人骨骼肌源性血管内皮细胞对造血干/祖细胞的体外支持

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2145

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (1): 50-55.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2145

• 造血干细胞 hematopoietic stem cells • 上一篇下一篇

人骨骼肌源性血管内皮细胞对造血干/祖细胞的体外支持

古晶晶1，2，周芮1，杨婷婷3，杨小萍1，许飞4，郑波4

1宁夏医科大学，宁夏回族自治区银川市 750004；2焦作市人民医院，河南省焦作市 454000；宁夏医科大学总医院，3人类干细胞研究所，4血液科，宁夏回族自治区银川市 750004

收稿日期:2019-12-02 修回日期:2019-12-06 接受日期:2020-02-12 出版日期:2021-01-08 发布日期:2020-10-29
通讯作者: 郑波，主任医师，教授，硕士生导师，宁夏医科大学总医院血液科，宁夏回族自治区银川市 750004
作者简介:古晶晶，女，1992 年生，河南省焦作市人，汉族，2019年宁夏医科大学毕业，硕士，医师，主要从事造血干细胞与造血微环境方面的研究。周芮，女，1995 年生，宁夏回族自治区石嘴山市人，汉族，宁夏医科大学在读硕士，主要从事造血干细胞与造血微环境方面的研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81560023)；2015年度宁夏留学人员科技活动项目

Supporting effect of human skeletal muscle-derived myoendothelial cells on hematopoietic stem/progenitor cells in vitro

Gu Jingjing1, 2, Zhou Rui1, Yang Tingting3, Yang Xiaoping1, Xu Fei4, Zheng Bo4

1Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China; 2the People’s Hospital of Jiaozuo City, Jiaozuo 454000, Henan Province, China; 3Human Stem Cell Institute, 4Department of Hematology, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China

Received:2019-12-02 Revised:2019-12-06 Accepted:2020-02-12 Online:2021-01-08 Published:2020-10-29
Contact: Zheng Bo, Chief physician, Professor, Master’s supervisor, Department of Hematology, General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China
About author:Zhou Rui, Master candidate, Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia Hui Autonomous Region, China Gu Jingjing and Zhou Rui contributed equally to this work.
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81560023; the 2015 Overseas Students Science and Technology Project in Ningxia Hui Autonomous Region

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
造血干/祖细胞：造血干细胞是具有自我更新、复制和多向分化潜能的原始细胞，是所有造血细胞和免疫细胞的起源细胞。造血干细胞在特定微环境和某些因素的调节下，可增殖分化为各类血细胞的祖细胞，称为造血祖细胞。造血祖细胞也是一种原始的具有增殖能力的细胞，但失去多向分化能力，只能向一个或几个血细胞系定向增殖分化。
人骨骼肌源性血管内皮细胞：简称肌血管内皮细胞，是一种骨骼肌干细胞，其位于骨骼肌微血管内膜，共表达肌肉干细胞表面标记CD56，以及血管内皮细胞标记CD34、CD144，而不表达血细胞表面标记CD45 (CD56+CD34+CD144+CD45-)。肌血管内皮细胞与间充质干细胞具有相似性，表达间充质干细胞表面标记物，具有多向分化潜能。

摘要
背景：人骨骼肌源性血管内皮细胞位于血管壁，共表达肌肉干细胞和血管内皮细胞的标记(CD56+CD34+CD144+CD45-)。研究显示，人肌血管内皮细胞与间充质干细胞存在相似性，表达间充质干细胞表面标记物，具有多向分化潜能。
目的：建立人肌血管内皮细胞作为滋养层与人脐血CD34+细胞体外培养体系，以培养前后CD34+细胞数量变化、免疫表型及集落形成能力为指标，评估人肌血管内皮细胞对造血干/祖细胞的体外支持效力。
方法：实验分3组：①实验组：以人肌血管内皮细胞为滋养层与人脐血CD34+细胞体外共培养；②对照组：以人骨髓间充质干细胞为滋养层与人脐血CD34+细胞体外共培养；③空白对照组：人脐血CD34+细胞单独培养。共培养第1，2，4周分析人脐血CD34+细胞数量、血细胞免疫表型和造血干/祖细胞集落形成能力等指标，第5周时因无细胞存活故不进行检测。
结果与结论：①人脐血CD34+细胞数量变化：在1，2，4周时实验组比对照组有所增加，但二者差异均无显著性意义(P > 0.05)；②流式细胞术分析血细胞免疫表型：只有在第2周时对照组人脐血CD34+细胞CD34+CD33-表达率略高于实验组，差异有显著性意义(P < 0.05)，其他亚型免疫表型CD45+、CD14+、CD10+/CD19+表达两组之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)；③造血干/祖细胞集落形成能力：在1，2，4周时实验组与对照组造血干/祖细胞集落数量差异无显著性意义(P > 0.05)；④由于空白对照组无滋养层，人脐血CD34+细胞数量在1周时明显下降，第2周计数无存活，因此未进行血细胞免疫表型及集落分析；⑤结果表明，人肌血管内皮细胞作为滋养层细胞具有与人骨髓间充质干细胞相似的体外造血支持作用。

