釉原蛋白羧基末端肽加速细胞周期促进成釉细胞系ALC细胞增殖

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.1858

中国组织工程研究 ›› 2020, Vol. 24 ›› Issue (1): 99-105.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.1858

釉原蛋白羧基末端肽加速细胞周期促进成釉细胞系ALC细胞增殖

刘敏1，王睿捷1，宋丹阳1，杨随1，谭陶2，王磊1，王衣祥3

北京大学口腔医院，¹修复科，³中心实验室，北京市 100081；²北京大学首钢医学院口腔科，北京市 100144

收稿日期:2019-03-04 修回日期:2019-03-06 接受日期:2019-05-23 出版日期:2020-01-08 发布日期:2019-12-12
通讯作者: 王磊，博士，副主任医师，副教授，北京大学口腔医院修复科，北京市 100081 王衣祥，博士，研究员，副教授，北京大学中心实验室，北京市 100081
作者简介:刘敏，女，1993年生，陕西省汉中市人，汉族，在读硕士，主要从事牙釉质发育相关影响因素研究。
基金资助:
家自然科学基金面上项目(81470770)；北京市自然科学基金(7172240)；北京市自然科学基金(7182181)

The C-terminus of the amelogenin peptide promotes the proliferation of ALC ameloblasts through accelerating cell cycle

Liu Min¹, Wang Ruijie¹, Song Danyang¹, Yang Sui¹, Tan Tao², Wang Lei¹, Wang Yixiang³

¹Department of Prosthodontics, ³Clinical Laboratory, Peking University Hospital of Stomatology, Beijing 100081, China; ²Department of Stomatology, Peking University Shougang Hospital, Beijing 100144, China

Received:2019-03-04 Revised:2019-03-06 Accepted:2019-05-23 Online:2020-01-08 Published:2019-12-12
Contact: Wang Lei, MD, Associate chief physician, Associate professor, Department of Prosthodontics, Peking University Hospital of Stomatology, Beijing 100081, China Wang Yixiang, MD, Researcher, Associate professor, Clinical Laboratory, Peking University Hospital of Stomatology, Beijing 100081, China
About author:Liu Min, Master candidate, Department of Prosthodontics, Peking University Hospital of Stomatology, Beijing 100081, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81470770; the Beijing Natural Science Foundation, No. 7172240 and No. 7182181

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

釉原蛋白羧基末端肽：是由牙齿发育过程中成釉细胞表达的基质金属蛋白酶20水解全长釉原蛋白产生的，其具有调控骨髓间充质干细胞和牙周膜成纤维细胞增殖和分化的作用。

成釉细胞系ALC细胞：ALC细胞系是由Akira Nakata从新生小鼠牙胚中分离培养建立的成釉细胞系，表达成釉细胞特异性基因釉原蛋白、釉丛蛋白、釉蛋白，用于体外研究成釉上皮细胞分化和功能。

背景：釉原蛋白羧基末端肽(C-terminus of the amelogenin peptide，AMG-CP)作为一种小分子内源性短肽，在物种间的序列高度保守，提示其在牙齿发育过程中参与重要的生理过程。有研究表明AMG-CP对成牙骨质细胞、骨髓间充质干细胞、牙周膜成纤维细胞的增殖分化有调控作用，但是AMG-CP对成釉细胞生物学功能的影响尚未见报道。

目的：探究不同质量浓度AMG-CP对成釉细胞系ALC细胞增殖的影响及相关机制。

方法：人工合成并通过液相色谱和质谱检测AMG-CP合成情况。使用xCELLigence RTCA实时细胞分析系统观察0，0.5，1，2 mg/L AMG-CP对ALC细胞增殖的影响。流式细胞仪检测0，1，2 mg/L AMG-CP对ALC细胞周期的影响。Real-time PCR检测0，1，2 mg/L AMG-CP对ALC细胞的细胞周期蛋白Cyclin D1、CDK4、MCM2、MCM5 mRNA表达水平的影响。Western blot检测0，1 mg/L AMG-CP对ALC细胞表达细胞增殖相关通路中p-ERK1/2、total-ERK1/2表达水平的影响。利用MAPK-ERK1/2通路抑制实验，在ERK阻断剂U0126作用下阻断ERK1/2磷酸化，检测AMG-CP对ALC细胞增殖能力的影响。

