骨髓基质干细胞缺血心肌内移植早期：可减少心肌细胞凋亡但未改善心功能

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.01.019

摘要/Abstract

摘要：

背景：骨髓基质干细胞移植到梗死心肌组织能够起到抑制和减少心肌细胞凋亡的效应，而这一作用与心功能改善是否有相关性还不清楚。
目的：观察缺血心肌内移植骨髓基质干细胞早期对心脏功能的影响。
方法：采用结扎左前降支的方法建立大鼠急性心肌梗死模型，假手术组仅穿线不结扎。骨髓基质干细胞移植组于心肌梗死术后30 min分5个位置于梗死边缘向心肌组织内移植大鼠骨髓基质干细胞0.1 mL(2×10⁶)，而假手术组、模型组术后分别向心肌内注射相同剂量的生理盐水。细胞移植后3 d监测血流动力学、超声心动图，TUNEL法检测心肌细胞凋亡的变化。
结果与结论：移植后第3天，与假手术组相比，模型组梗死区及缺血区心肌细胞凋亡明显；骨髓基质干细胞移植组梗死区和缺血区心肌细胞凋亡数目均较模型组显著减少。与假手术组相比，模型组和骨髓基质干细胞移植组大鼠平均动脉压、左心室收缩压明显下降，左心室舒张末压显著升高，左心室射血分数及缩短分数显著降低(P < 0.05)，骨髓基质干细胞移植组和模型组比较差异无显著性意义(P > 0.05)。结果表明骨髓基质干细胞移植早期能减少心肌细胞凋亡但不改善急性心肌梗死后大鼠的心功能。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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关键词: 干细胞, 移植, 骨髓干细胞, 骨髓基质干细胞, 移植, 急性心肌梗死, 细胞凋亡, 血流动力学, 超声心动图, SD大鼠

Abstract:

BACKGROUND: Bone marrow stromal stem cells transplanted into infracted cardiac tissue can inhibit and reduce myocardial apoptosis, but whether this effect is correlated with improvement in cardiac function is still unclear.
OBJECTIVE: To study the early effect of bone marrow stromal stem cells transplanted into the ischemic myocardium on the cardiac function.
METHODS: Models of acute myocardial infarction were established by ligation of the left anterior descending branch, while no ligation was done in the sham group. In the transplantation group, rat bone marrow stromal stem cells (0.1 mL, 2×10⁶) were injected into five sites on the edge of infarcted myocardial tissues at 30 minutes after myocardial infarction. In the sham group and model group, the same volume of normal saline was injected into the myocardial tissues. Three days after cell transplantation, hemodynamic monitoring, echocardiography, TUNEL assay were employed to detect myocardial apoptosis.
RESULTS AND CONCLUSION: At 3 days after cell transplantation, myocardial apoptosis was more evident in the infarct and ischemic zones of the model group than the sham group; the number of apoptotic myocardial cells was significantly lower in the infarct and ischemic zones of the transplantation group than the model group. Compared with the sham group, the mean arterial blood pressure and left ventricular systolic pressure were significantly reduced, the left ventricular end diastolic pressure was increased, and the left ventricular ejection fraction and shortened fraction were significantly lowered in the model and transplantation groups (P < 0.05), but there was no difference between the model and transplantation groups (P > 0.05). These findings indicate that myocardial apoptosis can be reduced but the cardiac function cannot be improved in acute myocardial infarction rats at early stage after bone marrow stromal stem cells transplantation.