ORCID:0000-0002-6768-5273(郑波)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 人骨骼肌源性血管内皮细胞, 脐血CD34+细胞">, , 体外支持">, , 共培养">, , 滋养层

Abstract: Abstract
BACKGROUND: Human skeletal muscle derived myoendothelial cells (MECs) are located in the vascular wall and co-express the markers of muscle stem cells and vascular endothelial cells (CD56+CD34+CD144+CD45-). Studies have shown that MECs are similar to mesenchymal stem cells, express the surface markers of mesenchymal stem cells and have the potential of multidirectional differentiation.
OBJECTIVE: To establish an in vitro culture system for human umbilical cord blood CD34+ cells with MECs as trophoblastic layer, and to evaluate the in vitro supporting effect of human skeletal muscle MECs on hematopoietic stem/progenitor cells by measuring the changes in the number, immunophenotype and colony forming ability of CD34+ cells before and after culture.
METHODS: There were three groups in the experiment. In experimental group, human umbilical cord blood CD34+ cells were co-cultured with MECs as the nourishing layer; in control group, human umbilical cord blood CD34+ cells were co-cultured with bone marrow mesenchymal stem cells as the nourishing layer; and in blank control group, human umbilical cord blood CD34+ cells were cultured alone without the nourishing layer. The main outcome measures, including the number of human umbilical cord blood CD34+ cells, immunophenotype of blood cells and colony formation ability of hematopoietic stem/progenitor cells were analyzed and compared at 1, 2, and 4 weeks after co-culture. No detection was conducted at 5 weeks due to the lack of survived cells.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The number of human umbilical cord blood CD34+ cells increased by MECs as the nourishing layer compared with bone marrow mesenchymal stem cells as the nourishing layer at 1, 2, and 4 weeks; however, there was no significant difference between the two groups (P > 0.05). (2) The cell immunophenotype by flow cytometry analysis indicated that only in the 2nd week, the expression of CD34+CD33- in human umbilical cord blood CD34+ cells in the control group was significantly higher in the experimental group (P < 0.05). Other subtypes of immunophenotypes CD45+, CD14+, CD10+/CD19+ showed no significant difference between the two groups (P > 0.05). (3) The colony formation capacity of hematopoietic stem/progenitor cells showed no significant difference between the experimental and control groups at 1, 2, and 4 weeks (P > 0.05). (4) Due to the non-nourishing layer culture system, the number of human umbilical cord blood CD34+ cells decreased significantly in the 1st week, and no cells survived in the 2nd week. Therefore, blood cell immunophenotype and colony analysis could not be performed. (5) To conclude, human skeletal muscle MECs as trophoblasts are the same as human bone marrow mesenchymal stem cells, which have a hematopoietic support in vitro.

Key words: human skeletal muscle derived myoendothelial cells">, , umbilical cord blood CD34+ stem cells">, , supporting in vitro">, , co-culture">, , nourishing layer

中图分类号:

古晶晶, 周芮, 杨婷婷, 杨小萍, 许飞, 郑波. 人骨骼肌源性血管内皮细胞对造血干/祖细胞的体外支持[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(1): 50-55.

Gu Jingjing, Zhou Rui, Yang Tingting, Yang Xiaoping, Xu Fei, Zheng Bo. Supporting effect of human skeletal muscle-derived myoendothelial cells on hematopoietic stem/progenitor cells in vitro[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(1): 50-55.

