SCANZELLO CR, et al.Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis Rheum.2012; 64:1697-1707.
[13] LOESER RF, COLLINS JA, DIEKMAN BO.Ageing and the pathogenesis of osteoarthritis.Nat Rev Rheumatol.2016;12(7):412-420.
[14] EDITH C, BISERKA R, DEROYER CÉLINE, et al.Insights on Molecular Mechanisms of Chondrocytes Death in Osteoarthritis.Int J Mol Sci. 2016;17(12). pii: E2146.
[15] CHEN D, SHEN J, ZHAO W, et al. Osteoarthritis: toward a comprehensive understanding of pathological mechanism.Bone Res. 2017;5:16044.
[16] LOESER RF. Aging and osteoarthritis: the role of chondrocyte senescence and aging changes in the cartilage matrix.Osteoarthritis Cartilage. 2009;17(8):971-979.
[17] FANG J, XU L, LI Y, et al. Roles of TGF-beta 1 signaling in the development of osteoarthritis.Histol Histopathol. 2016;31(11): 1161-1167.
[18] ZHU M, TANG D, WU Q, et al.Activation of β-catenin signaling in articular chondrocytes leads to osteoarthritis-like phenotype in adult β-catenin conditional activation mice. Bone Miner Res.2009; 24(1): 12-21.
[19] LIN AC, SEETO BL, BARTOSZKO JM, et al.Modulating hedgehog signaling can attenuate the severity of osteoarthritis.Nat Med. 2009; 15:1421-1425.
[20] SAITO T, FUKAI A, MABUCHI A, et al.Transcriptional regulation of endochondral ossification by HIF-2α during skeletal growth and osteoarthritis development.Nat Med.2010;16(6):678-686.
[21] YANG S, KIM J, RYU JH, et al.Hypoxia-inducible factor-2alpha is a catabolic regulator of osteoarthritic cartilage destruction.Nat Med. 2011;16(6):687.
[22] GOLDRING SR, GOLDRING MB.Changes in the osteochondral unit during osteoarthritis: structure, function and cartilage-bone crosstalk. Nat Rev Rheumatol. 2016;12(11):632-644.
[23] ROBINSON WH, LEPUS CM, WANG Q, et al. Low-grade inflammation as a key mediator of the pathogenesis of osteoarthritis.Nat Rev Rheumatol. 2016;12(10):580-592.
[24] BURR DB, GALLANT MA. Bone remodelling in osteoarthritis.Nat Rev Rheumatol. 2012;8(11):665-673.
[25] Cao X.Targeting osteoclast-osteoblast communication.Nat Med.2011; 17(11):1344-1346.
[26] BURR DB, RADIN EL.Microfractures and microcracks in subchondral bone: are they relevant to osteoarthrosis?.Rheum Dis Clin North Am . 2003;29(4):675-685.
[27] SNIEKERS YH, INTEMA F, LAFEBER FP, et al. A role for subchondral bone changes in the process of osteoarthritis; a micro-CT study of two canine models.BMC Musculoskelet Disord. 2008;9:20.
[28] XIE L, TINTANI F, WANG X, et al. Systemic neutralization of TGF-β attenuates osteoarthritis. Ann N Y Acad Sci. 2016;1376(1):53-64.
[29] CASTAÑEDA S, ROMAN-BLAS JA, LARGO R,et al. Subchondral bone as a key target for osteoarthritis treatment.Biochem Pharmacol. 2012;83(3):315-323.
[30] SURI S, DAVID A. Walsh. Osteochondral alterations in osteoarthritis. Bone.2012;51(2):204-211.
[31] CHRISTGAU S, GARNERO P, FLEDELIUS C, et al. Collagen type IIC-telopeptide fragments as an index of cartilage degradation. Bone. 2001;29(3):209-215.
[32] LUYTEN FP, LORIES RJU, VERSCHUEREN P, et al. Contemporary concepts of inflammation, damage and repair in rheumatic diseases.Best Pract Res Clin Rheumatol. 2006;20(5):829-848.
[33] GOLDRING MB, GOLDRING SR.Articular cartilage and subchondral bone in the pathogenesis of osteoarthritis.Ann N Y Acad Sci. 2010; 1192:230-237.
[34] VON D MK, KIRSCH T, NERLICH A, et al.Type X collagen synthesis in human osteoarthritic cartilage. Indication of chondrocyte hypertrophy. Arthritis Rheum.2010;35(7):806-811.

