过表达溶质载体家族1成员5和敲低慢病毒载体构建及稳定转染RAW264.7细胞株

doi:10.12307/2025.025

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (7): 1414-1421.doi: 10.12307/2025.025

• 细胞相关实验/试验研究Cell related experimental/trial studies • 上一篇下一篇

过表达溶质载体家族1成员5和敲低慢病毒载体构建及稳定转染RAW264.7细胞株

郭大鑫1，范苏苏2，朱振东2，侯建红1，张旋2

1云南省第三人民医院/大理大学第二附属医院，云南省昆明市 650011；2昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室/现代生物医药产业学院，云南省昆明市 650500

收稿日期:2023-11-24 接受日期:2024-02-07 出版日期:2025-03-08 发布日期:2024-06-27
通讯作者: 侯建红，博士，副主任医师，云南省第三人民医院/大理大学第二附属医院，云南省昆明市 650011 共同通讯作者：张旋，博士，教授，昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室/现代生物医药产业学院，云南省昆明市 650500
作者简介:郭大鑫，男，1996年生，吉林省长春市人，满族，大理大学在读硕士，主要从事骨关节炎基础与临床研究。
基金资助:
云南省科技厅科技计划项目(202101BA070001-228)，项目负责人：侯建红；昆明医科大学抗炎与免疫调节药物研究科技创新团队(CXTD2022003)，项目负责人：张旋

Construction of lentiviral vectors for solute carrier family 1 member 5 overexpression and knockdown and stably transfected RAW264.7 cell line

Guo Daxin1, Fan Susu2, Zhu Zhendong2, Hou Jianhong1, Zhang Xuan2

1Third People’s Hospital of Yunnan Province /Second Affiliated Hospital of Dali University, Kunming 650011, Yunnan Province, China; 2School of Pharmaceutical Sciences & Yunnan Key Laboratory of Pharmacology for Natural Products/College of Modern Biomedical Industry, Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China

Received:2023-11-24 Accepted:2024-02-07 Online:2025-03-08 Published:2024-06-27
Contact: Hou Jianhong, MD, Associate chief physician, Third People’s Hospital of Yunnan Province /Second Affiliated Hospital of Dali University, Kunming 650011, Yunnan Province, China; Zhang Xuan, MD, Professor, School of Pharmaceutical Sciences & Yunnan Key Laboratory of Pharmacology for Natural Products/College of Modern Biomedical Industry, Kunming Medical University, Kunming 650500, Yunnan Province, China
About author:Guo Daxin, Master candidate, Third People’s Hospital of Yunnan Province /Second Affiliated Hospital of Dali University, Kunming 650011, Yunnan Province, China
Supported by:
Science and Technology Plan Project of Yunnan Provincial Department of Science and Technology, No. 202101BA070001-228 (to HJH); Anti-inflammatory and Immunomodulatory Drug Research Technology Innovation Team of Kunming Medical University, No. CXTD2022003 (to ZX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

慢病毒载体：慢病毒是一类基因工程工具，主要用于将目的基因稳定地整合到宿主细胞的基因组中。与常规的腺病毒或其他病毒相比，慢病毒具有高效、稳定的基因转移能力。在有关于溶质载体家族1成员5(SLC1A5)的研究中，使用慢病毒的目的是为了确保目的基因在RAW264.7细胞中稳定表达，为后续的机制探索和治疗策略的验证提供坚实的实验基础。
RAW264.7细胞株：RAW264.7细胞是来源于小鼠巨噬细胞的一种常用细胞株。由于易于培养、稳定性好以及具有典型的巨噬细胞特性，被广泛应用于免疫学、肿瘤生物学等领域的研究中。通过在RAW264.7细胞中稳定表达或敲低SLC1A5，研究者可以更深入地探究其对巨噬细胞功能、代谢和免疫应答的影响，为SLC1A5在免疫调节和疾病发生发展中的作用提供有力的实验工具。

