2.1  实验动物数量分析  实验选用大鼠20只，分为3组，实验过程中无脱失，全部进入结果分析。 

2.2  神经元细胞体  空白组正常大鼠脊髓神经元胞体的超微结构保存完好，细胞膜完整，细胞核大，圆形，位于细胞中央，核仁明显；胞浆内可见各种细胞器，如线粒体、高尔基复合体，尼氏体，成团的粗面内质网、核糖体、神经微丝、微管、分散的滑面内质网等结构(见图1A)；DF12组1 d时以核周体、线粒体和粗面内质网肿胀为主要变化，可见少量呈颗粒状改变的暗变性的核周体；7 d时损伤区及其邻近区的神经细胞细胞核内的核周体，呈现暗变性、亮变性、神经纤维部分崩解，可见到神经细胞坏死等变化。28 d时上述变化未见恢复，56 d时脊髓神经元胞体缩小、胞膜皱缩、细胞核的核周体呈暗变性，胞核固缩，严重者核仁均消失，线粒体，内质网，尼氏体、溶酶体等细胞器明显减少，多数视野未见细胞器，电子致密度增高(见图1B)；嗅鞘细胞移植组脊髓损伤区未见正常的核周体，脊髓损伤区神经细胞胞体长大、电子致密度降低、可见到少量的线粒体，高尔基复合体、尼氏体、神经微丝、微管、分散的滑面内质网等细胞器，核仁明显可见、可见一些亮、暗变性的核周体，神经元变性、坏死的程度略较DF12组轻(见图1C)。



2.3  神经纤维  空白组可见结构完整的神经纤维，其髓鞘保存完好，神经纤维内可见丰富的神经微丝、微管和少量线粒体(见图2A)；DF12组可见大量变性的有髓纤维，在1 d和7 d的样本上出现Wallerians变性，髓鞘出现肿胀，板层结构紊乱、疏密不均，和断裂崩解等，轴索肿胀，轴浆内微丝、微管结构已模糊不清、溶解。部分可见髓鞘崩解，髓鞘板层磷脂破坏，严重者已无明显分层，呈空化状态，神经微丝和微管消失，电子致密度增高，56 d时样本上，可发现大量增生的胶质瘢痕(见图2B)；嗅鞘细胞移植组能看到轻微的Wallerians变性、部分有髓纤维出现髓鞘轻度肿胀，可见富含微丝，微管和线粒体的神经纤维，神经纤维呈现暗或亮变性，增生的胶质瘢痕也没有DF12组明显，神经纤维的数目较DF12组明显增多，但和正常大鼠神经纤维数量相比仍有明显差异(见图2C)。



2.4  突触的变化  空白组有大量的突触，突触结构完整，突触前后膜可见，突触间隙存在，在突触前膨大处含有多个突触小泡(见图3A)；DF12组突触结构消失，结构紊乱，无法找到突触前后膜及突触间隙，未见神经元包体、轴突及树突，有大量增生的胶质瘢痕(见图3B)；嗅鞘细胞移植组有突触形成，突触结构完整，突触前后膜可见，突触间隙存在、突触前膨大处含有少量突触小泡，但数量没有正常组多(见图3C)。



2.5  神经胶质增生情况  空白组未见异常胶质瘢痕，DF12组脊髓损伤区有比较大的液化灶坏死灶，有大量增生的胶质纤维，可见变性的神经纤维结构等(见图4A)；嗅鞘细胞移植组脊髓损伤区，可见比较多的神经纤维和少的胶质瘢痕，也发现小的液化灶及巨噬细胞(见图4B)。

脊髓损伤是以16-30岁的青壮年为主要发病人群的一种常见创伤，一直是骨科及神经外科临床治疗的难点和研究热点^[1]。脊髓损伤后神经再生修复是最具挑战性的的医学难题，目前临床治疗手段缺乏，治疗方案还停留在减压融合、减少继发损伤及康复训练提高生活能力等方面，而对促进神经再生、恢复肢体功能却没有有效的方法^[2-3]，这主要因为成年哺乳动物中枢神经系统神经元无分裂、增殖能力，神经突起的生长及形成突触的能力有限，导致损伤平面以下的运动、感觉和自主神经功能紊乱。