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Key words: Bone Marrow, Stem Cells, Myocardial Infarction, Apoptosis

中图分类号:

R394.2

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图/表（结果） 4

2.1 骨髓基质干细胞的鉴定结果 分离的细胞在培养瓶中贴壁生长，呈长梭形、成纤维样，多为几个细胞散在分布。第5天时，细胞快速增殖，呈集落状态生长，边缘遮光性强。第10天时细胞基本达到85%融合状态。传代后的骨髓基质干细胞增殖迅速，为成纤维细胞样。

贴壁细胞经过成脂诱导后，油红O原位染色发现细胞内布满圆形透亮空泡，染成桔红色，说明有大量脂肪细胞生成。成骨诱导后Van-kossa染色可见细胞及周围出现大量的棕黑色钙结节沉积。对照组油红O及Van-kossa染色均为阴性反应。通过细胞增殖情况和细胞分化能力可以证明培养的贴壁细胞为骨髓基质干细胞(图1)。

2.2 实验动物数量分析 纳入30只SD大鼠，中途如有死亡，后续补充新的实验动物或模型动物。

2.3 心肌细胞凋亡情况 TUENL法检测发现，凋亡的心肌细胞核被染成棕褐色，而正常细胞核被染成深蓝色。未凋亡的细胞核较大，形态较为一致，凋亡的细胞核形状不十分规则。移植后第3天，与假手术组相比，梗死模型组梗死区及缺血区心肌细胞凋亡明显；骨髓基质干细胞移植组梗死区和缺血区心肌细胞凋亡数目均较梗死模型组显著减少，见图2。

2.4 血流动力学变化 实验各组动物心率差异无显著性意义(P > 0.05)。模型组和骨髓基质干细胞移植组动物的平均动脉压、左心室收缩压、左室内压变化最大速率及左心室收缩压校正的左室内压变化最大速率均显著下降(P < 0.01)，左心室舒张末压数值明显升高(P < 0.01)；模型组及骨髓基质干细胞移植组之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。上述结果提示，心肌梗死后大鼠血流动力学水平在3 d内持续恶化，骨髓基质干细胞移植短时间内对心脏的血流动力学没有明显的改善作用，见表1。

2.5 超声心动图结果与假手术组比较，模型组及骨髓基质干细胞移植组大鼠的左室射血分数及左室缩短分数指标明显下降(P < 0.05)，而模型组和骨髓基质干细胞移植组之间比较差异无显著性意义(P > 0.05)。超声结果同样提示移植骨髓基质干细胞后3 d时间内对梗死大鼠左心功能改善不明显，见图3。

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引言

材料方法

设计：平行观察对照实验。

时间及地点：实验于2013年11月至2014年9月在辽宁医学院人体解剖学实验室完成。

材料：

实验动物：健康清洁级SD大鼠30只，4月龄，雌雄不限，体质量为(240±10) g，由辽宁医学院实验动物中心提供。实验过程中对动物的处置方法符合2009年《Ethical issues in animal experimentation》相关动物伦理学标准的条例。

实验方法：

骨髓基质干细胞的分离、培养及鉴定：无菌条件下冲出SD大鼠双侧股骨骨髓，1 000 r/min离心3 min后，去掉上清。DMEM悬浮细胞后接种于25 cm²培养瓶中，培养体系为含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基，置于 37 ℃、饱和湿度和体积分数为5%CO₂培养箱内培养。当贴壁细胞达到90%融合后采用0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA的混合液进行消化，收集细胞并重新悬浮按照1∶3进行传代扩增。

参考以往文献报道对第3代细胞进行体外诱导分化^[6]，成脂诱导14 d后油红O染色检测脂质沉积情况，成骨诱导21 d后Van kossa法检测钙结节形成情况。

实验分组及干预：30只大鼠随机分为模型组、骨髓基质干细胞移植组和假手术组，每组10只。将SD大鼠用2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，然后连接便携式呼吸机对大鼠进行辅助呼吸，暴露胸腔，按照文献[7]方法结扎左前降支近段20 min建立心肌缺血模型，假手术组不进行结扎。骨髓基质干细胞移植组于心肌梗死术后30 min分5个位置于梗死边缘向心肌组织内移植扩增纯化的大鼠骨髓基质干细胞0.1 mL(2×10⁶)，而假手术组、模型组于术后相同时间点分别向心肌内注射相同剂量的生理盐水，关胸，腹腔内注射20×10⁴ U青霉素预防感染，分笼饲养。

