2.1  实验对象数量分析  共纳入15例患者，治疗及随访过程中无脱落，均进入结果分析。

2.2  试验流程图  见图1。  

2.3  脐带间充质干细胞治疗效果  13例患者为累及皮肤、口腔、眼部和肝脏的两三个器官的Ⅲ度或Ⅳ度慢性移植物抗宿主病，2例为累及肺部Ⅳ度慢性移植物抗宿主病。单次输注细胞数量为1×10⁶/kg，10例患者输注4次，1例患者输注5次，4例患者输注8次。4例获得完全缓解，7例获得部分缓解，4例无效，有效率为73.3%(11/15)。10例患者合并皮肤病变，经脐带间充质干细胞治疗后1例获得完全缓解，7例获得部分缓解，2例无效；2例患者合并肝脏病变，经脐带间充质干细胞治疗后获得完全缓解；2例患者合并肺部病变，经脐带间充质干细胞治疗后无效，见表1。

2.4  脐带间充质干细胞治疗前后患者外周血淋巴细胞比值变化  脐带间充质干细胞治疗后患者外周血中CD19⁺细胞比值有低于治疗前趋势，CD19⁺CD27⁺、CD3⁺细胞比值有高于治疗前趋势，差异无显著性意义。CD3⁺CD4⁺、CD3⁺CD8⁺、CD16⁺CD56⁺细胞比值治疗前后无明显变化，见表2。

2.5  随访情况  随访至2019-06-01，中位随访13(6-18)个月，15例患者均存活，无患者死亡。

2.6  输注脐带间充质干细胞的安全性  脐带间充质干细胞输注期间及输注后均未发生发热、寒战、皮疹等过敏反应，无原发病复发及脐带间充质干细胞相关的肿瘤。脐带间充质干细胞输注期间及治疗后无患者继发感染，EB病毒和巨细胞病毒DNA定量检测均阴性，未观察到EB病毒及巨细胞病毒激活。

异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)是目前治疗恶性血液病的有效方法。慢性移植物抗宿主病(chronic graft-versus-host diaease，cGVHD)是移植后最常见的并发症，一般发生在移植100 d以后，是移植后非复发致死的主要原因^[1]。糖皮质激素是目前治疗慢性移植物抗宿主病的一线药物，对于激素耐药型慢性移植物抗宿主病联用免疫抑制剂治疗仍有一半的患者无效^[2]，严重影响移植疗效和患者生存质量。

间充质干细胞是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的非造血系干细胞，主要来源于骨髓、脐血、肝脏及脂肪等组织中，免疫原性低，能够抑制T细胞反应，调节B细胞、NK细胞和树突状细胞功能^[3]，为临床治疗慢性移植物抗宿主病提供了可能。脐带间充质干细胞取材不受限制，对供者没有损伤，增殖能力强，体外可大量扩增，是一种极佳的间充质干细胞^[4-6]。中山大学附属第三医院血液内科采用脐带间充质干细胞治疗15例造血干细胞移植后难治性慢性移植物抗宿主病患者，取得了较好的临床疗效，现报道如下。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1  设计  前瞻性前后对照研究。

1.2  时间及地点  病例来源于2017年9月至2018年11月中山大学附属第三医院血液内科。

1.3  对象  共入组15例造血干细胞移植后难治性慢性移植物抗宿主病患者，其中男12例，女3例，中位发病年龄29(17-52)岁；急性髓系白血病(AML)6例，急性淋巴细胞白血病(ALL)7例，骨髓增生异常综合征(MDS)1例，再生障碍性贫血(AA)1例。供者来源：HLA相合同胞10例，HLA相合无关供者1例，HLA半相合同胞4例。所有受者知情同意，均签署知情同意书。该研究符合中山大学附属第三医院相关伦理要求，医院伦理批件号：[2016]2-152，审批时间：2016-11-28。

诊断标准：异基因造血干细胞移植100 d以后发生的Ⅲ度或Ⅳ度慢性移植物抗宿主病，以糖皮质激素为基础的免疫抑制治疗方案治疗2个月以上慢性移植物抗宿主病症状无改善或治疗1个月后仍出现疾病进展^[7]。