结果与结论：①与对照组比较，AMG-CP促进ALC细胞增殖，群体倍增时间降低，并存在浓度梯度依赖性；②与对照组比较，AMG-CP具有加速细胞周期的作用；③与对照组比较，AMG-CP可以上调细胞周期相关基因Cyclin D1、CDK4、MCM2、MCM5的表达；④与对照组比较，AMG-CP可以上调p-ERK1/2表达，激活MAPK-ERK1/2信号通路；⑤U0126抑制MAPK-ERK1/2通路激活后，AMG-CP失去对ALC细胞促增殖作用；⑥以上结果证实AMG-CP可以激活MAPK-ERK1/2通路，加速细胞周期，进而促进ALC细胞增殖，提示AMG-CP具有促进成釉细胞增殖的潜能。

ORCID: 0000-0003-4338-4123(刘敏)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 釉原蛋白羧基末端肽, 釉原蛋白, 成釉细胞, 细胞增殖, 细胞周期, MAPK-ERK信号通路, 牙釉质发育

Abstract:

BACKGROUND: C-terminus of the amelogenin peptide (AMG-CP) is a small molecular endogenous peptide that is highly conserved among species. It is involved in important physiological processes during tooth development. Some studies have shown that AMG-CP can regulate the proliferation and differentiation of cementoblasts, bone marrow mesenchymal stem cells and periodontal ligament fibroblasts, but the biological function of AMG-CP on ameloblasts has not been elucidated.

OBJECTIVE: To investigate the effects of different concentrations of AMG-CP on the proliferation of ALC ameloblasts and its underlying mechanisms.

METHODS: AMG-CP was successfully synthesized and determinated by liquid chromatography and mass spectrometry. The effects of AMG-CP at 0, 0.5, 1, 2 mg/L on the proliferation of ALC ameloblasts were observed by xCELLigence RTCA cell analysis system in real time. The effect of AMG-CP at 0, 1, 2 mg/L on cell cycle of ALC was detected by flow cytometry. Real-time PCR was used to detect the expression of cyclin D1, CDK4, MCM2, MCM5 mRNA in ALC cells treated with AMG-CP at 0, 1, 2 mg/L. Western blot was carried out to evaluate the effect of AGM-CP at 0, 1 mg/L on MAPK-ERK1/2 pathway by detecting the expression of phosphorylated ERK1/2 and total ERK1/2 in ALC cells. Pathway blockade assay was performed by using ERK1/2 blocker U0126 to pretreat ALC cells. Then cell proliferation ability as well as phosphorylated ERK1/2 expression was analyzed by xCELLigence RTCA cell analysis system and western blot.

RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, AMG-CP promoted the proliferation of ALC cells, and decreased the population doubling time in a dose-depending manner. Flow cytometry detected the acceleration of cell cycle after treatment with AMG-CP. The results of Real-time PCR showed that AMG-CP upregulated cell cycle-related genes (cyclin D1, CDK4, MCM2, MCM5) expression. Western blot results showed that AMG-CP could upregulate the expression of phosphorylated ERK1/2 and activate MAPK-ERK1/2 signaling pathway in ALC cells. After U0126 was used to inhibit the MAPK-ERK1/2 pathway, the ability of AMG-CP promoting ALC proliferation was inhibited. These results suggest that AMG-CP has a potential to activate MAPK-ERK1/2 pathway, accelerate the process of cell cycle, and then promote the proliferation of ALC cells, all of which indicate that AMG-CP has the potential to promote the proliferation of ameloblasts.

Key words: C-terminus of the amelogenin peptide, amelogenin, ameloblast, cell proliferation, cell cycle, MAPK-ERK signaling pathway, enamel development, National Natural Science Foundation of China

中图分类号:

刘敏, 王睿捷, 宋丹阳, 杨随, 谭陶, 王磊, 王衣祥. 釉原蛋白羧基末端肽加速细胞周期促进成釉细胞系ALC细胞增殖[J]. 中国组织工程研究, 2020, 24(1): 99-105.

Liu Min, Wang Ruijie, Song Danyang, Yang Sui, Tan Tao, Wang Lei, Wang Yixiang. The C-terminus of the amelogenin peptide promotes the proliferation of ALC ameloblasts through accelerating cell cycle[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2020, 24(1): 99-105.