背景：溶质载体家族1成员5(solute carrier family 1 member 5，SLC1A5)在多种疾病中发挥了潜在作用，但确切作用机制尚不清楚。构建稳定的SLC1A5过表达和敲低细胞模型可为深入研究SLC1A5在疾病中的确切作用机制以及发现潜在治疗靶点提供有力的实验工具。
目的：构建小鼠SLC1A5过表达和敲低的慢病毒载体，以建立稳定转染的RAW264.7细胞株，为深入探讨SLC1A5在炎症中的作用提供实验基础。
方法：根据SLC1A5基因序列设计合成引物并使用聚合酶链反应扩增该基因片段。将目的基因定向接入经AgeI/NheI酶切的载体质粒GV492中构建重组慢病毒质粒，对阳性克隆进一步筛选后测序比对结果；pHelper1.0质粒载体、pHelper2.0质粒载体、目的质粒载体与293T细胞共同培养并转染，获得慢病毒原液进行包装和滴度测定；在此基础上，通过体外培养RAW264.7细胞，确定嘌呤霉素工作质量浓度；不同滴度的慢病毒分别与RAW264.7细胞共同培养，根据荧光强度确定转染效率；用嘌呤霉素挑选出稳定转染细胞，实时荧光定量聚合酶链反应和蛋白免疫印迹方法检测稳定转染细胞株的SLC1A5基因和蛋白表达水平。

结果与结论：①测序序列与目的序列一致提示重组慢病毒载体构建成功；②过表达SLC1A5慢病毒的滴度为1×109 TU/mL，敲低SLC1A5慢病毒的滴度为3×109 TU/mL；③确定RAW264.7细胞嘌呤霉素工作质量浓度为3 μg/mL；④过表达/敲低SLC1A5慢病毒转染RAW264.7细胞的最佳条件皆为HiTransG P转染增强液且感染复数值等于50；⑤过表达SLC1A5稳转细胞株中SLC1A5基因和蛋白的表达量明显上调，而敲低SLC1A5稳转细胞株中SLC1A5基因和蛋白的表达量显著下调。结果表明，成功构建了小鼠SLC1A5过表达和敲低的慢病毒载体并获得稳定转染的RAW264.7细胞株。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 慢病毒载体, 溶质载体家族1成员5, SLC1A5, 过表达, 敲低, RAW264.7细胞, 稳转细胞株

Abstract: BACKGROUND: Solute carrier family 1 member 5 (SLC1A5) plays a potential role in a variety of diseases, but the exact mechanism of action is unclear. The construction of stable SLC1A5 overexpression and knockdown cell models can provide a powerful experimental tool for in-depth study of the exact role and mechanism of SLC1A5 in diseases and the discovery of potential therapeutic targets.
OBJECTIVE: To construct lentiviral vectors for overexpression and knockdown of mouse SLC1A5 and establish stable transfected RAW264.7 cell lines, so as to provide an experimental foundation for further investigation of the role of SLC1A5 in inflammation.
METHODS: Primers were designed and synthesized based on the SLC1A5 gene sequence, and the gene segment was amplified using polymerase chain reaction. Subsequently, the target gene segment was directionally inserted into the GV492 vector plasmid, which had been digested with AgeI/NheI enzymes, to construct recombinant lentiviral plasmids. Positive clones were further selected, and their sequences were confirmed. The pHelper1.0 plasmid vector and pHelper2.0 plasmid vector, along with the target plasmid vector, was co-cultured with 293T cells for transfection, resulting in the production and titration of lentiviral stocks. Furthermore, RAW264.7 cells were cultured in vitro, and the working concentration of puromycin was determined. Lentiviruses were separately co-cultured with RAW264.7 cells, and transfection efficiency was determined by measuring fluorescence intensity. Stable transfected cells were selected using puromycin, and real-time fluorescence quantitative PCR and western blot assay were employed to assess the gene and protein expression levels of SLC1A5 in stably transfected cell lines.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Sequencing results indicated a perfect match between the sequencing and target sequences, confirming the successful construction of recombinant lentiviral vectors. (2) The titer for the overexpression SLC1A5 lentivirus was 1×109 TU/mL, while the titer for the knockdown SLC1A5 lentivirus was 3×109 TU/mL. (3) The working concentration of puromycin for RAW264.7 cells was determined to be 3 μg/mL. (4) The optimal conditions for transfecting RAW264.7 cells with overexpression/knockdown expression of SLC1A5 lentivirus involved the use of HiTransG P transfection enhancer with a multiplicity of infection value of 50. (5) A significant upregulation of the gene and protein expression levels of SLC1A5 was detected in cell lines stably overexpressing SLC1A5, while gene and protein expression levels of SLC1A5 were significantly decreased in the knockdown stable cell lines. These findings indicate that lentiviral vectors for mouse SLC1A5 overexpression and knockdown have been successfully constructed and a stably transfected RAW264.7 cell line has been obtained.