细胞移植是治疗脊髓损伤具有里程碑意义的进展。目前，可用于移植的细胞主要有诱导多能干细胞^[4]、神经干细胞^[5]、骨髓间充质干细胞^[6]、许旺细胞^[7]、嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OECs)^[8]、激活的巨噬细胞等^[9]。近年来，嗅鞘细胞移植在脊髓损伤方面取得了一定的进展，Li等^[10]分离、培养大鼠嗅球来源的嗅鞘细胞，并将纯化后的嗅鞘细胞植入脊髓损伤动物体内，结果发现嗅鞘细胞可促进损伤轴突再生，还可促进脱髓鞘的轴突再髓鞘化，促进肢体功能恢复。但移植的嗅鞘细胞对脊髓损伤后脊髓超微结构的影响未见报道，此次研究将从亚细胞水平，探讨嗅鞘细胞移植在修复脊髓损伤中的作用和疗效。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

1.1  设计  随机对照动物实验。

1.2  时间及地点  实验于2018年3至9月在西安交通大学口腔医院实验中心完成。

1.3  材料  SPF级成年健康雌性SD大鼠20只，8周龄，体质量(202.68±9. 88)g；另取SD大鼠用于分离培养嗅鞘细胞。实验动物由西安交通大学医学中心实验动物中心提供，动物质量合格证号：陕医动字08005。随机分为3组：空白组4只，DF12培养液组(DF12组)8只，嗅鞘细胞移植组8只。

1.4  实验方法

1.4.1  脊髓损伤模型的建立  除空白组外，其余大鼠均采用脊髓横切法造模。用体积分数3%水合氯醛腹腔麻醉(3 mL/kg)，麻醉满意后固定于操作台上，手术野周围剪毛备皮，碘伏消毒。取以T₁₀为中心的后正中切口，长约3.5 cm，切开皮肤，皮下组织，剥离两侧肌肉，显露T₉、T₁₀、T₁₁椎板，切除T₁₀全椎板及T₉, T₁₁部分椎板；显露硬膜囊，用特制金属针穿带3-0丝线，将丝线置于脊髓腹侧硬膜外。以剃须刀片于预置丝线头侧0.5 mm处将脊髓横断，并从腹侧向背侧提起预置丝线，确保脊髓完全横断，局部应用明胶海绵止血，逐层关闭伤口。空白组大鼠仅仅切除T₁₀全部椎板及T₉，T₁₁部分椎板，未对脊髓作其他处理，局部应用明胶海绵止血，逐层关闭伤口。

1.4.2  嗅鞘细胞的培养，纯化  按参考文献[11]的方法进行嗅鞘细胞的原代培养，纯化，并用Hoechst进行标记。

1.4.3  治疗方法  空白组对脊髓未作处理，局部应用明胶海绵止血，逐层关闭伤口；嗅鞘细胞移植组切断脊髓，进行嗅鞘细胞移植，注射嗅鞘细胞按参考文献[12]的方法进行：在距脊髓横切断端1 mm的平面与后正中线交点处为进针点，应用微量进样器按照1.75，1.25，1和0.5 mm的深度分别注射0.5 μL(约含5×10⁴个细胞)，每侧断端植入2×10⁵个细胞；注射速度0.1 μL/min，每个注射位点注射后留针5 min，局部明胶海绵止血，逐层关闭伤口。DF12组切断脊髓，注射DF12培养液，用同样方法及部位注射0.5 μL无血清的DF12培养液，局部明胶海绵止血，逐层关闭伤口。