图/表（结果） 13

2.1 人工合成AMG-CP鉴定液相色谱对合成产物进行分选得到目的产物。质谱分析得到相对分子质量为1 347.64的目的多肽Ac-STDKTKREEVD-NH2，见表2和图1，2。

2.2 AMG-CP对ALC细胞增殖的影响 2.2.1 AMG-CP作用于ALC细胞的增殖曲线及细胞倍增时间与对照组相比，0.5，1，2 mg/L AMG-CP实验组标准化细胞指数增大，并且随着AMG-CP质量浓度的增加，标准化细胞指数增加越明显。各组之间差异有显著性意义(P ≤ 0.05)，见图3。细胞增殖倍增时间呈浓度梯度下降趋势，各组差异有显著性意义(P ≤ 0.05)，然而0.5， 1 mg/L组的细胞倍增时间在数值上接近，其生物学意义不大，见图4。

2.2.2 EdU染色检测AMG-CP对ALC细胞增殖的影响 AMG-CP作用20 h后，随着AMG-CP的质量浓度增加，明亮的绿色荧光逐渐增强，见图5。12 h及16 h的荧光标记结果类似，20 h最为显著，因此作为结果展示。使用ImageJ软件对EdU染色结果做半定量分析，结果显示2 mg/L AMG-CP作用12，16，20 h都有促进细胞增殖的作用，差异有显著性意义(P ≤0.05)。1 mg/L AMG-CP作用12， 16 h促进细胞增殖的作用与对照组相比差异无显著性意义，在作用20 h后与对照组相比能促进细胞增殖，差异有显著性意义，见图6。

2.3 AMG-CP 对ALC细胞周期的影响 2.3.1 流式细胞仪检测处于不同细胞周期的ALC细胞百分比 0，1，2 mg/L AMG-CP作用12 h后，处于G₁期的细胞比例降低，且随质量浓度的增加而降低；处于S期的细胞比例上升，且随质量浓度的增加而增加，与对照组相比差异有显著性意义(P ≤ 0.05)。实验组和对照组G₁/G₂细胞比例差异无显著性意义，见表3，图7。

2.3.2 AMG-CP作用下ALC细胞周期蛋白CyclinD1、CDK4、MCM2、MCM5 mRNA的表达 1，2 mg/L AMG-CP作用4 h后，CyclinD1、CDK4、MCM2、MCM5 mRNA的表达均较对照组(0 mg/L)有显著增高，差异有显著性意义(P ≤ 0.05)，但1 mg/L与2 mg/L组之间差异无显著性意义，见图8。

2.4 AMG-CP作用下ALC细胞MAPK-ERK1/2信号通路中p-ERK1/2、total-ERK1/2的表达 1 mg/L AMG-CP激活ALC细胞中ERK1/2磷酸化(P ≤ 0.05)，对total-ERK1/2蛋白没有影响，见图9。

2.5 AMG-CP对ALC细胞中p-ERK1/2表达作用被阻断剂U0126阻断 2.5.1 U0126阻断细胞MAPK-ERK1/2信号通路后，AMG-CP对ALC细胞增殖的实时动态检测结果 MAPK抑制剂U0126处理后细胞增殖受抑制，作用20 h后生长曲线出现转折点，细胞数量下降。当50 μmol/L U0126抑制剂与1 mg/L AMG-CP同时作用时，细胞增殖的总体趋势是抑制的，在细胞数量增加阶段，50 μmol/L U0126抑制剂+1 mg/L AMG-CP组与50 μmol/L U0126抑制剂组比较差异无显著性意义，在细胞数量下降阶段，50 μmol/L U0126抑制剂+ 1 mg/L AMG-CP组与50 μmol/L U0126抑制剂组比较差异有显著性意义(P ≤ 0.05)，见图10。

2.5.2 U0126阻断细胞MAPK-ERK1/2信号通路后，AMG-CP对ALC细胞中p-ERK1/2、total-ERK1/2表达的影响通过ERK抑制剂U0126阻断MAPK-ERK信号通路情况下，ALC细胞磷酸化ERK1/2的表达难以检测出来，对total-ERK1/2蛋白没有影响，这与细胞增殖实验结果相符合，见图11。AMG-CP可以通过激活MAPK-ERK信号通路，使ERK1/2磷酸化，从而促进ALC细胞增殖。