图/表（结果） 7

2.1 镜下观察以人肌血管内皮细胞为滋养层共培养的人脐血CD34+细胞见图1。在倒置显微镜下观察，共培养1周后有滋养层组(实验组及对照组)人脐血CD34+细胞相对于无滋养层空白对照组人脐血CD34+细胞有明显扩增，无滋养层空白对照组人脐血CD34+细胞无明显扩增，且状态不佳，细胞皱缩。与对照组比较，以人肌血管内皮细胞为滋养层共培养的人脐血CD34+细胞轮廓更为清晰，胞质饱满透亮；共培养2周后，有滋养层组人脐血CD34+细胞密度相对于1周有所增加，且细胞生长良好，其中以人肌血管内皮细胞为滋养层共培养的人脐血CD34+细胞透亮清晰，显示出较好的活性，无滋养层空白对照组人脐血CD34+细胞锥虫蓝染色未见活细胞。共培养4周后，人脐血CD34+细胞密度相对于2周未见明显变化，但细胞轮廓不清晰。
2.2 共培养扩增过程中人脐血CD34+细胞数量分析共培养0 d时3种共培养体系人脐血CD34+细胞数量相同，均为5×104。共培养1周，实验组、对照组人脐血CD34+细胞数量略有增加，分别为(5.57±1.12)×104，(5.09±0.81)×104；共培养2周，实验组、对照组人脐血CD34+细胞数达到高峰，分别为(6.93±1.97)×104，(5.50±0.71)×104；共培养至4周，实验组、对照组人脐血CD34+细胞数逐渐减少，分别为(3.69±1.06)×104，(2.48±0.76)×104，实验组细胞存活数略高于对照组；随着共培养时间延长，人脐血CD34+细胞数量逐渐减少，于第5周时无细胞存活；空白对照组人脐血CD34+细胞数量迅速下降，于第2周全部死亡，见图2。经统计分析，实验组、对照组人脐血CD34+细胞数量在1，2，4周差异均无显著性意义(P > 0.05，n=5)，见表1。

2.3 流式细胞术分析共培养过程中人脐血CD34+细胞的免疫表型共培养1，2，4周使用流式细胞仪检测造血细胞标记物。CD45+为全血细胞标记，CD34+CD33-为造血祖细胞标记，CD10+/CD19+为淋巴细胞标记，CD14+为单核细胞标记，通过检测这些标记物表达量比较促造血能力异同，见图3。收集共培养1，2，4周时人脐血CD34+细胞进行计数，用流式细胞术检测人脐血CD34+细胞中CD45+、CD14+、CD10+/CD19+和CD34+CD33-的表达。在共培养第2周时，对照组人脐血CD34+细胞的CD34+CD33-表达率略高于实验组，差异有显著性意义(P < 0.05，n=5)，其他的亚型免疫表型CD45+、CD14+、CD10+/CD19+表达在1，2，4周差异均无显著性意义
(P > 0.05，n=5)，见图4。由于空白对照组人脐血CD34+细胞第1周计数少，于第2周全部死亡，细胞数未能做流式分析要求，因此无法检测人脐血CD34+细胞免疫表型。

2.4 造血干/祖细胞集落形成分析共培养1，2，4周将共培养的人脐血CD34+细胞分别接种于甲基纤维素半固体培养基中培养14 d，均可见粒-巨噬系集落形成，大于50个细胞的细胞团被计为1个集落，并对所形成的集落进行镜下计数，取平均值。吸取粒-巨噬系集落，进行甩片、瑞士-吉姆萨染色，在倒置显微镜下用油镜观察细胞形态，可观察到粒细胞、单核细胞等血细胞，且细胞轮廓清楚，核着色深，核质界限清楚，见图5。共培养第1周时集落数均为最多，随共培养时间延长，集落数量逐渐减少。共培养第1，2，4周时实验组集落数分别为121.25±13.90，36.13± 13.86，3.88±3.39，对照组集落数分别为129.38±16.80，51.63±13.50，18.63±10.68。虽然对照组高于实验组，但差异无显著性意义(P > 0.05，n=5)，见图6。空白对照组1周时收集人脐血CD34+细胞数量少，无法行集落培养实验。