Key words: lentiviral vector, solute carrier family 1 member 5, SLC1A5, overexpression, knockdown, RAW264.7 cell, stably transfected cell line

中图分类号:

郭大鑫, 范苏苏, 朱振东, 侯建红, 张旋. 过表达溶质载体家族1成员5和敲低慢病毒载体构建及稳定转染RAW264.7细胞株[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1414-1421.

Guo Daxin, Fan Susu, Zhu Zhendong, Hou Jianhong, Zhang Xuan. Construction of lentiviral vectors for solute carrier family 1 member 5 overexpression and knockdown and stably transfected RAW264.7 cell line[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(7): 1414-1421.

图/表（结果） 3

2.1 慢病毒载体构建及质粒鉴定 SLC1A5过表达/敲低慢病毒载体GV492 和GV493见图1A，B。将鉴定出的阳性单克隆菌落37 ℃培养18 h，取适量菌液测序，并与目的基因的反向互补序列进行比对。化学合成目的基因序列见图2A，阳性重组克隆测序比对结果见图2B。比对结果显示与设计目的序列保持一致，说明目的基因正确插入GV492载体。
2.2 慢病毒的包装及滴度测定 SLC1A5过表达慢病毒滴度为1×109 TU/mL，见图3A，SLC1A5敲低慢病毒滴度为3×109 TU/mL，见图3B。
2.3 嘌呤霉素工作浓度的确定嘌呤霉素质量浓度的增加与RAW264.7细胞死亡呈正相关，嘌呤霉素质量浓度为3.5 μg/mL及以上时基本无细胞存活，见图4A。随着培养时间的延长，嘌呤霉素质量浓度为3.0 μg/mL时即无细胞存活，见图4B。
2.4 过表达/敲低SLC1A5慢病毒最佳转染条件在过表达SLC1A5慢病毒转染RAW264.7细胞中，当各组的感染复数为10时，只有少数细胞带有荧光，表示较少数的细胞成功转染，且荧光强度较弱；与完全培养基组和转染增强液A组相比，转染增强液P组细胞状态良好，基本无细胞死亡，荧光强度较强；当感染复数为50时，各组被转染的RAW264.7细胞数增多，荧光程度较强，转染效率达到80%左右，其中转染增强液P组转染效率较好；当感染复数为100时，各组被转染RAW264.7细胞未见明显增多，细胞生长情况一般，转染效率达到90%左右，见图5。
在敲低SLC1A5慢病毒转染RAW264.7细胞中，当感染复数为10时，仅有极少数RAW264.7细胞成功转染，荧光强度较弱；当感染复数为50时，被转染RAW264.7细胞增多，荧光强度较强，细胞状态良好，无明显细胞死亡，转染效率达到80%左右；当感染复数为100时，各组被转染RAW264.7细胞未见明显增多，细胞生长情况一般，转染效率达到90%左右，见图6。
该实验中最佳转染条件的选择原则：在保证细胞生长状态良好的前提下使用最少量的慢病毒以及荧光强度较强的转染增强液，基于上述原则，过表达/敲低SLC1A5慢病毒转染RAW264.7细胞的最佳转染条件皆为HiTransG P转染增强液且感染复数值等于50。
2.5 过表达SLC1A5慢病毒稳转RAW264.7细胞中SLC1A5的表达量完全培养基中加入HiTransG P及感染复数为50的过表达目的基因慢病毒与RAW264.7细胞培养72 h，含3 μg/mL嘌呤霉素的完全培养基筛选第4，5代获得SLC1A5稳定高表达的RAW264.7细胞株。荧光显微镜观察结果显示目的基因过表达RAW264.7细胞株生长状态良好，达到100%的转染效率，见图7。提取总RNA进行qPCR定量检测，与空白对照组相比，SLC1A5-H组的SLC1A5基因表达量有显著升高，差异有显著性意义(P < 0.001)，而阴性对照组与空白对照组的SLC1A5基因表达量未发生明显变化，见图8。
2.6 敲低SLC1A5慢病毒转染RAW264.7细胞中SLC1A5的表达量在完全培养基中加入含HiTransG P转染液以及感染复数为50的敲低慢病毒与RAW264.7细胞培养72 h后，使用含3 μg/mL嘌呤霉素的完全培养基构建稳定敲低RAW264.7细胞株。荧光显微镜观察结果显示稳转RAW264.7细胞株生长状态良好，达到100%的转染效率，见图9。提取总RNA进行qPCR检测，与空白对照组比较，SLC1A5-L组的SLC1A5表达量有显著降低，差异有显著性意义(P < 0.01)，阴性对照组与空白对照组的SLC1A5表达量未出现明显变化，见图10。
2.7 过表达/敲低SLC1A5慢病毒转染RAW264.7细胞中SLC1A5的相对蛋白表达水平经Image J灰度统计分析空白对照组、阴性对照组、SLC1A5-L组、SLC1A5-H组的SLC1A5蛋白相对表达水平，与阴性对照组相比，SLC1A5-L组细胞中SLC1A5蛋白表达量明显降低(P < 0.05)；与阴性对照组相比，SLC1A5-H组细胞中SLC1A5蛋白表达量明显增高(P < 0.001)。因此在蛋白表达水平上，经过表达/敲低SLC1A5慢病毒转染RAW264.7细胞也得到了明显增高或降低，见图11。