参考文献

[1] MORADIAN-OLDAK J. Amelogenins: assembly, processing and control of crystal morphology. Matrix Biol. 2001;20(5-6): 293-305.
[2] BARTLETT JD, SIMMER JP. Proteinases in developing dental enamel. Crit Rev Oral Biol Med. 1999;10(4):425-441.
[3] ZHU L, TANIMOTO K, ROBINSIN S, et al. Comparative properties of recombinant human and bovine matrix metalloproteinase-20. Arch Oral Biol. 2008;53(8):785-790.
[4] VEIS A. Amelogenin gene splice products: potential signaling molecules. Cell Mol Life Sci. 2003;60(1):38-55.
[5] HAMMARSTRÖM L, HEIJL L, GESTRELIUS S. Periodontal regeneration in a buccal dehiscence model in monkeys after application of enamel matrix proteins. J Clin Periodontol. 1997;24(9 Pt 2):669-677.
[6] YOSHIMI Y, KUNIMATSU R, HIROSE N, et al. Effects of C-Terminal Amelogenin Peptide on Proliferation of Human Cementoblast Lineage Cells. J Periodontol. 2016;87(7):820-827.
[7] KUNIMATSU R, AWADA T, YOSHIMI Y, et al. The C-terminus of the amelogenin peptide influences the proliferation of human bone marrow mesenchymal stem cells. J Periodontol. 2018;89(4):496-505.
[8] ESPOSITO M, COULTHARD P, THOMSEN P, et al. Enamel matrix derivative for periodontal tissue regeneration in treatment of intrabony defects: a Cochrane systematic review. J Dent Educ. 2004;68(8): 834-844.
[9] BRETT PM, PARKAR M, OLSEN I, et al. Expression profiling of periodontal ligament cells stimulated with enamel matrix proteins in vitro: a model for tissue regeneration. J Dent Res. 2002;81(11): 776-783.
[10] GRAZIANI F, GENNAI S, PETRINI M, et al. Enamel matrix derivative stabilizes blood clot and improves clinical healing in deep pockets after flapless periodontal therapy: A Randomized Clinical Trial. J Clin Periodontol. 2019;46(2):231-240.
[11] HAMAMOTO Y, KAWASAKI N, JARNBRING F, et al. Effects and distribution of the enamel matrix derivative Emdogain in the periodontal tissues of rat molars transplanted to the abdominal wall. Dent Traumatol. 2002;18(1):12-23.
[12] KUNIMATSU R, TANIMOTO K, TANNE Y, et al. Amelogenin enhances the proliferation of cementoblast lineage cells. J Periodontol. 2011;82(11): 1632-1638.
[13] HUANG YC, TANIMOTO K, TANNE Y, et al. Effects of human full-length amelogenin on the proliferation of human mesenchymal stem cells derived from bone marrow. Cell Tissue Res. 2010;342(2): 205-212.
[14] TANIMOTO K, KUNIMATSU R, TANNE Y, et al. Differential effects of amelogenin on mineralization of cementoblasts and periodontal ligament cells. J Periodontol. 2012;83(5):672-679.
[15] ZOU Y, WANG H, SHAPIRO JL, et al. Determination of protein regions responsible for interactions of amelogenin with CD63 and LAMP1. Biochem J. 2007;408(3):347-354.
[16] YAN G, DU Q, WEI X, et al. Application of Real-Time Cell Electronic Analysis System in Modern Pharmaceutical Evaluation and Analysis. Molecules. 2018;23(12): E3280.
[17] ZHU C, YU J, PAN Q, et al. Hypoxia-inducible factor-2 alpha promotes the proliferation of human placenta-derived mesenchymal stem cells through the MAPK/ERK signaling pathway. Sci Rep. 2016;6:35489.
[18] RYU OH, FINCHAM AG, HU CC, et al. Characterization of recombinant pig enamelysin activity and cleavage of recombinant pig and mouse amelogenins. J Dent Res. 1999;78(3):743-750.
[19] BOABAID F, GIBSON CW, KUEHL MA, et al. Leucine-rich amelogenin peptide: a candidate signaling molecule during cementogenesis. J Periodontol. 2004;75(8):1126-1136.
[20] HATAKEYAMA J, PHILP D, HATAKEYAMA Y, et al. Amelogenin- mediated regulation of osteoclastogenesis, and periodontal cell proliferation and migration. J Dent Res. 2006;85(2):144-149.
[21] LI X, SHU R, LIU D, et al. Different effects of 25-kDa amelogenin on the proliferation, attachment and migration of various periodontal cells. Biochem Biophys Res Commun. 2010;394(3):581-586.
[22] AMIN HD, OLSEN I, KNOWLES JC, et al. Differential effect of amelogenin peptides on osteogenic differentiation in vitro: identification of possible new drugs for bone repair and regeneration. Tissue Eng Part A. 2012;18(11-12):1193-1202.