参考文献

[1] ASADA N, KUNISAKI Y, PIERCE H, et al. Differential cytokine contributions of perivascular haematopoietic stem cell niches. Nat Cell Biol. 2017;19(3):214-223.
[2] 汪姝玥,林凡莉,钱怡,等.不同共培养模式下间充质干细胞对造血干细胞增殖的作用[J].中国组织工程研究, 2018,22(13): 2068-2074.
[3] LUCAS D. The Bone Marrow Microenvironment for Hematopoietic Stem Cells. Adv Exp Med Biol. 2017;1041:5-18.
[4] TIMARI H, SHAMSASENJAN K, MOVASSAGHPOUR A, et al. The Effect of Mesenchymal Stem Cell-Derived Extracellular Vesicles on Hematopoietic Stem Cells Fate. Adv Pharm Bull. 2017;7(4):531-546.
[5] MURRAY IR, BAILY JE, CHEN WCW, et al. Skeletal and cardiac muscle pericytes: Functions and therapeutic potential. Pharmacol Ther. 2017; 171:65-74.
[6] SCHMIDT M, SCHÜLER SC, HÜTTNER SS, et al. Adult stem cells at work: regenerating skeletal muscle. Cell Mol Life Sci. 2019;76(13): 2559-2570.
[7] TEY SR, ROBERTSON S, LYNCH E, et al. Coding Cell Identity of Human Skeletal Muscle Progenitor Cells Using Cell Surface Markers: Current Status and Remaining Challenges for Characterization and Isolation. Front Cell Dev Biol. 2019;7:284.
[8] 陈玉芳,王媛媛,王娟娟,等.具有造血能力的肌源性干细胞的研究进展[J].中国实验血液学杂志, 2015,23(5):1523-1526.
[9] ZHENG B, CAO B, CRISAN M, et al. Prospective identification of myogenic endothelial cells in human skeletal muscle. Nat Biotechnol. 2007;25(9):1025-1034.
[10] 古晶晶,杨继辉,杨婷婷,等.多参数流式细胞术分选人骨骼肌源性血管内皮细胞和血管外膜细胞的方法[J].中国组织工程研究, 2018,22(21): 3357-3364.
[11] BAI H, GAO Y, HOYLE DL, et al. Suppression of Transforming Growth Factor-β Signaling Delays Cellular Senescence and Preserves the Function of Endothelial Cells Derived from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. 2017;6(2):589-600.
[12] WILSON C, LEE MD, MCCARRON JG. Acetylcholine released by endothelial cells facilitates flow-mediated dilatation. J Physiol. 2016; 594(24):7267-7307.
[13] GUREL PEKOZER G, TORUN KOSE G, HASIRCI V. Influence of co-culture on osteogenesis and angiogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells and aortic endothelial cells. Microvasc Res. 2016;108:1-9.
[14] SLUKVIN II. Generating human hematopoietic stem cells in vitro -exploring endothelial to hematopoietic transition as a portal for stemness acquisition. FEBS Lett. 2016;590(22):4126-4143.
[15] GARCIA-ALEGRIA E, MENEGATTI S, FADLULLAH MZH, et al. Early Human Hemogenic Endothelium Generates Primitive and Definitive Hematopoiesis In Vitro. Stem Cell Reports. 2018;11(5):1061-1074.
[16] GRITZ E, HIRSCHI KK. Specification and function of hemogenic endothelium during embryogenesis. Cell Mol Life Sci. 2016;73(8): 1547-1567.
[17] PERUCCA S, DI PALMA A, PICCALUGA PP, et al. Mesenchymal stromal cells (MSCs) induce ex vivo proliferation and erythroid commitment of cord blood haematopoietic stem cells (CB-CD34+ cells). PLoS One. 2017;12(2):e0172430.
[18] XU L, CHEN H, CHEN J, et al. The consensus on indications, conditioning regimen, and donor selection of allogeneic hematopoietic cell transplantation for hematological diseases in China-recommendations from the Chinese Society of Hematology. J Hematol Oncol. 2018;11(1): 33.
[19] DE WITTE T, BOWEN D, ROBIN M, et al. Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation for MDS and CMML: recommendations from an international expert panel. Blood. 2017;129(13):1753-1762.
[20] GOLAY H, JURKOVIC MLAKAR S, MLAKAR V, et al. The Biological and Clinical Relevance of G Protein-Coupled Receptors to the Outcomes of Hematopoietic Stem Cell Transplantation: A Systematized Review. Int J Mol Sci. 2019;20(16). pii: E3889.
[21] QIN M, GUAN X, WANG H, et al. An effective ex-vivo approach for inducing endothelial progenitor cells from umbilical cord blood CD34+ cells. Stem Cell Res Ther. 2017;8(1):25.
[22] NISHIKAWA E, MATSUMOTO T, ISIGE M, et al. Comparison of capacities to maintain hematopoietic stem cells among different types of stem cells derived from the placenta and umbilical cord. Regen Ther. 2016;4: 48-61.
[23] KADEKAR D, KALE V, LIMAYE L. Differential ability of MSCs isolated from placenta and cord as feeders for supporting ex vivo expansion of umbilical cord blood derived CD34(+) cells. Stem Cell Res Ther. 2015; 6:201.
[24] 付亚茹,孙阳阳,王洪星,等.冻存脐带血中内皮祖细胞的分离培养及生物学特性鉴定[J].中国实验血液学杂志, 2019,27(1):215-220.
[25] ZHANG Y, WANG C, WANG L, et al. Large-Scale Ex Vivo Generation of Human Red Blood Cells from Cord Blood CD34+ Cells. Stem Cells Transl Med. 2017;6(8):1698-1709.
[26] 王鸣. 骨髓微环境中内皮细胞对造血干细胞扩增的调控研究[D].上海:上海师范大学, 2019.
[27] 董忱,赵龙,张斌,等.人脐带血来源造血干细胞体外扩增的研究进展[J].中华细胞与干细胞杂志(电子版), 2019,9(1):44-49.
[28] GARBA A, ACAR DD, ROUKAERTS IDM, et al. Long-term culture and differentiation of porcine red bone marrow hematopoietic cells co-cultured with immortalized mesenchymal cells. Vet Immunol Immunopathol. 2017;191:44-50.
[29] LABARGE MA, BLAU HM. Biological progression from adult bone marrow to mononucleate muscle stem cell to multinucleate muscle fiber in response to injury. Cell. 2002;111(4):589-601.
[30] CAMARGO FD, GREEN R, CAPETANAKI Y, et al. Single hematopoietic stem cells generate skeletal muscle through myeloid intermediates. Nat Med. 2003;9(12):1520-1527.
[31] CAO B, ZHENG B, JANKOWSKI RJ, et al. Muscle stem cells differentiate into haematopoietic lineages but retain myogenic potential. Nat Cell Biol. 2003;5(7):640-646.

