不同分子质量玻璃酸钠注射骨关节炎兔关节液内相关因子的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1932

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
玻璃酸钠：应用于骨关节炎治疗可有效改善关节液回流，降低化学物质对骨关节造成的疼痛刺激，减轻关节磨损，降低基质金属蛋白酶的表达，从而起到改变病理性关节液和疼痛的作用，且玻璃酸钠还可充当营养物质加快软骨愈合的速度，提高关节功能的恢复。
骨关节炎造模：采用前交叉韧带切断方法进行制备，造模后通过膝关节大体可观察到软骨光泽度差且局部伴有溃烂，通过光镜可见软骨浅层基质变性，软骨细胞层次不清等，此方法最终显示制备模型成功，此造模方法简单且重复性好，切断兔膝关节前交叉韧带来造成软骨退变，对膝关节的生理结构改变较少。

背景：临床研究显示，不同分子质量玻璃酸钠治疗骨关节炎的疗效存在一定差异。

目的：观察不同分子质量玻璃酸钠注射后，骨关节炎兔关节液内白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶3的变化。

方法：将40只大耳白兔(购自青海省实验动物中心)随机分为正常组、模型组、大分子组、小分子组，每组10只：对照组不做任何处理；其余3组在右膝关节腔注入木瓜蛋白酶建立骨关节炎模型，造模成功7 d后，大分子组、小分子组右膝关节腔内分别注射(1.5-2.5)×10⁶ Da、(0.8-1.5)×10⁶ Da的玻璃酸钠注射液0.3 mL，模型组注射等量生理盐水，1次/周，注射5周。末次注射7 d时，进行右膝关节腔MRI检测、软骨组织苏木精-伊红染色、关节冲洗液炎性因子质量浓度与蛋白聚糖、骨胶原基因表达检测。实验获得青海红十字医院伦理委员会批准，批准号：201802065。

结果与结论：①MRI检测：模型组存在关节积液，软骨表面不完整；大分子组软骨表面粗糙且软骨层变薄，但无关节积液；小分子组软骨表面明显粗糙且轻度变薄，但无关节积液；②苏木精-伊红染色：模型组、大分子组、小分子组均可见明显的软骨损伤，但大分子组、小分子组损伤程度轻于模型组，其中小分子组损伤程度最轻；③炎性因子检测：与对照组比较，模型组白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶3水平升高(P < 0.05)；与模型组比较，大分子组、小分子组白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶3水平降低(P < 0.05)；小分子组中白细胞介素1β、基质金属蛋白酶3水平低于大分子组(P < 0.05)，两组肿瘤坏死因子α水平比较差异无显著性意义(P > 0.05)；④基因检测：模型组蛋白聚糖、骨胶原基因表达低于对照组、大分子组、小分子组(P < 0.05)，大分子组蛋白聚糖、骨胶原基因表达低于小分子组(P < 0.05)；⑤结果表明：与大分子质量玻璃酸钠比较，小分子质量玻璃酸钠可促进骨关节炎软骨组织的修复，抑制滑膜炎症。

ORCID: 0000-0002-0188-2549(马志刚)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 玻璃酸钠, 不同分子质量, 骨关节炎, 白细胞介素1β, 肿瘤坏死因子α, 基质金属蛋白酶3, 关节腔, 软骨组织

Abstract:

BACKGROUND: Clinical studies have shown that sodium hyaluronate at different molecular weights exhibits therapeutic effects on osteoarthritis.

OBJECTIVE: To investigate the changes in interleukin-1 beta, tumor necrosis factor-alpha, and matrix metalloproteinase-3 in synovial fluid of osteoarthritis rabbits after treatment with different molecular weights of sodium hyaluronate injection.

METHODS: Forty rabbits (purchased from Qinghai Experimental Animal Center, China) were randomly divided into normal, model, macromolecule, and small molecule groups, with 10 rabbits in each group. The control group did not undergo any treatment. Rabbits in the remaining three groups were injected with papain via the right knee joint cavity to establish rabbit models of osteoarthritis. At 7 days after successful modeling, the right knee joint cavity of rabbits in the macromolecule and small molecule groups were injected with 0.3 mL of (1.5-2.5)×10⁶ Da and (0.8-1.5)×10⁶ Da sodium hyaluronate injection. Rabbits in the model group were injected with equal amounts of physiological saline, once a week, for 5 successive weeks. At 7 days after the last injection, the right knee joint cavity was examined by MRI, cartilage tissue was stained with hematoxylin-eosin, the level of inflammatory factors in the washing fluid was determined, and proteoglycan and collagen gene expression was detected. This study was approved by the Medical Ethics Committee of Qinghai Red Cross Hospital, China (No. 201802065).