引言

材料方法

1.1 设计细胞学实验。

1.2 时间及地点 2018年7月至2019年2月在北京大学口腔医院中心实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 AMG-CP的合成序列及检测报告 AMG-CP的合成序列为Ac-STDKTKREEVD-NH2(相对分子质量为 1 347.64)，委托北京赛百盛生物科技有限公司合成。合成的AMG-CP进行了液相色谱-质谱(HPLC-MS)分析。无菌去离子水溶解多肽冻干粉，按实验所需浓度稀释分装。

1.3.2 实验细胞小鼠成釉细胞系ALC细胞(ameloblast- lineage cells，ALC)由滨州医学院高玉光教授馈赠。

1.3.3 实验试剂及仪器 DMEM/F12培养基(Hyclone，美国)；胰蛋白酶(Gbico，美国)；胎牛血清(AWB，乌拉圭)；青霉素/链霉素(Gbico，美国)；BAC试剂盒(康为世纪，北京)；U0126(Selleck，上海)；兔源p-ERK1/2单克隆抗体，total-ERK1/2单克隆抗体和兔源GAPDH多克隆抗体(Cell Signaling Technology，美国)；二氧化碳恒温培养箱(Thremo，美国)；医用净化工作台(Thremo，美国)；纯水系统(Millipore，美国)；xCELLigence RTCA细胞分析系统检测系统(ACEA Biosciences，美国)；E-Plate L8电极板(ACEA Biosciences，美国)；Odyssey双色红外荧光成像系统(Licor，美国)；Nanodrop 2000(Thermo Fisher，美国)；QuantStudio^® 3实时荧光定量PCR仪器(Thremo，美国)；荧光倒置显微镜(Leica，德国)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞系培养小鼠成釉细胞系ALC细胞用含体积分数为10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L链霉素的DMEM/F12培养液，在37 ℃、体积分数为5%CO₂、100%湿度条件下培养。细胞汇合至80%时传代，取处于对数生长期的细胞用于后续实验。

1.4.2 实时定量检测细胞增殖曲线将ALC细胞按2×10³/孔的密度接种于E-Plate L8电极板中，每孔200 μL，第2天加入终质量浓度为0，0.5，1，2 mg/L AMG-CP^[9]，连续6 d用xCELLigence RTCA细胞分析系统实时定量分析AMG-CP对成釉细胞增殖的影响，绘制细胞生长曲线，计算细胞倍增时间。

1.4.3 EdU检测细胞增殖取对数生长期的ALC细胞制备单细胞悬液，将直径为15 mm的无菌圆形玻片加入6孔板内，将细胞以2×10⁵/孔的密度接种于6孔板内(设置3个复孔)，每孔2 mL，孵育24 h；PBS冲洗1次，更换为无血清培养基继续培养48 h以同步化细胞至G₀期，再换为正常含血清培养基，并按分组加入质量浓度为0，1，2 mg/L的AMG-CP处理细胞12，16，20 h；然后按照BeyoCilck^TMEdU-488细胞增殖检测试剂盒使用说明书，对细胞进行EdU-488标记染色，荧光显微镜下观察，每组随机选择3个视野拍照，采用ImageJ半定量分析增殖细胞比例。