引言

骨性关节炎是各种原因引起的关节软骨的无菌性、慢性、进行性病变，是负重关节最常见的退行性病症，其特征为疼痛和功能丧失，据估算在中国和韩国分别有5.7%和4.4%的男性及10.3%和19.2%的女性受膝关节骨关节炎影响^[1-3]。目前，仍然缺乏有效的骨关节炎改善疗法，而对终末期骨关节炎而言疼痛管理和关节置换作为最后选择。虽然骨关节炎的治疗选择日益增多，但缓解疼痛等对症治疗不能延缓或抑制骨关节炎的进展。手术治疗可以在很大程度上缓解症状并改善关节的活动度，但本身是一种创伤性治疗，且有出现术后感染、深静脉血栓形成、假体松动等并发症可能。在没有治愈性非手术疗法的情况下，目前基础研究方向主要关注骨关节炎关节退化过程早期的干预措施。

常山酮，也称为卤夫酮，是一种生物碱，在很长一段时间作为一种广谱抗球虫药被广泛使用，在中国从古至今被用来治疗疟疾。据报道，常山酮通过抑制转化生长因子β信号通路下游的SMAD 2/3磷酸化，在抑制纤维化和成纤维细胞向肌成纤维细胞的转变中发挥重要作用^[4-7]。已有几项动物研究证实，在骨关节炎的早期阶段发生异常骨重塑，可能引发骨关节炎的发病^[8-9]。此外，也有研究表明，随着破骨细胞骨吸收的增加，过度激活了的转化生长因子β1使得骨吸收和骨形成解偶联，最终导致骨关节炎动物模型中软骨下骨的硬化表型^[10]，且可通过抑制转化生长因子β1信号传导减弱骨关节炎的进展^[11]。此次研究在大动物骨关节炎模型中，通过软骨下骨局部注射常山酮的方式初步探究能否通过影响关节软骨下骨中转化生长因子β1的表达及软骨下骨微结构，从而保护关节软骨并延缓关节炎的进展。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计动物分组观察。

1.2 时间及地点实验于2017年03月至2019年05月在新疆医科大学附属第一医院科技楼完成。

1.3 材料选择健康比格犬18只，成年6-8岁，雄性，体质量10-15 kg、平均12.5 kg，购自扬州四万实验动物技术有限公司[江苏省动物实验供应基地许可证：SCIK(苏) 2006-0006]。

micro-CT(美国Brooker公司)，石蜡包埋机(德国LEICA公司)，基质金属蛋白酶13一抗(美国Abcam 贸易有限公司)，转化生长因子β1一抗(美国Abcam贸易有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 分组及骨关节炎模型的建立根据体质量及年龄将18只比格犬分至3组，每组6只，分别为假手术对照组(对照组)、骨关节炎模型组(骨关节炎组)及常山酮治疗骨关节炎模型组(治疗组，即予局部软骨下骨注射常山酮的治疗)，分组前拍X射线片确认比格犬骨骺已闭合，达到成年比格犬的要求。骨关节炎组与治疗组共12只比格犬在麻醉后，右膝经髌骨内侧皮肤切口，充分暴露关节囊和脂肪垫以切断前十字韧带。切断前十字韧带时注意不损伤周围组织，并通过侧方应力试验和抽屉测试阳性结果证实前十字韧带横切成功。治疗组造模成功后还接受局部软骨下骨注射常山酮37.8 ng(图1)。均予关节囊，皮下组织和皮肤逐层缝合。对照组6只比格犬右膝接受假手术，即操作包括：打开膝关节囊，完全暴露前十字韧带而不加任何额外操作，随即逐层缝合。

术后各组比格犬均每日行2次强迫步行(每次1 h)，时长为16周。

1.4.2 血清Ⅱ型胶原C端肽(type II collagen C-terminal peptide，CTX-II)和X型胶原蛋白α1链(type X collagen α1 chain，COL10A1)标志物检测分别在术后4，8，12，16周，从所有比格犬的颈部采集静脉血样5 mL。使用高速离心机，转速为10 000 r/min，将血清标本离心时间掌握在30 s。用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清CTX-II和COL10A1水平。使用ELISA试剂盒标准化操作分别测定样本中的比格犬血清CTX-II和COL10A1水平。

1.4.3 番红固绿染色、OARSI-Modified Manking评分及免疫组织化学观察术后16周3组比格犬在安乐死之后，收集经手术操作的膝关节标本，将标本固定后依次进行脱钙、包埋、切片。切片用于番红固绿染色及OARSI-Modified Manking Score评价软骨受损程度；用于免疫组织化学法观察关节软骨中的基质金属蛋白酶13及软骨下骨中转化生长因子β1的表达。