纳入标准：①年龄18-65岁；②接受异基因造血干细胞移植；③激素耐药性慢性移植物抗宿主病。

排除标准：①原发病复发后因停用免疫抑制剂或供者淋巴细胞输注导致的慢性移植物抗宿主病；②严重心功能不全或既往有充血性心衰病史；③非移植物抗宿主病导致的严重肺功能不全(阻塞性和/或限制性通气障碍)、肝功能指标(谷丙转氨酶或血清总胆红素)大于正常值上限2倍以上，以及严重肾功能不全，肌酐清除率< 30 mL/min；④研究者评价不能入选的其他原因。

1.4  方法

1.4.1  预处理方案和移植物抗宿主病预防  12例患者采用改良BuCy为主方案[阿糖胞苷2 g/(m²·12 h) (-9 d至   -8 d)；司莫司汀250 mg/m²(-9 d)；白消安4 mg/(kg·d)(-7 d至-4 d)；环磷酰胺60 mg/(kg·d) (-3 d至-2 d)]；2例患者采用全身照射+环磷酰胺方案；1例再生障碍性贫血患者采用抗胸腺细胞球蛋白+环磷酰胺方案。全身照射剂量4 Gy/d，分2次(-11 d至-9 d)，抗胸腺细胞球蛋白总量为10 mg/kg (-4 d至-1 d)。

10例HLA相合同胞患者移植物抗宿主病的预防采用环孢素加短程甲氨蝶呤方案；1例HLA相合无关患者和4例HLA半相合同胞患者采用环孢素+短程甲氨蝶呤+抗胸腺细胞球蛋白+吗替麦考酚酯方案。短程甲氨蝶呤15 mg/m²  (+1 d)；10 mg/m²(+3 d、+6 d、+11 d)；环孢素3 mg/(kg·d)，持续24 h静脉滴注，无胃肠道反应改为口服，定期检测血药浓度，维持环孢素的血药浓度在200-300 μg/L；抗胸腺细胞球蛋白总量为10 mg/kg(-4 d至-1 d)；吗替麦考酚酯 15 mg/(kg·12 h)，-9 d开始服用，+30 d开始减量，+60 d至+90 d停用。

1.4.2  脐带间充质干细胞制备及输注  脐带来源于中山大学附属第三医院健康足月剖宫产孕妇，均签署知情同意书。经中山大学附属第三医院伦理委员会审批，于生物治疗中心实验室(经GMP认证)无菌工作环境下，采用组织贴壁培养法制备脐带间充质干细胞^[8-9]。脐带剪碎成1 mm³的组织块，贴在细胞培养皿底部，15 d左右用胰酶将其消化，将分离的细胞按2×10⁴/cm²的密度接种于细胞培养皿中，置于37 ℃，体积分数为5%CO₂饱和湿度的孵箱中进行培养。待细胞培养皿内细胞长至85%-90%以上融合时进行传代培养，采用第3-5代新鲜制备脐带间充质干细胞用于临床治疗。流式细胞仪测定细胞免疫表型，CD90、CD105、CD73阳性率> 95%；CD45、CD34、CD14、CD19、HLA-DR等阳性率< 2%。15例患者给予环孢素和(或)他克莫司或西罗莫司治疗2个月以上，临床症状无改善，在原有免疫抑制剂的基础上接受脐带间充质干细胞治疗。环孢素         6 mg/(kg·d)，维持血药浓度在200-300 μg/L；西罗莫司首次6 mg，随后2 mg/d，维持血药浓度在5-15 μg/L；他克莫司2 mg/d，维持血药浓度在5-15 μg/L。脐带间充质干细胞1×10⁶/kg，悬浮于100 mL生理盐水中，输注前常规给予地塞米松、非那根预防性抗过敏处理，输注时间30 min，每周1次，共4-8次。