1.4.4  术后大鼠的饲养及护理  术后动物，常规挤尿、抗感染及预防压疮。

1.4.5  取材  在脊髓损伤后1，7，28，56 d，麻醉满意后常规经心脏灌注后处死各组动物，取出脊髓，以损伤平面为中心，远近断端分别切取1 mm×1 mm大小组织块4块，放入冷存的2%戊二醛溶液中进行预固定。

1.4.6  电镜标本的制作与观察  按参考文献[12]的方法进行标本制作：样本依次用3%的戊二醛、1%的锇酸固定，常规经脱水浸透、Epon816包埋，用LKB2V型超薄切片机连续切片，每个标本随机切取3张超薄切片，分别裱于400目铜网上，经醋酸铀和硝酸铅染色，从每只大鼠的3个铜网选取2个铜网，在每张切片上分左上、左右和右上、右下及中央5个视野于日产－H600型透射电镜下放大拍照观察。

      脊髓损伤后，微环境的改变表现为局部的组织水肿、结构破坏、神经元坏死、髓鞘碎片的释放以及炎性细胞的浸润、活化和各种细胞因子释放等一系列病理变化^[13]。1978年BALENTINE^[14]对应用电镜对大鼠脊髓损伤后神经细胞的超微结构进行研究，发现损伤后轴突内立即形成小管泡，随后出现神经纤维髓鞘肿胀和破裂，而较晚出现髓鞘囊泡变性和髓内空泡化。BRESNAHAN^[15]报道恒河猴脊髓损伤后脊髓神经细胞的超微结构变化，主要是早期出现髓鞘和轴索肿胀，并且逐渐发展为轴索断裂和崩解，进一步发生板层断裂和崩解；损伤后神经元胞体可见小泡、致密小体和多泡体等异常蓄积，这与此次实验中模型组的神经细胞超微结构病理变化基本一致。

目前认为脊髓损伤后再生困难和治疗疗效差的主要原因是原发性和继发性损伤导致神经元和神经纤维的变性坏死，突触结构消失。通过体外内研究发现，嗅鞘细胞能分泌多种类型的神经营养和支持因子，神经营养因子主要包括神经生长因子、血小板源性生长因子，睫状神经营养因子、神经营养素3、4、神经胶质衍生神经生长因子和脑源性神经生长因子等，支持因子包括细胞外基质和黏附分子FN、LI及纤维连接蛋白等，促进神经元的存活和轴突再生^[16-17]。研究发现脑源性神经生长因子对神经元的发育、生长和修复方面均起重要作用^[18-19]，其能通过促进受损脊髓内神经元的存活从而增强脊髓损伤后神经再生和修复。选择性敲除脑源性神经生长因子或TrkB基因导致前脑背侧神经元萎缩、树突变性和神经元丢失^[20]；而过表达脑源性神经生长因子可以抑制神经元的凋亡并增加神经细胞的数量^[21]。神经营养素3在神经系统中具有促进神经元存活和分化，促进神经纤维芽生和再生，增强突触可塑性，促进突触释放神经递质等作用^[22]；LANNOTTI等^[23]的研究显示，应用神经胶质衍生神经生长因子可以显著减少脊髓损伤的坏死面积，增加脊髓白质部分的存活量，减少轴突髓鞘的破坏。此次研究结果显示，在未接受移植的DF12组中，病变出现不可遏制的持续发展：神经元胞膜皱缩、细胞胞核固缩，核仁消失，线粒体，内质网，溶酶体等细胞器减少，突触前膜、突触后膜紊乱，突触间隙消失和髓鞘首先出现肿胀，最后坏死崩解。植入嗅鞘细胞以后，原本变性的神经细胞，在嗅鞘细胞存在的条件下逐渐恢复染色特性，胞核固缩减轻，核仁出现，发现神经纤维及突触结构；神经细胞部分保留。这与嗅鞘细胞能降解有关轴突抑制再生分子，分泌多种神经营养因子，细胞外基质及黏附分子有关，为脊髓损伤后轴突再生提供良好的微环境相关。