参考文献

[1] CÉSAR-RAZQUIN A, SNIJDER B, FRAPPIER-BRINTON T, et al. A Call for Systematic Research on Solute Carriers. Cell. 2015;162(3):478-487.
[2] WANG W, ZOU W. Amino Acids and Their Transporters in T Cell Immunity and Cancer Therapy. Mol Cell. 2020;80(3):384-395.
[3] 宋晓翰,王江,柳红.先导化合物结构优化策略(八)——药物转运体及其相关药物设计策略[J].药学学报,2021,56(2):432-444.
[4] RON-HAREL N, GHERGUROVICH JM, NOTARANGELO G, et al. T Cell Activation Depends on Extracellular Alanine. Cell Rep. 2019;28(12): 3011-3021.e4.
[5] KISHTON RJ, SUKUMAR M, RESTIFO NP. Arginine Arms T Cells to Thrive and Survive. Cell Metab. 2016;24(5):647-648.
[6] LUO Y, LI W, LING Z, et al. ASCT2 overexpression is associated with poor survival of OSCC patients and ASCT2 knockdown inhibited growth of glutamine-addicted OSCC cells. Cancer Med. 2020;9(10): 3489-3499.
[7] ZHANG Z, LIU R, SHUAI Y, et al. ASCT2 (SLC1A5)-dependent glutamine uptake is involved in the progression of head and neck squamous cell carcinoma. Br J Cancer. 2020;122(1):82-93.
[8] LI S, PEI L, ZHOU Q, et al. SLC1A5 regulates cell proliferation and self-renewal through β-catenin pathway mediated by redox signaling in arsenic-treated uroepithelial cells. Ecotoxicol Environ Saf. 2023;262: 115204.
[9] CONGER KO, CHIDLEY C, OZGURSES ME, et al. ASCT2 is the primary serine transporter in cancer cells. bioRxiv [Preprint]. 2023: 2023.10.09.561530.
[10] SIMCOX J, LAMMING DW. The central moTOR of metabolism. Dev Cell. 2022;57(6):691-706.
[11] VAN DEN BOSCH MHJ, VAN LENT PLEM, VAN DER KRAAN PM. Identifying effector molecules, cells, and cytokines of innate immunity in OA. Osteoarthritis Cartilage. 2020;28(5):532-543.
[12] SUN Z, LIU Q, LV Z, et al. Targeting macrophagic SHP2 for ameliorating osteoarthritis via TLR signaling. Acta Pharm Sin B. 2022;12(7): 3073-3084.
[13] NICKLIN P, BERGMAN P, ZHANG B, et al. Bidirectional transport of amino acids regulates mTOR and autophagy. Cell. 2009;136(3):521-534.
[14] ZHU L, YANG T, LI L, et al. TSC1 controls macrophage polarization to prevent inflammatory disease. Nat Commun. 2014;5:4696.
[15] ABU-REMAILEH M, WYANT GA, KIM C, et al. Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes. Science. 2017;358(6364):807-813.
[16] NALDINI L, BLÖMER U, GALLAY P, et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 1996;272(5259):263-267.
