多种保健食品和中草药富含白杨素，提示具有肝癌防治作用。课题组曾证实富含白杨素的杨属植物芽鳞提取物对包括肝癌细胞在内的多种癌细胞有很强的抗增殖作用，却并不抑制正常人胎肝L02细胞的体外增殖，表明其对癌细胞有较好的选择性，优于传统化疗药顺铂
[3-4]。本实验进一步表明白杨素对人肝癌BEL-7402细胞有显著抗增殖作用。白杨素对正常L02细胞的增殖亦无显著影响
[4]。
实验首次报道了白杨素对BEL-7402细胞表面超微结构有显著影响，导致微绒毛样突起大幅度增加。课题组曾报道加杨芽鳞提取物处理的BEL-7402细胞也出现大量微绒毛样突起[4]，这应与杨树花芽或叶芽分泌物富含白杨素有关。白杨素高度亲脂，可直接插入脂质双分子层，改变生物膜的物理和生物学性质，如影响脂筏的状态，改变通道蛋白、受体和载体泵的功能，阻断多药耐药蛋白泵出抗癌药柔红霉素等[29,31-32]。故此推测细胞表面超微结构改变应属于白杨素的直接和上游生物学效应。
白杨素的另一项显著效应是下调多种蛋白质的酪氨酸磷酸化水平(图4a)。由于生物膜上富含激酶和磷酸酶，蛋白质磷酸化水平改变很可能是白杨素干扰肝癌细胞生物膜功能的下游效应。此外，染料木黄酮是蛋白质酪氨酸激酶(RTK)的广谱抑制剂[33]；白杨素与染料木黄酮结构相似，推测也可能通过直接抑制RTK下调酪氨酸磷酸化水平。白杨素在低剂量时下调蛋白质丝/苏氨酸磷酸化水平，高剂量时反而使某些蛋白的丝/苏氨酸磷酸化水平上升(图4b)。对此的解释是，白杨素除可能抑制丝/苏氨酸激酶外，对丝/苏氨酸磷酸酶也可能有抑制作用；并且随剂量增高，抑制后者所造成的效果超过前者。有趣的是，在相对分子质量33 000附近存在两条主要的丝/苏氨酸磷酸化上调区带(图4b)，处于该相对分子质量范围的常见磷酸化蛋白为CDK1和CDK2。
新进展表明CDK1在细胞周期的各个时相均有关键作用[34]，CDK1下调与周期阻断或进入G0期有关；而CDC25A和CDC25B则扮演周期检验点的最后放行者角色[35]，可催化pCDK1和pCDK2上的Thr14和Tyr15去磷酸化，活化CDK1/2与周期蛋白的复合物，导致细胞周期行进。反之，视周期时相的不同，CDK2和CDK1上Thr14和Tyr15磷酸化水平上调可将细胞阻断于G1~S期交界、S期或G2~M期交界。白杨素处理的BEL-7402细胞内CDK1、Thr14/Tyr15磷酸化的pCDK1/2(所用抗体可同时检测pCDK1和pCDK2)、CDC25A和CDC25B的表达水平均无明显改变(图5)。与此一致的是流式细胞分析显示白杨素并不改变BEL-7402细胞周期各时相的比例(未发表数据)，提示白杨素的增殖抑制作用并非基于对细胞周期核心调控因子的阻断。以上结果尚无法确定广谱磷酸化抗体所示相对分子质量33 000附近两条上调区带的归属；揭示其归属，将有助于发现白杨素的未知作用靶标。
参与调控细胞表面超微结构和蛋白质磷酸化的癌基因通路主要有PI3K-AKT和Wnt/β-catenin通路，故此本文探查了白杨素对这两条通路的影响。PI3K-AKT信号通路在肿瘤细胞过度增殖和抵抗程序性细胞死亡等方面扮演关键角色，并与干细胞和肿瘤干细胞的抗缺氧能力密切相关[30]，该通路的抑制剂有望成为新型靶向抗癌药。本研究发现白杨素与PI3K抑制剂LY联用具有显著的协同增效作用。课题组曾证实白杨素与顺铂联用对于抑制BEL-7402细胞增殖并无增效作用[4]，表明白杨素与LY的协同作用具有特异性。PI3K催化第二信使3,4,5-磷脂酰肌醇三磷酸的生成，后者将AKT募集到细胞表面并促进AKT上Thr308和Ser473位点的磷酸化，导致AKT通路活化[30]。Woo等[10]报道白杨素可降低U937白血病细胞中pAKT水平，进而诱导凋亡。然而本研究显示白杨素对BEL-7402细胞中AKT总蛋白和Ser473磷酸化的pAKT均无显著影响，表明与白血病细胞不同，在肝癌细胞中白杨素并未阻断AKT通路。