组织切片烤片后进行脱蜡、梯度乙醇处理。按相应流程进行番红固绿染色及免疫组织化学操作，最后进行封固。在光学显微镜下观察，采集图像。

1.4.4 Micro-CT扫描分析胫骨平台软骨下骨的分析包括：骨体积分数、骨小梁模式因子、骨小梁分离度。

1.5 主要观察指标 ①血清生化标志物变化；②胫骨平台大体形态观察；③番红固绿染色及OARSI-Modified Manking评分；④关节软骨与软骨下骨中分子生物学指标分析；⑤Micro-CT软骨下骨微观结构分析。

1.6 统计学分析应用SPSS 22.0统计软件分析，计量资料用x(_)±s的形式表示。单因素方差分析用于多组间均数比较，采用Levene’s检验方差齐性，以0.05作为检验水准，方差齐时，用最小显著差异法(LSD法)进行两两组间均数比较，方差不齐时，用Dunnet’s T3法进行两两组间均数比较，设P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

骨关节炎的病因是多因素的，包括关节损伤、炎症、肥胖、衰老和遗传等^[12-16]。由于对骨关节炎起始和进展中涉及的分子机制仍然知之甚少，目前尚无干预措施能减缓疾病进展。使用小鼠遗传模型的研究表明，生长因子(包括转化生长因子β)、Wnt3a和Indian hedgehog和信号分子如：Smad2/3，β-catenin和HIF-2α参与骨关节炎发展^[17-21]。

骨关节炎的特征性病变包括关节软骨退变、软骨下骨硬化、炎症和骨赘形成^[22-23]。软骨和软骨下骨在关节中是一个功能单元，关节软骨的稳态依赖于与软骨下骨的相互作用^[24]。受时间和空间调节的破骨细胞和成骨细胞活性保证了软骨下骨的完整性^[25]，软骨下骨骨小梁具有吸收震荡和支撑功能，还影响关节软骨的营养供应和新陈代谢。在某些特殊情况下，如韧带损伤、超重个体、年龄相关的肌力减弱，会发生潜在的软骨下骨的改变，而且最终会影响上覆关节软骨^[26]。先前已有基于前十字韧带横切(ACLT)诱导的骨关节炎小鼠模型的研究提示软骨下骨的微体系结构随骨关节炎的发生而改变，这可能先于关节软骨退变^[9^，^11]。在基于犬膝关节模型的研究中，通过Micro-CT检测了软骨下骨的微观变化，并发现与对照组相比，骨关节炎组中骨体积分数升高，骨小梁分离度、骨小梁模式因子下降，这虽然与先前一些研究结果不完全一致^[27-28]，但对照组和常山酮治疗组的骨体积分数、骨小梁分离度、骨小梁模式因子等参数值之间无显著差异，这点证明了常山酮维持了软骨下骨的微观结构。软骨下骨的正常骨重建在适应机械应力变化中起关键作用，重塑涉及骨基质降解、由破骨细胞和成骨细胞调节的再生^[29]。

在正常的生理性骨重建过程中，破骨细胞的骨吸收是在骨表面，成骨细胞及其祖细胞主要位于骨表面的骨吸收部位，随后的成骨也在此区域，即骨吸收和骨形成发生在级联事件之后的特定区域。据报道转化生长因子β1是骨吸收和形成的重要偶联因子，其被埋在骨矿物质基质中，在破骨细胞骨吸收之后，转化生长因子β1从骨矿物质基质释放和活化，活性转化生长因子β1将诱导间充质干细胞准确地在骨再吸收部位形成新骨。然而，在存在异常的机械负荷导致的骨吸收增加时，软骨下骨中骨基质中转化生长因子β1被过度释放和活化^[11^，^17]。转化生长因子β1的失调导致骨重建失偶联，转化生长因子β诱导骨髓腔中间充质干细胞分化为osterix⁺骨祖细胞，最终这些成簇的成骨细胞前体在软骨下骨髓中形成类骨岛，在磁共振成像中可视化为骨髓病变，并被视为骨关节炎的预后因素^[30]。

在此次研究中，发现局部注射常山酮可防止异常骨吸收和异常骨形成，同时还发现与骨关节炎模型组相比，常山酮治疗减少了血清中CTX-Ⅱ、COL10A1水平及软骨中基质金属蛋白酶13阳性细胞的数量，并且降低了软骨损伤的严重程度组织学评分。软骨由特殊的软骨细胞组成，其产生大量胶原细胞外基质蛋白质，包括蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白，维持关节软骨的稳态，从而保持完整。CTX-Ⅱ为软骨降解后Ⅱ型胶原蛋白片段^[31]，COL10A1为X型胶原蛋白的特异性裂解片段，X型胶原蛋白是软骨细胞肥大分化的典型标志，在骨关节炎进展过程中，软骨细胞肥大及其合成的促炎细胞因子助软骨破坏^[32-33]。基质金属蛋白酶13是由软骨细胞合成的主要胶原酶，在骨关节炎期间破坏聚集蛋白聚糖和Ⅱ型胶原蛋白^[34]。综合上述可推测干预后软骨下骨骨重建的趋于正常化使得上覆关节软骨得以保留其完整性，表明常山酮在维持关节软骨的稳态和完整性中起到了有利作用。在此次研究中，首次证实犬模型中局部软骨下骨注射常山酮能够保持骨重建的偶联进行，更重要的防止了关节软骨丢失，这是骨关节炎治疗的主要关注点。总之，这些结果表明局部注射常山酮是预防骨关节炎进展的有效策略，因给药方式直指软骨下骨，这项研究的结果可能有助于扩大其临床应用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