[17] 房恩岳,张丽萍,马雪征,等.慢病毒载体系统及其安全性研究进展[J].病毒学报,2023,39(4):1181-1192.
[18] LING ZN, JIANG YF, RU JN, et al. Amino acid metabolism in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 2023;8(1):345.
[19] LI S, ZHOU Q, LIU W, et al. Targeting SLC1A5 blocks cell proliferation through inhibition of mTORC1 in arsenite-treated human uroepithelial cells. Toxicol Lett. 2021;345:1-11.
[20] KATZ JN, ARANT KR, LOESER RF. Diagnosis and Treatment of Hip and Knee Osteoarthritis: A Review. JAMA. 2021;325(6):568-578.
[21] PHAM TM, ERICHSEN JL, KOWAL JM, et al. Elevation of Pro-Inflammatory Cytokine Levels Following Intra-Articular Fractures-A Systematic Review. Cells. 2021;10(4):902.
[22] MOBASHERI A, RAYMAN MP, GUALILLO O, et al. The role of metabolism in the pathogenesis of osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol. 2017;13(5): 302-311.
[23] TAKAYAMA K, KAWAKAMI Y, KOBAYASHI M, et al. Local intra-articular injection of rapamycin delays articular cartilage degeneration in a murine model of osteoarthritis. Arthritis Res Ther. 2014;16(6):482.
[24] SCANZELLO CR, GOLDRING SR. The role of synovitis in osteoarthritis pathogenesis. Bone. 2012;51(2):249-257.
[25] WILLENBORG S, SANIN DE, JAIS A, et al. Mitochondrial metabolism coordinates stage-specific repair processes in macrophages during wound healing. Cell Metab. 2021;33(12):2398-2414.e9.
[26] DAGHESTANI HN, PIEPER CF, KRAUS VB. Soluble macrophage biomarkers indicate inflammatory phenotypes in patients with knee osteoarthritis. Arthritis Rheumatol. 2015;67(4):956-965.
[27] KRAUS VB, MCDANIEL G, HUEBNER JL, et al. Direct in vivo evidence of activated macrophages in human osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2016;24(9):1613-1621.
[28] GRIFFIN TM, SCANZELLO CR. Innate inflammation and synovial macrophages in osteoarthritis pathophysiology. Clin Exp Rheumatol. 2019;37 Suppl 120(5):57-63.
[29] ZHANG H, LIN C, ZENG C, et al. Synovial macrophage M1 polarisation exacerbates experimental osteoarthritis partially through R-spondin-2. Ann Rheum Dis. 2018;77(10):1524-1534.
[30] PALMIERI EM, MENGA A, MARTÍN-PÉREZ R, et al. Pharmacologic or Genetic Targeting of Glutamine Synthetase Skews Macrophages toward an M1-like Phenotype and Inhibits Tumor Metastasis. Cell Rep. 2017;20(7):1654-1666.

