1.1 设计 体外观察性实验。
1.2 时间及地点 实验于2016年8月至2017年12月在解放军总医院骨科研究所完成。
1.3 材料 乙二醇壳聚糖购自Wako,货号072-01581;双醛功能化聚乙二醇由课题组自主研发合成;Cell Counting Kit-8试剂盒购自Dojindo公司,货号CK04;LIVE/DEAD染色剂购自invitrogen公司,货号L3224;普通液体培养基购自北京拜尔迪生物技术有限公司,货号10-013-CVR;胎牛血清购自北京元亨圣马生物技术研究所;MTT试剂购自北京索莱宝科技有限公司,货号M1020。
实验动物:选取SPF级3 d龄健康SD乳鼠3只,雌雄不拘,购自解放军军事医学科学院,许可证号:SCXK(军) 2012-0004。
1.4 实验方法
1.4.1 GCS/DF-PEG水凝胶的制备 准确称取一定量的乙二醇壳聚糖粉末,溶解在去离子水中,搅匀使其充分溶解,调配成质量分数为1.5%,经0.22 μL滤网过滤得到无菌溶液;准确称取一定量的双醛功能化聚乙二醇粉末,溶解在去离子水中,搅匀使其充分溶解,经0.22 μL滤网过滤得到无菌二苯甲醛聚乙二醇溶液。取一定量体积的乙二醇壳聚糖溶液与等体积无菌双醛功能化聚乙二醇溶液充分混合,于96孔板内塑形,可得到GCS/DF-PEG水凝胶[13]。
1.4.2 电镜检测GCS/DF-PEG水凝胶的孔隙性 将上述所制备的水凝胶样品经真空冷冻干燥机脱水24 h,取横截面,将样品切成0.5-1.0 mm薄片。将薄片放置在真空室中,均匀地涂覆一层薄的金,然后将薄片装入场发射扫描电子显微镜进行形貌成像[11]。
1.4.3 不同质量分数双醛功能化聚乙二醇交联的GCS/ DF-PEG水凝胶体外降解实验 依照上述方法配制出质量分数为1.5%的乙二醇壳聚糖溶液,3组质量分数为2%,4%,8%的双醛功能化聚乙二醇溶液,将80 μL乙二醇壳聚糖溶液分别与3组双醛功能化聚乙二醇溶液等体积混合,获得3组不同质量分数双醛功能化聚乙二醇交联的GCS/ DF-PEG水凝胶,每组水凝胶按照相同规格制备21块,将其浸入pH值为7.4的PBS内,移入37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱内,观察4周,每组分别在时间点取出3块,用吸水纸吸干胶块表面水珠,分析天平称质量,将第1天作为降解前质量,第3,5,7,14,21,28天作为降解后质量,应用如下公式计算各组水凝胶的降解率:降解率=(降解前质量-降解后质量)/降解前质量×100%[14]。
1.4.4 不同双醛功能化聚乙二醇交联GCS/DF-PEG水凝胶弹性模量的检测 将质量分数为1.5%的乙二醇壳聚糖溶液分别与质量分数为2%,4%,8%的双醛功能化聚乙二醇溶液等体积混合,塑形为圆柱形水凝胶块,每组3块,之后将每组水凝胶块平放于力学机测量台,调节测量头使其与胶块紧密接触,之后以0.01 mm/s,缓慢下压胶块,下压距离为较快总高度的20%,全程实时采集压力数值,分析数据,绘制圧力曲线图,并计算其弹性模量[15]。
1.4.5 ADSCs的分离培养及鉴定
ADSCs的分离培养:取SD乳鼠,脱颈处死后置于体积分数75%乙醇中10-15 min,剪取双侧腹股沟区皮下脂肪组织,剔除组织中可见的血管,PBS清洗两三遍,将组织移至无菌青霉素小瓶,剪碎成糊状,加入0.1%Ⅱ型胶原酶,磁珠搅拌消化,30 min后,加入含体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM终止消化,使用100目滤网过滤去除未消化完全的较大组织块,1 700 r/min 离心5 min,弃去上清液,以含体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM培养液重悬细胞,吹打均匀,移入培养瓶,放入37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内孵化培养;24 h后进行初次更换培养液,然后隔天更换培养液,待细胞长满瓶底80%-90%时,弃去培养液,按照1∶3进行传代培养[16]。