RESULTS AND CONCLUSION: MR imaging: There were joint effusion and incomplete cartilage surface in the model group. In the macromolecule group, cartilage surface was rough and cartilage layer became thinner compared with the model group. Hematoxyin-eosin staining: Obvious cartilage injury was observed in the model, macromolecule, and small molecule groups, but the injury in the macromolecule, and small molecule groups was milder than that in the model group. The injury in the small molecular group was milder than that in the macromolecule group. Measurement of inflammatory factors: Compared with the control group, the levels of interleukin-1 beta, tumor necrosis factor-alpha and matrix metalloproteinase-3 increased in the model group (P < 0.05). Compared with the model group, the levels of interleukin-1 beta, tumor necrosis factor-alpha and matrix metalloproteinase-3 decreased in the macromolecule and small molecule groups (P < 0.05). The levels of interleukin-1 beta and matrix metalloproteinase-3 in the small molecule group were lower than those in the macromolecule group. There was no significant difference in the level of tumor necrosis factor-alpha between small molecule and macromolecule groups. Gene detection: Proteoglycan and collagen gene expression levels were significantly lower in the model group than in the control, macromolecule and small molecule groups (P < 0.05). Proteoglycan and collagen gene expression levels were significantly lower in the macromolecule group than in the small molecule group (P < 0.05). These results suggest that compared with large molecular weight of sodium hyaluronate, small molecular weight of sodium hyaluronate can promote the repair of cartilage tissue in osteoarthritis and alleviate synovitis inflammation.

Key words:

sodium hyaluronate, different molecular weights, osteoarthritis, interleukin-1beta, tumor necrosis factor-alpha, matrix metalloproteinase-3, articular cavity, cartilage tissue

中图分类号:

马志刚, 郭立平, 张建宁, 李永刚. 不同分子质量玻璃酸钠注射骨关节炎兔关节液内相关因子的变化[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(5): 694-698.

Ma Zhigang, Guo Liping, Zhang Jianning, Li Yonggang. Changes in related factors in synovial fluid of osteoarthritis rabbits after treatment with different molecular weights of sodium hyaluronate injection[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(5): 694-698.

图/表（结果） 6

2.1 实验动物数量分析 40只大耳兔均进入结果分析。

2.2 大体观察结果对照组关节腔内无积液，关节软骨表层光滑无病变发生，关节滑膜无增生发生。模型组、大分子组和小分子组均有不同程度的滑膜增生，关节腔内积液明显，呈淡黄色，软骨颜色暗淡无光泽。大分子组、小分子组大体评分明显低于模型组(P < 0.05)，大分子组大体评分明显高于小分子组(P < 0.05)，见图1。

2.3 MRI检查结果模型组关节腔存在关节积液，软骨层鼓面不完整；大分子组软骨表面粗糙，软骨层变薄，无关节积液；小分子组软骨表面粗糙，软骨层轻度变薄，无关节积液；对照组软骨表面光滑，无积液和病变的发生，见图2。

2.4 病理观察结果苏木精-伊红染色显示，对照组软骨表面光滑，骨细胞结构完整；模型组、大分子组和小分子组可明显的软骨损伤，且中层细胞明显减少，坏死细胞增加，但大分子组、小分子组损伤程度轻于模型组，其中小分子组损伤程度最轻，见图3。提示玻璃酸钠对骨关节炎具备较好的治疗作用。

2.5 软骨退变Mankin评分结果模型组Mankin评分明显高于对照组(P < 0.05)，大分子组、小分子组Mankin评分低于模型组(P < 0.05)，小分子组Mankin评分低于大分子组(P < 0.05)，见图4。

2.6 炎性因子检测结果与对照组比较，模型组白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶3水平升高(P < 0.05)；与模型组比较，大分子组、小分子组白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶3水平降低(P < 0.05)；小分子组中白细胞介素1β、基质金属蛋白酶3水平低于大分子组(P < 0.05)，两组肿瘤坏死因子α水平比较差异无显著性意义(P > 0.05)，见表2。