1.4.4 流式细胞仪检测细胞周期将细胞以2×10⁵/孔接种于6孔板内(设置3个复孔)，每孔2 mL，孵育24 h；PBS冲洗1次，更换为无血清培养基继续培养48 h以同步化细胞至G₀期，再换为正常含血清培养基，加入终质量浓度为0，1，2 mg/L的AMG-CP处理细胞12 h，0.25%胰蛋白酶消化收集细胞，1 000 r/min离心5 min；体积分数为95%乙醇固定1 h；PBS洗2次，用含0.1%Triton-X-100及50 mg/L RNaseA的PBS处理细胞30 min；离心，弃去PBS；加入适量PBS(0.5-1.0 mL)重悬细胞，300目细胞筛过滤；加入碘化丙啶染色，用流式细胞仪检测，记录细胞周期变化。

1.4.5 Real-time PCR检测细胞周期蛋白CyclinD1、CDK4、MCM2、MCM5 mRNA的表达将细胞以2×10⁵/孔接种于6孔板内(设置3个复孔)，每孔2 mL，孵育24 h；PBS冲洗1次，更换为无血清培养基继续培养48 h以同步化细胞至G₀期，再换为正常含血清培养基，并加入终质量浓度为0，1，2 mg/L的AMG-CP作用4 h；Trizol提取细胞总RNA，采用Nanodrop 2000测量吸光度A₂₆₀/A₂₈₀，检测RNA样本浓度和纯度，取2 μg总RNA反转录合成cDNA，加入PCR仪中扩增。结果采用实时荧光定量PCR分析程序分析，计算目的基因相对值=2^-∆∆Ct。引物序列见表1。

1.4.6 MAPK-ERK1/2通路抑制剂U0126处理后AMG-CP作用下实时定量检测细胞增殖曲线取对数生长期的ALC细胞，按2×10³/孔的密度接种于E-Plate L8电极板中，每孔200 μL，孵育24 h，加入50 μmol/L MAPK-ERK1/2通路抑制剂U0126预处理细胞1 h，随后用含1 mg/L AMG-CP的培养液培养3 d，利用xCELLigence RTCA细胞分析系统检实时定量检测ALC细胞增殖，至抑制组细胞死亡时停止检测，绘制细胞增殖曲线。

1.4.7 MAPK-ERK1/2通路抑制剂U0126处理后AMG-CP作用下Western blot 检测p-ERK1/2、total-ERK1/2的表达取对数生长期的ALC细胞，以2×10⁵/孔接种于6孔板内，每孔2 mL，孵育24 h，PBS冲洗1次，更换为无血清培养基同步化48 h，更换为正常培养基，并加入50 μmol/L U0126预处理细胞1 h；随后用含1 mg/L AMG-CP的培养液培养细胞1 h，采用Western blot检测p-ERK1/2、total-ERK1/2和GAPDH的表达。细胞用PBS洗3次，加入含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解细胞，收集蛋白样品，BAC试剂盒测定蛋白浓度，取30 μg蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过转膜系统转移至PVDF膜上，用封闭液在室温下振荡孵育1 h，按照1∶1 500浓度依次孵育抗total-ERK1/2抗体、抗p-ERK1/2抗体，缓冲液洗涤膜3次，室温孵育荧光二抗，Odyssey双色红外荧光成像系统检测结果。

1.5 主要观察指标 ①在不同质量浓度AMG-CP作用下ALC细胞增殖曲线及细胞倍增时间；②在不同质量浓度AMG-CP作用下EdU荧光染色半定量分析增殖细胞比例；③在不同质量浓度AMG-CP作用下不同细胞周期的ALC细胞数百分比；④在不同质量浓度AMG-CP作用下细胞周期相关蛋白CyclinD1、CDK2、MCM2、MCM5 mRNA的表达水平；⑤MAPK-ERK1/2信号通路阻断后的ALC细胞增殖曲线；⑥MAPK-ERK1/2信号通路阻断后ALC细胞的p-ERK1/2、total-ERK1/2表达水平。

1.6 统计学分析相同实验每组重复3次，采用SPSS 20.0软件进行统计分析，数据统计图采用Graphpad Prim7进行绘图，进行方差分析(ANOVA)和Tukey多重比较检验。计量资料以x(_)±s表示，P ≤ 0.05为差异有显著性意义。