引言

骨髓中主要存在造血干/祖细胞和间充质干细胞两种干细胞类型。机体的正常造血依赖于造血干/祖细胞以及支持造血细胞生长发育的骨髓微环境即间充质干细胞的相互作用[1]。大量研究显示骨髓间充质干细胞对维持造血干/祖细胞正常造血功能至关重要[2-3]，间充质干细胞作为骨髓基质细胞的前体细胞，不仅参与构成骨髓造血微环境，还可表达多种造血相关因子[4]，在造血干/祖细胞增殖分化、成熟并最终进入血液循环过程中均发挥着重要作用。尽管许多学者进行骨髓间充质干细胞的培养扩增研究，但从骨髓获取间充质干细胞仍面临着取材危险性大、含量极其稀少以及缺乏特殊表面标记难以分离纯化等局限，远不能满足临床所需。因此，寻找骨髓来源以外的间充质干细胞是目前研究的热点。
除骨髓来源间充质干细胞外，肌肉组织作为人体最大的器官，占人体总质量的40%左右，取材相对简单安全。骨骼肌组织里储存有多种肌源性干/祖细胞(muscle-derived stem/progenitor cells，MDSPCs)[5]，包括多能成年祖细胞(multipotent
adult progenitor cells，MAPC)、肌血管内皮细胞(myoendothelial cells，MECs)、肌血管外膜细胞(perivascular stem cell，PSCs)和侧群细胞(side populations，SP)等[6]，各组细胞可依据不同的表面标记物结合流式细胞仪分选用于不同的用途[7]。研究表明肌肉组织来源的CD45+侧群细胞具有极强的造血分化能力，能向外周血的红系、粒系以及血小板分化[8]。ZHENG等[9]应用多参数流式细胞分选技术成功地在人体肌肉组织中发现并获取了一种位于血管壁的成人肌肉干细胞，这种细胞被命名为骨骼肌血管内皮细胞，共表达肌肉干细胞和血管内皮细胞的标记(CD56+CD34+CD144+)，培养后表达间充质干细胞的表面标志CD90、CD105、CD73、CD44，表现出向多谱系中胚层发育的潜能[10]。研究显示，内皮细胞能够促进血管生成[11-13]，人血源性内皮细胞及小鼠表达血管内皮细胞标记的肌源性干/祖细胞也被发现具有造血重建作用[8，14-16]，但成人肌肉来源肌血管内皮细胞无法向造血细胞分化。课题组前期进行的生物学鉴定验证人肌血管内皮细胞与间充质干细胞具有相似性[10]，然而人肌血管内皮细胞是否像骨髓间充质干细胞一样对造血干/祖细胞体外扩增具有支持作用需要进一步的研究。因此该实验的目的是研究人肌血管内皮细胞对造血干/祖细胞的体外扩增效力，首先将人肌血管内皮细胞作为滋养层与人脐血CD34+细胞直接接触共培养，并且与传统的人骨髓间充质干细胞为滋养层的共培养体系进行对
比[17]，探讨人肌血管内皮细胞对人脐血CD34+细胞体外支持能力、造血细胞表面抗原表达及集落形成能力的作用，为寻找骨髓基质以外来源对造血干/祖细胞具有扩增作用的基质细胞奠定基础。