2.7 蛋白聚糖及骨胶原基因检测与对照组比较，模型组蛋白聚糖、骨胶原基因表达降低(P < 0.05)；与模型组比较，大分子组、小分子组蛋白聚糖、骨胶原基因表达升高(P < 0.05)；与大分子组比较，小分子组蛋白聚糖、骨胶原基因表达升高(P < 0.05)，见表3。

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引言

材料方法

1.1 设计比较观察实验。

1.2 时间及地点实验于2018年2月至2019年2月在青海红十字医院完成。

1.3 材料玻璃酸钠注射液的理化性能，见表1。

实验动物：大耳白兔40只，雌雄各20只，体质量 2.5-3.0 kg，购自青海省实验动物中心，许可证号：SYXK(青) 2016-0001]。动物均饲养在CL动物房间内，自由进食饮水并进行自然光照。将40只大耳白兔随机分为对照组、大分子组、小分子组及模型组，每组10只。实验获得青海红十字医院伦理委员会批准，批准号：201802065。

实验用主要试剂与仪器：白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶3 ELISA试剂盒检验(上海酶联生物公司)；Synergy HIM型全功能微孔板检测仪(美国Bio Tek公司)；DM6B倒置显微镜、ASP300S 组织脱水机、VT1200S全自动振动切片机(德国 Leica 公司)；5430 R型冷冻高速离心机(德国Eppendorf公司)。

1.4 实验方法对照组兔不做任何处理。取模型组、大分子组、小分子组实验兔，耳缘静脉注射25%乌拉坦4 mL/kg麻醉，将1.6%木瓜蛋白酶溶解于0.5 mL生理盐水中，随后注射于兔右膝关节腔内，3 d后行第2次注射，采用光镜观察软骨浅层基质变性，浅层细胞减少则表示骨关节炎造模成功。

造模成功7 d后，大分子组、小分子组右膝关节腔内分别注射(1.5-2.5)×10⁶ Da、(0.8-1.5)×10⁶ Da的玻璃酸钠 0.3 mL；模型组注射0.3 mL的生理盐水。1次/周，共注射5周。

1.5 主要观察指标末次注射7 d时，右膝关节MRI检查后处死动物，并打开右膝关节腔进行观察，采用1 mL生理盐水冲洗关节腔，并保留冲洗液。

大体观察：观察软骨表面、滑膜增生、滑液及关节囊等，并进行综合评分：关节面与色泽正常，为0分；裂痕小和关节面粗糙，为1分；软骨损伤和关节面溃烂，为2分；损伤至软骨深层，为3分；下骨质暴露和软骨脱离，为4分。

病理学观察：将软骨组织标本放入体积分数10%甲醛中固定48 h，乙醇脱水，二甲透明并进行石蜡切片，切片厚度为5 µm，苏木精-伊红染色观察软骨组织病理变化，观察4组动物潮线分布和细胞排列等情况。依据Mankin评分标准对关节软骨退变情况进行整体评分，评分标准为：①结构：结构正常，0分；表面不规则，1分；表面规则无血管翳形成，2分；移行层裂隙较深，3分；深达放射层裂隙，4分；深达钙化层裂隙，5分；结构絮乱，6分；②细胞：正常，0分；细胞群集，2分；细胞减少，3分。

炎性因子检测：取关节腔冲洗液，采用ELISA法检测白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α、基质金属蛋白酶3水平。

蛋白聚糖与骨胶原基因表达检测：使用Trizol提取液进行提取RNA并反转录cDNA，再进行合成后的cDNA中作为模板行PCR扩增，并以GAPDH基因为参照测量蛋白聚糖与骨胶原的表达。蛋白聚糖正向引物：5-TCC GCT GGT CTG ATG GAC AC-3，反向引物：5-CCA GAT CAT CAC TAC GCA GTC CTC-3；骨胶原正向引物：5-TCC TAA GGG TGC CAA TGG TGA-3，反向引物：5-GGA CCA ACT TTG CCT TGA GGA C-3。

1.6 统计学分析应用SPSS 15.0统计学软件进行数据分析，计数资料采用χ²检验，计量资料采用t 检验，单因素方差分析采用(ANOVA)检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