引言

溶质载体(solute carrier，SLC)家族转运蛋白是位于质膜、线粒体或其他内膜的膜蛋白，通过产生电化学电位差或离子梯度，从而促进不同分子的转移，包括糖、核苷酸和氨基酸[1-2]。目前已经发现400多种SLC转运体，分为65个亚家族[3]。其中丙氨酸通过SLC38A1转运至CD4+T细胞中[4]；精氨酸可通过SLC7A1、SLC7A2、SLC7A3等阳离子氨基酸转运载体进入胞内[5]。溶质载体家族1成员5(solute carrier family 1 member 5，SLC1A5)是一种以谷氨酰胺为首选底物、Na+依赖性的中性转运蛋白，又称Na+依赖性谷氨酰胺载体2(alanine-serine-cysteine transporter 2，ASCT2)，在多种癌症中发挥作用[6-7]。例如，SLC1A5是砷诱导的尿路上皮细胞增殖和自我更新的潜在治疗靶点[8]，同时也是癌细胞中主要的丝氨酸转运蛋白[9]。
目前关于SLC1A5在炎症和代谢中的研究较少，而代谢对于骨关节炎疾病发展又极为重要。mTOR通路是细胞内重要的信号通路，通过整合多种营养和激素来调控合成代谢过程，对细胞生长、凋亡及代谢发挥了极为重要的作用[10]。在骨关节发生发展过程中，与M1巨噬细胞相关的多种炎症因子(例如肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β、白细胞介素6)均表达上调[11]，这进一步证明了滑膜中M1巨噬细胞极化是加剧骨关节炎疾病进展的主要原因，也是软骨退化及功能障碍的主要因素[12]。研究显示，L-谷氨酰胺摄取受SLC1A5调节，SLC1A5功能丧失会抑制细胞生长并激活自噬[13]。在必需氨基酸存在的条件下，细胞摄取L-谷氨酰胺及其随后快速流出是激活mTOR的限速步骤。研究显示，mTOR信号通路可调节巨噬细胞极化状态[14]，通过mTOR非依赖的TSC1/2-RasGTPase-Raf-MEK-Erk通路调控M1型极化；通过调节mTOR依赖的C/EBPβ的表达来调控巨噬细胞M2型极化。而SLC家族蛋白是允许氨基酸进入细胞并向mTOR发出信号的主要细胞表面转运蛋白[15]。
慢病毒载体是以慢病毒基因组为基础，通过分子生物学手段，删除毒力相关基因，引入目的基因和表达原件，从而实现目的基因稳定表达[16]。慢病毒载体因载量大、感染广泛、稳定性和安全性高的优点，已经成为基因治疗领域的最有前景的载体之一[17]。由此作者提出SLC1A5可能参与了骨关节炎的发生。该研究通过构建SLC1A5过表达和敲低的慢病毒载体，转染RAW264.7细胞，建立SLC1A5过表达和敲低的稳定转染RAW264.7细胞株，为进一步探索SLC1A5在细胞生物学、疾病发生机制中的作用及发现潜在治疗靶点提供有力的实验工具。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计构建稳定的SLC1A5过表达和敲低的巨噬细胞模型，采用实时定量PCR和Western blot进行验证，组间比较采用方差分析和q检验。
1.2 时间及地点实验于2023年3-10月在昆明医科大学药学院暨云南省天然药物药理重点实验室完成。
1.3 材料 RAW264.7(小鼠单核巨噬细胞白血病细胞)购自武汉普诺赛生命科技有限公司；DMEM培养基、胎牛血清(VivaCell)；Trizol试剂(美国Thermo)；嘌呤霉素(Solarbio)；PCR试剂盒(Yeasen)；BCA蛋白定量试剂盒、SLC1A5抗体、Anti-Rabbit IgG(H+L)Antibbody(Proteintech公司)；SLC1A5 Forward primer、SLC1A5 Reverse primer由北京擎科生物科技有限公司合成。慢病毒载体GV492、GV493及pHelper (上海吉凯基因医学科技股份有限公司)，质粒测序结果来自上海吉凯基因医学科技股份有限公司。
1.4 实验方法
1.4.1 过表达/敲低SLC1A5慢病毒载体的构建

(1)慢病毒载体的构建：根据miRBase(http://www.mirbase.org/)数据库设计扩增小鼠SLC1A5前体序列的引物及成熟体，引物序列：SLC1A5-F：5’-CAT CAA CGA CTC TGT TGT AGA CC-3’；SLC1A5-R：5’-CTG GAT ACA GGA TTG CGG TAT TT-3’。构建过表达慢病毒载体：载体编号GV492，元件顺序：Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin，AgeI/NheI为克隆位点；构建低表达慢病毒载体：载体编号GV493，元件顺序：hU6-MCS-CBh-gcGFP-IRES-puromycin，对照插入序列：TTC TCC GAA CGT GTC ACG T。载体酶切体系见表1，37 ℃反应3 h对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带获得酶切后的线性载体。