材料方法

1.1 设计体外细胞学实验。
1.2 时间及地点实验于2017年3月至2019年1月在宁夏医科大学总医院人类干细胞研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 标本人骨骼肌肉标本来源于宁夏医科大学总医院创伤骨科手术中清除的肌肉组织(n=14)；脐血标本来源于宁夏医科大学总医院产科足月健康分娩的新生儿脐血(每份脐血约80 mL，n=15)。人肌血管内皮细胞利用多参数流式细胞术分选得到，并进行传代培养[10]。脐血CD34+细胞利用免疫磁珠法进行分选得到。实验方案均经宁夏医科大学总医院医学伦理委员会批准且捐献者及家属知情同意。
1.3.2 实验试剂和仪器成人骨髓间充质干细胞(Vyagen赛业生物公司)；丝裂霉素(Sigma公司)；MethoCult H4535 Enriched without EPO(Stemcell公司)；小鼠抗人CD45-APC-H7抗体、小鼠抗人CD34-APC标记、小鼠抗人CD33-FITC标记、小鼠抗人CD19-PE-Cy7标记、小鼠抗人CD10-PE标记、小鼠抗人CD14-Alexa 700标记、小鼠抗人APC-H7 IgG1抗体、小鼠抗人APC IgG1抗体、小鼠抗人PE IgG1抗体、小鼠抗人FITC IgG1抗体、小鼠抗人Alexa 700 Ig2a抗体、小鼠抗人PE-Cy7 Ig2b抗体、7-AADViaProbe、多参数流式细胞分选仪BD FACS Aria Ⅲ(BD公司)；胶原包被96孔培养板(Corning公司)；3 mL注射器、注射器针头、MethoCult H4535 Enriched without EPO(Stemcell公司)；瑞士-吉姆萨染料(珠海贝索生物公司)；40，70 μm细胞筛网(Falcon公司)；倒置荧光显微镜(OLYMPUS公司)；高糖型DMEM培养基、马血清(Gibco公司)；胎牛血清(Biological Industries公司)；青霉素/链霉素(Invitrogen公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 滋养层细胞与人脐血CD34+细胞直接接触培养实验分为3组：实验组(人肌血管内皮细胞为滋养层)、对照组(骨髓间充质干细胞为滋养层)、空白对照组(无滋养层)。人肌血管内皮细胞在含体积分数为10%胎牛血清、体积分数为10%马血清、0.5%鸡胚提取物、1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养，骨髓间充质干细胞在含体积分数为10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养。取第3-8代人肌血管内皮细胞及人骨髓间充质干细胞，以细胞密度1.5×104/孔分别种于胶原包被的96孔板中，各设置3孔，加入人肌血管内皮细胞和骨髓间充质干细胞培养基放置于体积分数为5%CO2、37 ℃饱和湿度培养箱中培养。待两种细胞培养24 h贴壁之后用4 mg/L丝裂霉素处理2 h，PBS洗3次，每次间隔5 min，24 h之后将人脐血CD34+细胞以5×104/孔分别接种于人肌血管内皮细胞、骨髓间充质干细胞滋养层上，共培养的培养基为含体积分数为5%胎牛血清、1%青霉素/链霉素的RPMI 1640培养基。无滋养层空白对照组单独接种人脐血CD34+细胞5×104/孔，设置3个孔，培养基同上。
1.4.2 扩增后人脐血CD34+细胞计数与流式细胞术检测造血细胞免疫表型细胞培养至1，2，4周时，每孔细胞加入100 µL Tryple进行消化，分别收集实验组、对照组、空白对照组的悬浮人脐血CD34+细胞，锥虫蓝染色法计数人脐血CD34+细胞数量。造血细胞免疫表型检测：将上述获得的人脐血CD34+细胞加入鼠血清封闭(鼠血清∶细胞悬液体积比为1∶20)，冰上孵育30 min；设置样本管：加入细胞浓度为1×108 L-1的单细胞悬液200 µL，将CD34-APC、CD45-APC-Cy7、CD33-FITC、CD19-PE-Cy7、CD10-PE、CD14-Alexa 700各1 µL加入样本管中，冰上孵育30 min；设置对照管：加入细胞浓度为1×107 L-1的细胞悬液100 µL，将APC-、APC-Cy7-、FITC-、PE-Cy7-、PE-和Alexa 700-结合的抗体各1 µL
加入同型对照管，冰上孵育30 min；上机前加入7-AAD ViaProbe(每106-107个细胞加20 µL)并在冰上孵育10 min，送至上机检测。
1.4.3 共培养后造血干/祖细胞集落培养、计数及血细胞形态学鉴定细胞培养至1，2，4周时，收集实验组、对照组、空白对照组的悬浮人脐血CD34+细胞，锥虫蓝染色法计数人脐血CD34+细胞数量，细胞培养至第5周时因细胞全部死亡故未行检测。将3×103人脐血CD34+细胞接种至3 mL甲基纤维素半固体培养基中充分混合，每35 mm×10 mm培养皿中加入约1.1 mL上述混合物，设置3皿，置于37 ℃、体积分数为5%CO2、饱和湿度的培养箱内培养10-14 d，在倒置显微镜下观察粒-巨噬系集落形成单位(colony-forming unit granulocyte-macrophages，CFU-GM)形态并计数集落数量。在倒置显微镜下，用100 µL移液枪吸取集落加入含有HBSS的EP管中，每个集落20-50 µL，反复吹打混匀，甩片、瑞士-吉姆萨染色，玻片风干后在倒置荧光显微镜下用油镜观察细胞形态。
1.5 主要观察指标对扩增后第1，2，4周人脐血CD34+细胞数量、造血细胞免疫表型和造血干/祖细胞集落形成能力进行分析比较。
1.6 统计学分析采用SPSS 23.0统计软件对样本进行数据整理和统计分析，计量资料以x±s表示。各指标的分析比较采用配对样本t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