超声心动图检查：移植后3 d进行超声心动图检测。用2%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉动物，弯剪剃除心脏区域的毛，大鼠呈仰卧固定，将微探头放在动物胸骨左缘第4，5肋间，将模式切换到M-型超声影像，测量左心室舒张末期、收缩末期的心内径，室间隔厚度以及左心室后壁的厚度，然后通过软件计算左室射血分数(LVEF)和左室缩短分数(LVSF)。

血流动力学检测：在超声心动图检查后，将大鼠颈部的皮毛剔除，沿颈部正中线切开皮肤，分离右侧颈总动脉，在右颈动脉远心端处穿线并扎结。将生理压力记录仪导管插入血管近心端，压力示波模块调定零点，记录主动脉和左心室压力值并绘制曲线图。与此同时检测主动脉舒张压、收缩压以及左心室舒张末压(LVEDP)、左心室收缩压(LVSP)及左室内压变化最大速率(±dp/dt_max)并计算平均值，将±dp/dt_max/LVSP值定为校正值。平均动脉压(MAP)=舒张压+1/3(收缩压-舒张压)。
心肌细胞凋亡检测^[8]：血流动力学检测后通过右颈动脉注入10% KCl 2 mL，使心脏于舒张期停止。将心脏分离出来，盐水冲洗，用刀片切掉右心室(不含室间隔)，剩下的左心室沿着纵轴切开，常规石蜡包埋心尖部分，5 μm厚切片按TUNEL试剂盒说明步骤行细胞凋亡检测。

主要观察指标：血流动力学指标，超声心动图指标，细胞凋亡情况。

统计学分析：采用SPSS 17.0统计软件进行处理。数据以x(_)±s形式表示，组间比较采用t 检验或方差分析。P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

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讨论

心肌缺血缺氧是细胞发生凋亡的重要原因，心肌凋亡后会通过一系列信号扩大细胞凋亡坏死过程，导致更严重的后果发生。本研究通过结扎法切断心脏血流造成急性心肌梗死模型，经TUENL染色发现，梗死后3 d在心脏梗死区以及梗死边缘的缺血区均出现相当数量的凋亡心肌细胞，表现为TUNEL染色中细胞核被染成棕褐色，尤其是梗死区细胞凋亡比例达到最高，这说明梗死后缺血严重区诱发了大量凋亡程序的发生，这有可能导致更大范围的心肌细胞死亡。骨髓基质干细胞移植后3 d发现梗死区域及边缘区域的凋亡细胞比例明显下降，但是超声和生理导向器测得的心脏血流动力学指标在骨髓基质干细胞移植前后没有明显改善，这说明骨髓基质干细胞移植早期对心脏功能改善作用不甚明显。出现这种结果也在预料之中，因为骨髓基质干细胞移植早期，细胞在局部增殖分化新的心肌细胞比例有限，尤其是在梗死早期大量心肌细胞死亡，局部严重的炎症反应等多种因素都不会使得心脏血流动力学或心脏功能明显改善^[9]。

Noiseux等^[8]和Gnecchi等^[10]采用骨髓基质干细胞移植对于心肌功能取得了一定的改善作用，分析原因是他们采用了Akt基因修饰骨髓基质干细胞，Akt基因发挥作用使得移植骨髓基质干细胞的存活率显著增加，同时该基因能够抑制和减少骨髓基质干细胞凋亡。另外有研究发现Akt信号通路的激活，可以更好地使移植的骨髓基质干细胞发挥保护心肌细胞的作用，因为Akt基因修饰可以发挥和扩大骨髓基质干细胞自身的旁分泌作用以及组织修复作用，而这些作用可能是基因修饰后骨髓基质干细胞对心脏功能改善的效果优于单纯应用骨髓基质干细胞的原因之一^[11-12]。

细胞凋亡是个非常复杂的进程，涉及多个凋亡信号通路的转导、凋亡的诱发因素和凋亡效应因子。在凋亡相关因子中，半胱氨酸蛋白酶家族成员发挥重要作用，Caspase-3蛋白是很多种类的细胞凋亡启动后的最终凋亡蛋白酶。Bcl-2是调控Caspases活化等过程中非常重要的调控因子^[13]。