该结果可以解释使用LY阻断PI3K-AKT通路可进一步增强白杨素的抗癌活性，提示将白杨素作为增效剂与针对PI3K-AKT的靶向抗癌药联用，可取得更佳抗癌效果。Wnt/β-catenin通路是继PI3K-AKT通路之外另一条在恶性肿瘤中普遍失调和高度亢进的通路，并且亦与肿瘤干细胞扩增密切相关。β-catenin直接参与多种细胞表面超微结构的形成，并且wnt/β-catenin通路与PI3K-AKT通路存在固有联系：pAKT可催化GSK-3β上Ser9位点的磷酸化，进而导致pGSK-3β的失活和经泛素—蛋白酶体系统的降解；GSK-3β在活化条件下可磷酸化β-catenin，导致后者经泛素—蛋白酶体系统降解[30]。本实验显示白杨素对GSK-3β和Ser9磷酸化的pGSK-3β水平均无明显影响，对β-catenin的下调作用也较微弱，提示白杨素的主要作用靶标亦非位于Wnt/β-catenin通路。
白杨素对某些肿瘤细胞的促凋亡作用已有报道[10-12]。白杨素类似物和RTK抑制剂染料木黄酮亦有促凋亡作用[36]。本实验显示白杨素可引起PARP-1降解。然而，用免疫印迹对caspase 3和线粒体外细胞色素c进行的探查，以及流式细胞分析表明，白杨素处理后的BEL-7402细胞无明显凋亡迹象；用LC3抗体亦未能检测到自噬上调(文献[4]及未发表数据)。邱艳君等[12]也表明单纯给予白杨素不足以诱导BEL-7402凋亡。PARP-1降解不一定均由凋亡途径活化引发，尚可与多种非经典细胞死亡相关。结合电镜所示有异于凋亡的细胞死亡形态(图3e)，以及前述白杨素并非直接作用于细胞周期的结果，白杨素对BEL-7402细胞的增殖抑制作用很可能与非经典(程序性)细胞死亡有关。
课题组此前用BEL-7402与L02细胞进行的对比研究表明，人正常胎肝L02细胞的微绒毛样突起显著多于肝癌细胞
[27]。由此推测白杨素引起的BEL-7402细胞微绒毛样突起密度增加可能反映了癌细胞向正常表型的转分化。与L02细胞不同的是，白杨素处理后的BEL-7402细胞还出现了粗大和超长的突起及死亡细胞(图3)。相反，同等剂量(5和10 μg)白杨素处理的L02细胞未见任何明显变化(未发表数据)，这与白杨素对正常细胞的低毒性相符。电镜显示微绒毛样突起可形成纳米膜粒
[27]，而微绒毛样突起及其相关纳米膜粒的形成又均与CD133有关
[37]，故此探查了CD133的表达。结果显示未处理的BEL-7402细胞确有CD133表达(图5)，该结果初步支持了BEL-7402细胞可生成CD133阳性纳米膜粒的推测
[27]。在白杨素处理的BEL-7402细胞，虽然微绒毛样突起和正在形成的纳米膜粒明显增加，但CD133表达总量并无改变，这反映了以下问题：第一、CD133是肿瘤干细胞(或称肿瘤起始细胞)标志
[37]。白杨素并不提升肝癌细胞匀浆中CD133的总体水平，提示白杨素可能不会产生肿瘤干细胞富集的副作用。第二、即使细胞内总CD133表达量未见上调，但从微绒毛样突起增加推测，似应有更多CD133分子募集于突起处的膜域。对此有待进一步探讨。第三、新进展提示CD133阳性纳米膜粒的释放与干细胞向分化细胞转化有关
[37]，并且单独使用CD133并不足以标记肝癌干细胞池
[38]。显然，关于CD133与干细胞和肿瘤干细胞的关系，尚存在大量未知因素有待阐明。白杨素是否通过改变CD133的磷酸化水平，影响CD133在微绒毛样突起形成和纳米膜粒释放中的作用，诱导肝癌细胞向正常表型分化？第四、胆固醇和GM1可结合与调控CD133，耗竭胆固醇可导致CD133阳性纳米膜粒大量释放
[37]；而白杨素有可能拮抗胆固醇在细胞膜中的作用
[36]。白杨素是否通过阻断CD133与胆固醇的结合，引发肝癌细胞表面超微结构改变，并促进肝癌干细胞的分化？对上述问题的探讨将是下一步工作的重点。