讨论

早期研究发现牙釉质基质衍生物能够促进牙周纤维、根面牙骨质、牙槽骨再生。研究者在探索牙釉质基质衍生物作用机制的过程中，逐步明确其主要成分是釉原蛋白(约占95%)，并对于多种细胞的增殖分化具有促进作用^[10-14]。AMG-CP可以作用于人骨髓间充质干细胞上的釉原蛋白受体，激活MAPK-ERK信号通路，促进骨髓间充质干细胞增殖^[7，15]。釉原蛋白来源于成釉细胞，但是AMG-CP对于成釉细胞的作用如何尚未见报道。该研究通过采用xCELLigence RTCA细胞分析系统检测AMG-CP作用于成釉细胞系ALC细胞的增殖曲线^[16]，研究结果表明AMG-CP对成釉细胞系的增殖具有促进作用，并且具有浓度梯度依赖性。该实验结果和AMG-CP作用于人成牙骨质细胞^[6]、骨髓间充质干细胞的增殖效应一致^[7]。AMG-CP促进细胞增殖，细胞群体倍增时间降低，本质上是细胞有丝分裂周期加速。EdU染色增加意味着DNA的合成增加，AMG-CP促进了这一过程。流式细胞术检测在不同质量浓度AMG-CP作用下细胞周期的变化，结果表明AMG-CP作用12 h后，处于G₁期的细胞比例降低，且随质量浓度的增加而降低；处于S期的细胞比例上升，且随质量浓度的增加而增加，与对照组相比差异有显著性意义 (P ≤ 0.05)，与EdU染色结果一致，说明AMG-CP促进ALC细胞从G₁期向S期转化。Cyclin D1、CDK2在G₁期向S期转化的阶段发挥作用，MCM2、MCM5是合成期染色体复制关键启动子。Real-time PCR检测AMG-CP作用ALC细胞后Cyclin D1、CDK4、MCM2、MCM5 mRNA表达上升。实验结果说明AMG-CP促进ALC细胞G₁/S期的转化，同时促进S期细胞合成。 MAPK-ERK信号通路是多数生长因子、细胞因子调控靶点细胞增殖的重要途径。已有研究表明ERK是介导CyclinD1与CyclinE表达所必需的重要通道，CyclinD1的转录依赖于ERK1/2的持续激活和核内的阻滞^[17]。CyclinD1和CKD4形成活化的激酶复合物，可激活相关基因的表达，使细胞周期由G₁期向S期转变。已有研究表明AMG-CP是通过激活ERK通路对于成牙骨质细胞、骨髓间充质干细胞发挥增殖作用^[7]。Western blot检测发现，AMG-CP能够促进MAKP-ERK1/2、p-ERK1/2表达量升高。ERK1/2信号通路抑制剂阻断MAKP-ERK1/2后，即使在AMG-CP作用下，细胞增殖也受到了抑制，ERK1/2的磷酸化也无法激活。由此可知AMG-CP也是通过激活ERK1/2信号通路促进ALC细胞增殖。基质金属蛋白酶20将釉原蛋白从C末端的S163-P164之间水解，产生23 kD的肽片段及釉原蛋白C末端11个氨基酸组成的小肽片段^[3，18]。全长釉原蛋白的C末端在物种间是高度保守的序列^[19-21]，近年多项研究逐渐探究表明釉原蛋白C末端表现出一些可代表全长釉原蛋白的信号功能。有研究者发现，富含亮氨酸的釉原蛋白LRAP的C末端与全长釉原蛋白C末端相同，LRAP及其C末端肽对成骨具有促进作用^[22]。因此提示釉原蛋白的C末端对成骨矿化具有调控作用。通过比较重组人全长釉原蛋白(rh174)、不含AMG-CP的釉原蛋白片段(rh163)、不含N-末端的釉原蛋白片段(rh128)、AMG-CP，发现rh174、rh128、AMG-CP能够通过MAPK-ERK1/2信号通路促进人成牙骨质细胞增殖，因此推测AMG-CP可能是釉原蛋白调控细胞增殖的主要活性位点^[6]。该研究也证明了AMG-CP可以作用于成釉细胞ALC细胞增殖，并且也是通过激活MAPK-ERK1/2信号通路实现的。此外，釉原蛋白的C末端肽对促进细胞矿化的作用在不同细胞中表现不一样。rh174、rh128、AMG-CP能够影响成牙骨质细胞的矿化功能，上调碱性磷酸酶活性，增加矿化结节形成。AMG-CP能够促进MC3T3-E1细胞增殖，不能改变ALP和BSP基因水平和蛋白水平的表达，不能促进其体外矿化形成。因此，釉原蛋白调控多种细胞增殖分化的功能性位点位于其C末端。在成釉细胞中的矿化表现还需进一步探索。基于该研究结果可以认为：AMG-CP对成釉细胞系ALC细胞的增殖有促进作用。结合以往研究中AMG-CP对于组织工程学种子细胞(如骨髓间充质干细胞、牙周膜成纤维细胞、成牙骨细胞等)具有相应的生物学效应。因此，AMG-CP可能对探索其作为生物活性分子用于促进牙釉质形成的组织工程研究具有潜在应用价值。