本实验中发现移植的骨髓基质干细胞进入心脏后凋亡的细胞比例显著降低，这说明骨髓基质干细胞可以发挥了抑制心肌细胞凋亡的作用，但是其确切的机制不明确。Zachary等^[14]的研究表明，局部骨髓基质干细胞移植能够促进梗死病灶部位产生新生的血管，同时通过Ras信号通路激活PI3K/Akt信号，导致Bcl-2表达的水平升高，进而来发挥抑制并减少心肌细胞凋亡的作用。国内Tang等^[15]的研究也发现，梗死部位移植自体骨髓基质干细胞后，导致梗死部位凋亡的心肌细胞数量显著降低，这时促凋亡蛋白Bax的表达水平降低了60%左右，说明骨髓基质干细胞还通过下调促凋亡蛋白表达的机制来抑制心肌细胞的凋亡。近来研究表明，骨髓基质干细胞可通过旁分泌作用机制使得心肌细胞所产生的促凋亡因子灭活，进而从抑制凋亡信号途径上发挥作用^[16-20]。研究表明骨髓基质干细胞还能够通过促进细胞生存的信号通路途径来抑制细胞凋亡信号的产生，并通过此作用减少心肌细胞的凋亡和进一步损伤^[21-24]。另外研究发现，骨髓基质干细胞降低心肌细胞凋亡的途径还可能通过免疫调节机制或者通过促进新血管生成的形式来实现^[25-29]。

总之，骨髓基质干细胞移植到缺血性梗死心肌组织早期能够显著抑制心肌细胞凋亡，但对于心肌血流动力学、心脏功能保护方面短期内未见改善作用，这种抗心肌凋亡作用在远期心功能维护中的作用及其机制有待进一步明确^[30-32]。由于骨髓基质干细胞移植在短时间内很难大量扩增并修复受损伤的心肌组织，因此，短期内对于心肌的保护作用是不切实际的，今后应该长期连续观察移植后的心肌功能，以期待有新的发现^[33-36]。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程
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细胞凋亡是个非常复杂的进程，涉及多个凋亡信号通路的转导、凋亡的诱发因素和凋亡效应因子。在凋亡相关因子中，半胱氨酸蛋白酶家族成员发挥重要作用，Caspase-3蛋白是很多种类的细胞凋亡启动后的最终凋亡蛋白酶。Bcl-2是调控Caspases活化等过程中非常重要的调控因子。本实验中发现移植的骨髓基质干细胞进入心脏后凋亡的细胞比例显著降低，这说明骨髓基质干细胞可以发挥了抑制心肌细胞凋亡的作用，但是其确切的机制不明确。Zachary等的研究表明，局部骨髓基质干细胞移植能够通过促进梗死病灶部位产生新生的血管，同时通过Ras信号通路激活PI3K/Akt信号，导致Bcl-2表达的水平升高，进而来发挥抑制并减少心肌细胞凋亡的作用。国内Tang等的研究也发现，梗死部位移植自体骨髓基质干细胞后，导致梗死部位凋亡的心肌细胞数量显著降低，这时促凋亡蛋白Bax的表达水平降低了60%左右，说明骨髓基质干细胞还通过下调促凋亡蛋白表达的机制来抑制心肌细胞的凋亡。近来研究表明，骨髓基质干细胞可通过旁分泌作用机制使得心肌细胞所产生的促凋亡因子灭活，进而从抑制凋亡信号途径上发挥作用。研究表明骨髓基质干细胞还能够通过促进细胞生存的信号通路途径来抑制细胞凋亡信号的产生，并通过此作用减少心肌细胞的凋亡和进一步损伤。另外研究发现，骨髓基质干细胞降低心肌细胞凋亡的途径还可能通过免疫调节机制或者通过促进新血管生成的形式来实现。

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