玻璃酸钠具有抗炎和抗肿瘤的特性，广泛分布与人体软骨、皮肤和关节滑液中，生物活性较高，适用于骨科使用^[6-7]。有研究显示，玻璃酸钠可有效改善患者关节疼痛和降低关节积液的发生率^[8]。玻璃酸钠在临床中不仅对关节具有润滑作用，还起到了抑制局部炎症和保护损伤软骨的作用^[9-10]。玻璃酸钠治疗骨关节炎的作用：①直接参与细胞外液中电解质和水分的调节；②与蛋白糖亚单位相结合并形成蛋白多糖聚合物，构成软骨基质；③分子筛作用，修复生理屏障、稳定疼痛及促进自身玻璃酸钠的合成等治疗骨关节炎。骨关节炎在临床中属于以关节软骨退变为主要病理特点的疾病，其发病机制与人体局部血液循环障碍、免疫功能异常、酶异常及炎性细胞因子增多相关，其中基质金属蛋白酶家族异常是目前诸多学者所研究的热门课题。采用玻璃酸钠治疗骨关节炎可补充患者外源性玻璃酸钠，提高关节液中玻璃酸钠的含量，改善或消除关节间的摩擦，促进软骨表面形成保护屏障，恢复关节内的环境，重建骨关节炎平衡系统。实验发现不同分子质量玻璃酸钠治疗骨关节炎的效果不同。因此，此次实验观察不同分子质量玻璃酸钠对骨关节炎的疗效。研究显示，外观评分、MRI结合及苏木精-伊红染色证实了玻璃酸钠对骨关节炎治疗有显著效果，小分子组中软骨组织修复和滑膜增生抑制情况明显优于大分子组^[11-15]。

实验Mankin评分显示，小分子组病情严重性显著低于模型组和大分子组，证实小分子质量玻璃酸钠对动物软骨退化起到了良好的抑制和保护作用。在玻璃酸钠治疗骨关节炎的过程中，可修复软骨和促进人体玻璃酸钠的合成，提示小分子质量玻璃酸钠的作用明显优于大分子质量玻璃酸钠，可能是小分子质量玻璃酸钠更易与纤维母细胞中的蛋白质相结合，促进纤维母细胞的运动活性，向组织损伤部位进行逐渐移动，有效保障了营养物质的渗透。有研究显示，分子质量0.9×10⁶ Da玻璃酸钠治疗骨关节炎患者的效果明显优于分子质量1.8×10⁶ Da的玻璃酸钠，且长期使用的不良反应发生率明显低于大分子质量玻璃酸钠^[16-20]。实验结果显示经玻璃酸钠治疗后，骨关节炎兔膝关节病理改变明显改善，且小分子组优于大分子组，提示小分子质量玻璃酸钠抑制兔膝关节滑膜炎症的效果明显优于大分子质量玻璃酸钠。关节腔液中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α炎性因子水平与骨关节炎病变程度呈正相关性，是促进骨关节炎疾病骨基质降解和骨破坏的重要因子。肿瘤坏死因子α在骨关节损伤中属于较为活跃的细胞因子，可导致滑膜细胞凋亡，是介导增生、破坏骨质的主要因子；白细胞介素1β可促进骨基质降解并对软骨细胞进行抑制，对软骨改变和骨胶原合成均有严重影响^[21-25]。不同分子质量玻璃酸钠在临床中可呈现不同的生物学效应和理化性质，联合使用是目前临床所研究的热门话题。有研究显示，小分子质量玻璃酸钠在关节滑膜胞外基质的扩散性及缓解炎症和改变滑液浓度等，均明显优于大分子质量玻璃酸钠^[26]。实验结果显示，大分子组、小分子组和模型组中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α水平明显高于对照组(P < 0.05)；小分子组白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α水平明显低于大分子组(P < 0.05)，因小分子质量玻璃酸钠抑制炎性因子的发生和合成明显优于大分子组和模型组。基质金属蛋白酶3对蛋白聚糖具有高度裂解性，还可改变蛋白聚糖的结构，从而降低其浓度。经检测发现，小分子组中基质金属蛋白酶3水平改善程度明显优于大分子组^[27-30]。

综上所述，不同分子质量玻璃酸钠治疗骨关节炎有显著疗效，(0.8-1.5)×10⁶ Da小分子量玻璃酸钠抑制骨滑膜炎和修复软组织的效果更加有效。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程