目前，造血干细胞移植已成为临床上治疗血液肿瘤的主要手段[18-20]。造血干/祖细胞在血细胞的增殖分化和移植后的临床疗效中起着关键作用，近些年人脐血已成为造血细胞研究和移植的重要来源[21-24]。人脐血CD34+细胞在造血干细胞移植、体外扩增培养及基因治疗等方面都有广泛的应
用[17，25]，然而这些干细胞的数量极低。因此，干细胞体外扩增是目前增加造血干/祖细胞数目用于移植的途径之一[26]。共培养系统模仿体内造血微环境，为维持和促进造血干/祖细胞分化提供了重要的环境支持[27]，骨髓间充质干细胞具有明显的支持造血功能，体外条件下可促进造血干/祖细胞增殖和分化，是迄今为止最有效的支持造血干细胞体外扩增的基质细胞来源[27-28]，但从骨髓获取间充质干细胞具有局限性，因此寻找非骨髓来源基质细胞变得尤为重要。
骨骼肌遍布全身、取材方便，这种优势使得骨骼肌有可能作为基质细胞的丰富来源。研究发现造血干/祖细胞可以促进肌肉损伤修复，将CD45+造血干细胞通过静脉移植入小鼠体内，小鼠骨骼肌组织中造血干细胞数量多的部位产生了骨骼肌纤维[29-30]；相反也有研究证实肌源性干/祖细胞能重建造血缺陷小鼠的造血功能，从而证明了肌源性干/祖细胞可以向造血干细胞分化[31]，血管内皮细胞也被证实在骨髓微环境中起到积极的作用[26]。经鉴定确认人肌血管内皮细胞与间充质干细胞存在相似性[10]，若同样作为基质细胞，人肌血管内皮细胞支持体外造血的作用值得研究。
该研究建立了以人肌血管内皮细胞为滋养层与人脐血CD34+细胞体外共培养体系，检测体外共培养过程中人脐血CD34+细胞数量、造血干/祖细胞集落形成、血细胞免疫表型等指标。以人肌血管内皮细胞作为滋养层同样可以支持人脐血CD34+细胞的体外扩增，且能较好地维持细胞状态及活性。对共培养扩增过程中人脐血CD34+细胞数量、集落形成等长期培养的功能性指标分析显示，空白对照组人脐血CD34+细胞在第2周大量死亡，实验组和对照组人脐血CD34+细胞数明显增高，且实验组略高于对照组，但差异无显著性意义。随着共培养时间延长，细胞数逐渐下降，实验组的细胞数下降程度略缓于对照组。随着培养时间的延长，对照组和实验组的CD14+细胞及CD10+/CD19+细胞表达逐渐增加，CD45+、CD34+CD33-的表达率随之减低，第1，4周时两组的CD34+CD33-表达率差异无显著性意义，仅在第2周对照组CD34+CD33+的表达率高于实验组，差异有显著性意义，但在造血干细胞功能实验中干/祖细胞集落培养显示，第1，2，4周两组的集落形成能力同样差异有显著性意义。研究表明人肌血管内皮细胞作为滋养层和人骨髓间充质干细胞为滋养层相似，在体外可维持造血干/祖细胞的干性并对造血干/祖细胞具有支持作用[17]。因此，该研究发现人肌血管内皮细胞是一种潜在良好体外扩增人脐血CD34+细胞的基质细胞，能够为造血干/祖细胞的扩增提供一个丰富的基质细胞来源。在后续实验中将进一步从细胞因子分泌等方面研究人肌血管内皮细胞的促造血机制，这将为未来应用造血干细胞移植的基质细胞来源提供一个新思路。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