以小鼠基因组DNA为模板扩增SLC1A5前体序列，扩增反应体系见表2，扩增程序：98 ℃预变性5 min；98 ℃变性10 s，退火55 ℃ 10 s，延伸55 ℃ 30 s，共计30个循环；延伸72 ℃ 8 min。

PCR产物与载体交换：冰水浴中配制反应体系，见表3，于37 ℃反应 30 min，随后置于冰水浴中冷却 5 min后立即转化。将10 µL交换反应产物加入到100 µL感受态细胞中，轻轻混匀置冰上30 min，42 ℃热激 90 s，冰水浴孵育2 min，加入500 µL LB培养基，置于37 ℃摇床振荡培养1 h。取适量菌液均匀涂布在含有相应抗生素的平板上，在恒温培养箱中倒置培养18 h。对阳性单克隆菌落进行PCR鉴定及测序分析。将测序一致的菌液进行扩菌培养和质粒抽提。

(2)慢病毒的包装与滴度检测：将pHelper1.0质粒载体、目的质粒载体以及pHelper2.0质粒载体与293T细胞共同转染，在37 ℃和体积分数5% CO2的条件下培养48 h后，收集细胞上清，通过离心浓缩的方式去除杂质并进行分装。随后，对获得的病毒进行稀释，并进行滴度测定。计算公式：病毒滴度(TU/mL)=表达绿色荧光细胞数/病毒原液量。
1.4.2 构建和筛选稳定过表达/敲低SLC1A5的RAW264.7细胞株
(1) RAW264.7细胞培养：复苏RAW264.7细胞，在培养皿中使用完全培养基(体积分数10%胎牛血清，90%DMEM培养基)于37℃、体积分数5%CO2条件下培养RAW264.7细胞，定期更换培养基，待细胞铺满培养皿的80%区域可进行传代。
(2) RAW264.7细胞嘌呤霉素工作浓度的筛选：将生长状态良好的RAW264.7以1×108 L-1的细胞浓度种于24孔板，每孔1 mL，贴壁生长24 h后，在每孔中逐渐加入嘌呤霉素，浓度梯度为0.5 μg/mL，最大质量浓度为10 μg/mL。继续培养24 h后，观察细胞生长情况。随后，继续培养RAW264.7细胞48 h，通过显微镜观察细胞生长情况。将所有正常RAW264.7细胞杀死的最低质量浓度确定为RAW264.7细胞的嘌呤霉素工作质量浓度。
(3)确定慢病毒转染RAW264.7细胞的最佳转染条件：

RAW264.7细胞转染：将RAW264.7细胞以1×107 L-1的细胞浓度种于96孔板，每孔100 μL，培养24 h。取出慢病毒置于冰上溶解，用适量完全培养基稀释，获得相应滴度的病毒：1×107，5×107，1×108 TU/mL 3个滴度。按照表4添加其余试剂。培养24 h后根据细胞状态改为完全培养基继续培养。