ADSCs的流式鉴定:通过文献选择CD29、CD34、CD44、CD45作为流式鉴定指标[17]。首先将P2代ADSCs制成5×108 L-1的细胞悬液,分别对应标记CD29、CD34、CD44、CD45相应抗体,经清洗、离心、重悬后,立即使用流式检定仪进行检测分析鉴定。
1.4.6 GCS/DF-PEG水凝胶的细胞毒性检测 采用MTT法评价GCS/DF-PEG水凝胶的细胞毒性,将GCS/DF-PEG水凝胶块(含质量分数4%双醛功能化聚乙二醇)按照表面积1.25 cm2/mL浸泡入含体积分数10%胎牛血清的DMEM内,放入37 ℃、体积分数5% CO2培养内静置24 h,获得GCS/ DF-PEG水凝胶浸提液。
将P2代ADSCs制成细胞悬液,细胞浓度为5×107 L-1,按每孔5 000细胞加入到96孔板,将96孔板转移到37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内静置24 h,使细胞贴壁,吸出孔内培养基,实验组每孔加入300 μL GCS/DF-PEG水凝胶浸提液,空白组每孔加入含体积分数10%胎牛血清的低糖DMEM培养液。设置第1,3,5,7天作为观察时间点,每个时间点下设置3个复孔。时间节点时,将相应孔内浸提 液/培养基吸出,每孔加入20 μL MTT液,37 ℃温箱内孵育4 h,每孔加入150 μL DMSO,摇匀后迅速于酶标仪上检测492 nm波长处每孔吸光度,记录、分析并制作柱状图。
1.4.7 ADSCs在GCS/DF-PEG水凝胶内的存活状态检测 采用死活染色法评价ADSCs在GCS/DF-PEG水凝胶内的存活状态,首先用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液配制出质量分数3%的乙二醇壳聚糖无菌溶液和质量分数4%的双醛功能化聚乙二醇无菌溶液,将质量分数3%的乙二醇壳聚糖无菌溶液与浓度为10×109 L-1的P2代ADSCs悬液等体积混合,将混合后的细胞悬液与等体积质量分数4%的双醛功能化聚乙二醇无菌溶液混合,移入聚焦小皿,静置使其完全成胶后,向共聚焦小皿内加入适量培养基,放入37 ℃、体积分数5%CO2温箱内培养,于第1,5 天对样品进行LIVE/DEAD染色剂染色,迅速移至激光共聚焦显微镜下观察拍照。
1.4.8 ADSCs在GCS/DF-PEG水凝胶内的增殖检测 采用CCK-8细胞计数试剂盒评价ADSCs在不同质量分数双醛功能化聚乙二醇交联GCS/DF-PEG水凝胶内的增殖情况。将质量分数3%的乙二醇壳聚糖无菌溶液与ADSCs悬液混合,取80 μL混合后的细胞悬液分别与质量分数为2%,4%,8%的双醛功能化聚乙二醇溶液等体积混合,搅拌均匀,在96孔板内凝胶塑形,充分成胶后,每孔加入150 μL含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基,37 ℃、体积分数5%CO2培养箱内培养。同样方法,将80 μL无细胞质量分数1.5%的乙二醇壳聚糖溶液分别与质量分数2%,4%,8%的双醛功能化聚乙二醇溶液混合,分别作为上述3个实验组的对照。设置第1,3,5,7天作为实验观察点,每组每个时间点下设置3个复孔。在每个时间节点时,弃去相应孔内培养基,每孔加入CCK-8液150 μL,放入37 ℃ 培养箱内孵育4 h,将孔内CCK-8液对应转移至另一96孔板内,避光操作,迅速于酶标仪上检测在450 nm波长处每孔吸光度,记录、分析并作出柱状图[18]。
1.5 主要观察指标 可注射性GCS/DF-PEG水凝胶的物理学性质及与ADSCs的细胞相容性。
1.6 统计学分析 采用SPSS 7.0软件对实验数据进行统计学分析,所有数据以
x±
s格式记录,组间比较用单因素方差分析,实验中以
P < 0.05作为差异有显著性意义的标准。