研究发现脊髓损伤后，星形胶质细胞活化增生形成胶质瘢痕是中枢神经轴突再生的最大屏障之一^[24-26]。脊髓损伤后，在损伤中心最初发生的是细胞(星形胶质细胞)死亡，随后在损伤附近出现星形胶质细胞反应，反应性星形胶质细胞可以合成和分泌多种神经营养因子，如神经生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、层粘蛋白及其他细胞外基质成分，具有维持神经元存活和促进轴突再生的作用^[27]；星形胶质细胞呈现增生反应是中枢神经组织的一种自我修复现象，但其过度增生会对轴突再生，再髓鞘化的形成阻碍作用^[28-29]。此次研究发现，脊髓损伤早期出现胶质细胞活化增生现象，在脊髓损伤后立即植入嗅鞘细胞，电镜观察可见比较多的神经纤维，有突触形成，突触结构完整，突触前后膜可见，突触间隙存在、突触前膨大处含有少量突触小泡，胶质瘢痕面积较对照组小。

PEREZ等^[30]研究发现：嗅鞘细胞具有：①控制轴突再生时的生长方向；②嗅鞘细胞形成的“神经胶质桥”可以跨越中枢神经损伤后形成的胶质瘢痕，使轴突沿着轴突生长的方向缓慢延伸。KHANKAN等^[31]将嗅鞘细胞移植入急性胸脊髓完全横断的成年大鼠中，发现嗅鞘细胞可减少脊髓损伤后硫酸软骨素蛋白多糖的表达，清除髓鞘碎片；减轻炎症反应，降低损伤区轴突抑制分子，保护神经元，促进轴突再生。ROMON-CUETO等^[32]将成年原代培养的嗅鞘细胞移植于脊髓全横断后的大鼠，研究发现大量红核脊髓束和上行脊髓固有神经的再生纤维与嗅鞘细胞并行，穿越胶质瘢痕，随后进入对侧的脊髓组织，并在白质、灰质中长距离生长，移植的嗅鞘细胞从注射部位纵向和横向迁移，最远距离约1.5 cm。再生神经纤维穿过白质、灰质和胶质瘢痕，克服脊髓损伤后局部微环境的抑制，为受伤的脊髓轴突提供了合适的环境来进行长距离的延伸。

总之，嗅鞘细胞移植对损伤脊髓的超微结构有一定的影响。嗅鞘细胞可能通过分泌多种神经生长因子及细胞外基质，抑制胶质瘢痕的增生，改善脊髓损伤后局部微环境，促进脊髓损伤后神经元的存活，从而增强脊髓损伤后神经再生和修复。

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文题释义：
嗅鞘细胞：是一种嗅神经的支持细胞，它起源于嗅基底膜，分布在嗅球，嗅神经和嗅中枢。位于中枢和外周神经系统过渡区，具有降解抑制再生分子、分泌不同神经营养因子、促进神经轴突和髓鞘的再生、改善脊髓损伤后的微环境等重要作用。
超微结构：通过透射电子显微镜观察脊髓损伤后损伤部位神经元的细胞膜、细胞器(高尔基复合体，尼氏体，内质网、核糖体、神经微丝、微管)、细胞核(核仁、核周体)；髓鞘，轴突，突触，胶质瘢痕等亚细胞水平的变化。

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研究发现脊髓损伤后，星形胶质细胞活化增生形成胶质瘢痕是中枢神经轴突再生的最大屏障之一。脊髓损伤后，在损伤中心最初发生的是细胞（星形胶质细胞）死亡，随后在损伤附近出现星形胶质细胞反应，反应性星形胶质细胞可以合成和分泌多种神经营养因子，如神经生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、层粘蛋白及其他细胞外基质成分，具有维持神经元存活和促进轴突再生的作用；星形胶质细胞呈现增生反应是中枢神经组织的一种自我修复现象，但其过度增生会对轴突再生，再髓鞘化的形成阻碍作用。

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