1.4.3  流式细胞术检测外周血淋巴细胞比例  脐带间充质干细胞开始治疗前1周和治疗结束后1周抽取患者外周血，EDTA管抗凝2 mL，采用流式细胞术检测患者外周血淋巴细胞比例。外周血标本用PBS洗涤，调整细胞浓度为(1-10)×10⁹ L^-1；按比例分别加入CD19、CD27、CD3、CD4、CD8、CD45抗体(Becton Dickinson公司)，室温避光孵育20 min；然后加入溶血素，避光孵育10 min，PBS重悬洗涤，弃上清；加入500 μL PBS重悬细胞上机检测，以CD45-SSC设门圈出淋巴细胞。

1.4.4  病原学检测  脐带间充质干细胞治疗前及治疗期间每周监测患者外周血EB病毒(EBV)和巨细胞病毒(CMV)DNA水平，治疗结束后改为每4周1次，直至治疗后半年。

1.4.5  疗效评价  完全缓解：慢性移植物抗宿主病临床症状、体征消失；部分缓解：至少1个受累器官临床症状、体征明显改善，并且其他器官症状无加重；无效：慢性移植物抗宿主病症状体征无改善或进行性加重。治疗有效包括完全缓解和部分缓解^[10]。

1.5  主要观察指标  患者的疗效、输注相关不良反应和存活情况。

1.6  统计学分析  采用SPSS 19.0统计学软件。结果数据采用x(_)±s表示，治疗前后数据比较采用Wilcoxon检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

间充质干细胞是一种具有自我更新和多向分化潜能的成体造血干细胞，可向脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞分化，同时可分泌多种细胞因子发挥免疫调控作用^[11]。相对于骨髓和脂肪间充质干细胞而言，脐带间充质干细胞对供者没有损伤，而且具有组织来源丰富、细胞原始、增殖能力强、安全无病原体感染等优点，目前可稳定地在体外分离扩增，是一种理想的间充质干细胞^[4]。

2004年LE BLANC等^[12]首次采用患儿母亲骨髓来源间充质干细胞治疗1例非血缘HLA相合外周血造血干细胞移植1周后出现的Ⅳ度慢性移植物抗宿主病患者，是糖皮质激素治疗无效的累及肝脏和肠道的移植物抗宿主病，患儿的腹泻症状改善且胆红素水平下降，疗效显著。随后，国内多个研究中心相继采用间充质干细胞治疗急性移植物抗宿主病，取得较好的疗效^[13-15]。WENG等^[16]采用骨髓间充质干细胞治疗19例难治性慢性移植物抗宿主病患者，4例获得完全缓解，10例获得部分缓解，总有效率为73.3%。INTRONA等^[17]采用骨髓间充质干细胞治疗40例难治性慢性移植物抗宿主病患者，有效率为67.5%，完全缓解率为27.5%。国内有研究报道在原有免疫抑制剂基础上联合间充质干细胞治疗12例激素耐药性慢性移植物抗宿主病患者，发现3例患者获得完全缓解、6例获得部分缓解，总有效率为75%^[18]。课题组前期用人脐带间充质干细胞治疗7例难治性慢性移植物抗宿主病，2例完全缓解，3例部分缓解，有效率为71.7%^[19]。该研究中15例患者接受了脐带间充质干细胞输注治疗，4例完全缓解，7例部分缓解，有效率为73.3%，与文献报道的结果相似。作者同时观察了间充质干细胞对不同受累器官的治疗效果，发现间充质干细胞对于肝脏、皮肤病变疗效较好，对于肺部病变无明显疗效。