人骨骼肌源性血管内皮细胞对造血干/祖细胞的体外支持

Supporting effect of human skeletal muscle-derived myoendothelial cells on hematopoietic stem/progenitor cells in vitro

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 7

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	侯婧瑛, 于萌蕾, 郭天柱, 龙会宝, 吴浩. 缺氧预处理激活HIF-1α/MALAT1/VEGFA通路促进骨髓间充质干细胞生存和血管再生[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 985-990.
[2]	伦志刚, 金晶, 王添艳, 李爱民. 过氧化物还原酶6干预骨髓间充质干细胞增殖及体外向神经谱系诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1014-1018.
[3]	刘建友, 贾中伟, 牛佳伟, 曹鑫杰, 张栋, 魏杰. 构建股骨3D数字化模型提出一种新的股骨颈前倾角测量方法[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(24): 3779-3783.
[4]	黄茂茂, 胡月, 王彬川, 张驰, 谢羽婕, 王剑雄, 汪丽, 胥方元. 缺血性脑卒中康复近10年国际文献计量学及可视化分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3725-3733.
[5]	朱蕊, 曾庆, 黄国志. 铁死亡与脑卒中[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3734-3739.
[6]	李珊珊, 尤冉, 郭笑霄, 赵露, 王艳玲, 陈曦. 视神经再生机制研究与进展[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3740-3745.
[7]	王震, 蔺海旗, 何霏, 林文弢. 运动激活骨骼肌卫星细胞：增龄性肌衰减症及肌肉损伤修复的运动预防和治疗[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3752-3759.
[8]	宋世雷, 陈跃平, 章晓云, 李时斌 , 赖渝, 周毅. 五苓散治疗骨关节炎潜在分子机制及网络药理学与分子对接[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3185-3193.
[9]	李震, 黄永辉, 孙继芾, 孙海涛. 黏着斑激酶诱导小鼠胚胎成纤维细胞成骨分化的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 165-171.
[10]	胡广, 关智宇, 张开伟. 三七总皂苷干预去势骨质疏松性骨折模型大鼠的作用机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 172-177.
[11]	耿彬, 夏亚一. 调控骨质疏松模型小鼠的ERK5蛋白信号通路[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 178-185.
[12]	李啸群, 徐凯航, 纪方. 补骨脂异黄酮抑制破骨细胞分化缓解小鼠去卵巢骨质疏松[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 186-190.
[13]	李平, 林煜, 陈翔, 刘振涛, 肖莉莉, 林学义, 华鹏. 二至丸提取物干预去势骨质疏松雌性模型大鼠的骨重建特点[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 191-195.
[14]	刘杏, 魏晓菡, 邓洁, 李仲铭. 骨骼肌钝挫伤兔模型制备与打击力度的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 196-200.
[15]	黄旭东, 易志勇, 韩清民. 经筋手法干预膝骨关节炎模型兔骨骼肌收缩力学的改变[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 201-204.