软骨下骨局部注射常山酮抑制转化生长因子β1信号通路缓解犬骨关节炎

Local injection of halofuginone into the subchondral bone relieves canine osteoarthritis by inhibiting transforming growth factor beta 1 signaling pathway

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 10

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	聂慧娟, 黄织春. 转化生长因子β1诱导心肌成纤维细胞转分化过程中Hedgehog信号通路的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 754-760.
[2]	郝晓娜, 张英杰, 李玉云, 许涛. 过表达脯氨酰寡肽酶的骨髓间充质干细胞修复肝纤维化模型大鼠[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3988-3993.
[3]	周武, 王彬娉, 王雅雯, 程亚楠, 黄谢山. 转化生长因子β和骨形成蛋白2联合诱导小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞的增殖与分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3630-3635.
[4]	杨莉, 李雪莉, 宋静卉, 禹卉千, 王伟霞. 隐丹参酮抑制模型兔耳增生性瘢痕的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3150-3155.
[5]	刘金磊, 殷力, 张翼, 王海涛, 李庄严, 夏培格, 乔仁秋. 全膝关节置换装假体前氨甲环酸静滴联合局部鸡尾酒复合氨甲环酸多点注射对失血与疼痛的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(18): 2833-2839.
[6]	朱仕强, 许建峰, 黑晓燕, 陈耘东, 田心保, 张金晨, 林瑞珠. 内热针干预膝骨性关节炎兔软骨下骨Ⅰ型胶原、基质金属蛋白酶3和骨桥蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2636-2642.
[7]	刘治军, 刘少津, 魏合伟, 万雷, 黄宏兴, 乔荣勤. 补肾健脾活血方干预去势大鼠肌肉骨骼转化生长因子β/骨形态发生蛋白2信号通路的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(14): 2219-2223.
[8]	涂鹏程, 郭杨, 马勇, 潘娅岚, 郑苏阳, 王礼宁, 吴承杰, 过俊杰. 威灵仙提取物可促进体外牵张应力环境下软骨细胞表型的维持[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(8): 1182-1187.
[9]	李树源, 周琦石, 李悦, 周宏亮, 杨佳宝, 胡柽. 不同组织部位诱导膜血管化及成骨因子表达的比较[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(5): 667-672.
[10]	伍琦, 廖瑛, 孙光华, 周桂娟, 廖源, 刘静, 钟培瑞, 成果, 邓程远, 王甜甜. 依降钙素干预膝骨关节炎模型大鼠软骨下骨的变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(5): 709-715.
[11]	黎琴文, 梁杰, 王冬梅, 尚峥辉. 坐骨神经慢性卡压损伤模型大鼠背根神经节纤维化改变[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(29): 4686-4691.
[12]	杨振, 李浩, 高仓健, 付力伟, 田广招, 查康康, 孙志强, 李旭, 郭维民, 眭翔, 黄靖香, 刘舒云, 卢世璧, 郭全义. 转化生长因子β3/聚乳酸-羟基乙酸微球对干细胞的调控[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(28): 4540-4546.
[13]	吴朕, 马微, 臧成昊, 刘矿嫔, 刘伟, 刘洁, 梁宇, 李春艳, 陈志明, 茹金, 樊楚明, 杨金伟, 郭建辉, 李力燕. 三七皂苷R1保护四氯化碳诱导肝纤维化模型大鼠的作用[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(26): 4213-4217.
[14]	刘静, 孙智路, 周君, 廖源, 孙光华, 伍琦, 周桂娟, 钟培瑞, 成果, 肖豪, 李兰, 廖瑛. 伊班膦酸钠干预骨关节炎模型大鼠丝裂原活化蛋白激酶信号通路的变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(2): 181-186.
[15]	刘玥彤, 王琴, 杨烨, 朱筠, 阿布力克木•吐尔地. 1,25(OH)₂D3干预糖尿病肾病模型大鼠肾脏组织MicroRNA-130b及转化生长因子β1的变化 [J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(2): 248-253.