釉原蛋白羧基末端肽加速细胞周期促进成釉细胞系ALC细胞增殖

The C-terminus of the amelogenin peptide promotes the proliferation of ALC ameloblasts through accelerating cell cycle

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[1]	李偲, 赵婷, 谭戈, 郑雨林, 张若男, 吴艳, 唐俊明. 血小板源生长因子BB可促进骨骼肌成肌细胞增殖、分化与迁移[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1050-1055.
[2]	刘聪, 刘肃. miR-17-5p调控低氧诱导因子1α介导脂肪细胞分化及血管生成的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(7): 1069-1074.
[3]	蒋欣, 乔良伟, 孙东, 李明, 房军, 曲青山. 肾移植患者血清中长链非编码RNA PGM5-AS1表达及调控人肾小球内皮细胞的作用[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 741-745.
[4]	马泽涛, 曾晖, 王德利, 翁鉴, 冯松. 微小RNA-138-5p与软骨细胞增殖和自噬的关系[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(5): 674-678.
[5]	王玉姣, 刘丹, 孙嵩, 孙勇. 改良型富血小板纤维蛋白复合双相磷酸钙可促进兔骨髓间充质干细胞的活性[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 504-509.
[6]	周继辉, 姚猛, 王岩松, 李新志, 周游, 黄卫, 陈文瑶. 新型纳米支架对神经干细胞生物行为及相关基因表达的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(4): 532-536.
[7]	陈扬, 黄邓高, 高元慧, 王顺兰, 曹卉, 郑琳麟, 何浩伟, 罗思琴, 肖敬川, 张应爱, 张淑芳. 低强度脉冲场超声促进人脂肪间充质干细胞的增殖和黏附[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(25): 3949-3955.
[8]	周武, 王彬娉, 王雅雯, 程亚楠, 黄谢山. 转化生长因子β和骨形成蛋白2联合诱导小鼠成骨细胞系MC3T3-E1细胞的增殖与分化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(23): 3630-3635.
[9]	余成帅, 杜刚, 庞慎宁, 劳山. 促炎脂肪因子Chemerin促进一氧化氮表达调节软骨细胞的增殖与代谢[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(2): 258-263.
[10]	戴雅玲, 陈乐文, 何肖君, 林华伟, 贾微微, 陈立典, 陶静, 柳维林. miR-146b过表达慢病毒载体构建及对海马神经干细胞增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(19): 3024-3030.
[11]	艾力麦尔旦•艾尼瓦尔, 王玲, 古丽, 迪丽达尔•塔西甫拉提, 王珊, 尹宏斌. 转化生长因子β3对成骨细胞增殖和成骨能力的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(17): 2664-2669.
[12]	王任先, 曹晶晶, 王宏刚, 万奔, 刘巍峰. 几种分散剂对纳米羟基磷灰石团聚、细胞内分布和细胞增殖的影响[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(16): 2500-2505.
[13]	姜涛, 吴硕, 李志强, 寿玺, 马依热·努尔买卖提, 马创, 魏琴. 血小板衍生生长因子BB促进SD大鼠骨髓间充质干细胞的增殖[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 1976-1981.
[14]	颜南, 司晓凤, 曾亮, 田伟, 单广东, 熊礼硕, 杨炜杰, 王正东. 神经生长因子干预大鼠骨骼肌卫星细胞增殖及α-肌动蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2030-2035.
[15]	王惠丽, 陈志江, 吴炳义. 神经胶质成熟因子γ抑制人结直肠癌LoVo细胞增殖并影响人脐静脉内皮细胞的骨架运动[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(13): 2055-2059.