移植物抗宿主病是一种由移植物中供者来源T细胞对受体组织的免疫攻击介导的严重的免疫炎症^[20]，临床表现多样，主要累及皮肤、口腔、眼睛、肝脏、胃肠道及肺等器官^[21-22]。尽管供者T细胞在启动和维持同种免疫中起着关键作用，但是近期的研究表明，供者B细胞在慢性移植物抗宿主病的发病机制中起着重要作用^[23]。间充质干细胞具有免疫调节特性，体外研究显示其可抑制CD4、CD8、NK细胞毒性，诱导Tregs细胞和抑制B淋巴细胞增殖^[24]。PENG等^[25]研究发现骨髓间充质干细胞治疗后达到完全缓解和部分缓解的患者外周血中记忆B细胞数量明显增加。该研究发现脐带间充质干细胞治疗后CD19⁺B淋巴细胞数量有下降趋势，CD19⁺CD27⁺(记忆B)细胞数量有上升趋势，推测脐带间充质干细胞可能通过影响B淋巴细胞的增殖和分化发挥免疫调节效应，具体机制尚需进一步研究。

研究初步显示，脐带间充质干细胞治疗难治性慢性移植物抗宿主病具有一定的疗效。由于发生慢性移植物抗宿主病的患者同时具有较强的移植物抗宿主病效应，对原发病的复发具有一定的预防作用^[26-28]，因此间充质干细胞输注是否会增加原发病复发及继发第二肿瘤是目前备受关注的问题。KIM等^[29]研究发现间充质干细胞可预防移植物抗宿主病的发生，但间充质干细胞组原发病的复发率高于对照组。BARON等^[30]采用第三方来源的间充质干细胞预防移植物抗宿主病研究结果显示，移植物抗宿主病发生率减少，1年总体生存率增加且复发率不增加。KUZMINA等^[31]研究报道间充质干细胞组与对照组原发病复发率相当。该研究中未观察到患者出现原发病复发及继发第二肿瘤，但随访时间短，样本例数尚少，对于间充质干细胞治疗是否增加原发病的复发及继发第二肿瘤尚不能得出确切结论。

综上所述，脐带间充质干细胞治疗难治性慢性移植物抗宿主病安全有效，大多数患者能耐受。由于研究样本例数少，随访时间短，为了进一步优化脐带间充质干细胞的临床应用，未来尚需多中心扩大样本量和进一步深入研究。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：

脐带间充质干细胞：间充质干细胞是一类具有自我更新和多项分化潜能的非造血系干细胞，主要来源于骨髓、脐血、脂肪及肝脏等组织中，具有低免疫原性、多项分化潜能、造血支持和独特的免疫调节等特点。脐带间充质干细胞具有免疫原性低、潜在的病原体污染机会少、增殖能力强、取材不受限制、可大量扩增等优势，是一种极佳的间充质干细胞。

慢性移植物抗宿主病：是移植后最常见的并发症，一般发生在移植100 d以后，由移植物中供者来源T细胞对受体组织免疫攻击介导的严重的免疫炎症，临床表现多样，主要累及皮肤、口腔、眼睛、肝脏、胃肠道及肺等器官。糖皮质激素是目前治疗慢性移植物抗宿主病的一线药物，对于激素耐药型慢性移植物抗宿主病联用免疫抑制剂治疗仍有一半的患者无效，严重影响移植疗效和患者生存质量。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

Le Blanc等^[1]于2004年首次尝试用患儿母亲骨髓间充质干细胞治疗1例糖皮质激素耐药的Ⅳ度肠道和肝脏急性移植物抗宿主病患儿，取得较好的疗效，开启了间充质干细胞治疗造血干细胞移植后移植物抗宿主病新时代。随后国内外多个研究中心相继采用间充质干细胞治疗慢性移植物抗宿主病，取得较好的疗效。Weng等^[2]采用骨髓间充质干细胞治疗19例难治性慢性移植物抗宿主病患者，4例获得完全缓解，10例获得部分缓解，总有效率为73.3%。Introna等^[3]采用骨髓间充质干细胞治疗40例难治性慢性移植物抗宿主病患者，有效率为67.5%，完全缓解率为27.5%。作者的这项研究为前瞻性、单中心临床研究，观察脐带间充质干细胞治疗难治性慢性移植物抗宿主病的疗效及安全性，有效率为73.3%，与文献报道的结果相似。但是该研究样本例数少，随访时间短，未设立对照及双盲，未来尚需多中心扩大样本量和进一入深入研究。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程