转染效果确定：慢病毒转染RAW264.7细胞72 h后，观察细胞的荧光强度及状态。将转染效果达80%以上、感染复数值最小、细胞状态良好的转染条件为最终构建条件。
(4)过表达/敲低SLC1A5稳转RAW264.7细胞株的构建及鉴定：
实验分组：将实验分为对照慢病毒+HiTransG P 转染液+完全培养基组(阴性对照组)、过表达SLC1A5慢病毒+ HiTransG P 转染液+完全培养基组(SLC1A5-H组)、敲低SLC1A5慢病毒+HiTransG P 转染液+完全培养基组(SLC1A5-L组)以及RAW264.7细胞+完全培养基组(空白对照组)。
转染实验：将RAW264.7细胞以1×108 L-1的细胞浓度种于6孔板，每孔2 mL，组内平行感染2个复孔，贴壁生长24 h后，加入40 μL HitransG P转染增强液和慢病毒。依据病毒滴度和感染复数计算出每孔需要的病毒体积，计算公式：病毒体积=(感染复数×细胞数目)/病毒滴度。根据细胞状态更换培养基。转染72 h后，荧光显微镜下观察转染效率。
构建稳转株：在慢病毒转染RAW264.7细胞72 h后，更换为含3 μg/mL嘌呤霉素的完全培养基维持培养四五代，收集细胞检测SLC1A5的mRNA和蛋白表达量。
(5)实时荧光定量PCR(qPCR)检测稳转细胞株的SLC1A5表达量：收取空白对照组、阴性对照组、SLC1A5-L组、SLC1A5-H组细胞，加入Trizol提取细胞中的总RNA，测定纯度后反转录得到cDNA，用实时荧光定量PCR检测各组细胞SLC1A5的mRNA表达水平，同时测定内参GAPDH的表达。以2-ΔΔCT法计算SLC1A5的相对表达量。
(6)蛋白免疫印迹法(Western blot)检测稳转细胞株的SLC1A5蛋白表达水平：收取空白对照组、阴性对照组、SLC1A5-L组、SLC1A5-H组细胞，提取细胞总蛋白并用BCA法定量以确定上样量；蛋白溶液与4×loading buffer混合，经水浴锅煮沸后冷却，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，经转膜和封闭后，用一抗SLC1A5抗体(1∶1 000)和二抗Anti-Rabbit IgG(H+L)Antibody先后孵育，经曝光显影后得到灰度图。用免疫印迹检测SLC1A5的蛋白表达水平，同时测定内参β-Actin的表达，分析图像软件为Image J计算SLC1A5的相对表达量。
1.5 主要观察指标 ①慢病毒载体测序以及滴度测定相关指标；②荧光法测定细胞转染效率；③qPCR法测定SLC1A5基因表达水平；④蛋白免疫印迹分析法测定SLC1A5蛋白表达水平。

1.6 统计学分析采用SPSS 25.0软件对数据进行分析处理，数据以x±s表示；组间比较采用参数检验中的单因素方差分析(One-way ANOVA)和q检验。P < 0.05为差异有显著性意义，采用Graph Pad Prism.v 8.02绘制数据图表。文章统计学方法已经通过云南省第三人民医院生物统计学专家审核。

讨论

氨基酸是细胞必需的营养素，也是细胞生长的重要能量来源之一，细胞外的氨基酸需要通过细胞膜上相应的氨基酸转运体才能进入胞内[18]。在氨基酸转运体中，SLC1A5活性可以影响到mTORC1通路的激活，进而调控细胞的生长和代谢[19]。骨关节炎是目前世界上最常见的关节炎形式，严重影响患者的运动能力以及生活质量[20]。关节内创伤发生后，炎症因子和基质降解酶表达水平也会升高，在创伤愈合后滑液中的炎症水平仍然较高[21]。而代谢对软骨和滑膜功能很重要，在不良的微环境条件下，哺乳动物细胞的代谢由静息态转变为高度代谢的激活态，以维持能量稳定。但这种现象也会导致炎症和降解蛋白各种生物合成的代谢中间产物增加，这反过来又激活了参与分解代谢过程的关键转录因子和炎症信号通路，导致发病机制的驱动因素持续存在[22]。一些研究已经报道了阻断代谢调节因子如AMPK和mTOR在体内外骨关节炎模型中的效果。在实验性骨关节炎小鼠中，关节内注射雷帕霉素(靶向mTOR)可以显著降低关节软骨损伤的严重程度，这种作用是通过增加自噬和抑制血管内皮生长因子、X α1型胶原链和基质金属蛋白酶13的产生来介导的[23]。这些研究提示mTOR信号通路在骨关节炎疾病进展中发挥着重要作用，SLC1A5可能通过调控mTOR信号通路在骨关节炎疾病中发挥潜在作用。该研究成功构建了SLC1A5过表达和敲低的慢病毒载体，可为深入研究SLC1A5在骨关节疾病中的确切作用和机制提供了有力的工具。
炎症在骨关节炎中的作用多年来一直存在争议，且关节炎症在促进组织损伤方面的意义尚不清楚，但通过骨关节炎相关的细胞、分子、遗传因素分析发现，在骨关节炎患者中可见滑膜内单核细胞浸润[24]，在伤口愈合后期，巨噬细胞发挥抗炎和修复功能[25]，在骨关节炎中也发挥类似的作用。有研究通过检测叶酸受体表达发现，膝关节中活化巨噬细胞的数量与骨关节炎严重程度和症状相关，测量巨噬细胞标志物可以预测骨关节炎进展的风险[26-27]。
巨噬细胞的激活和极化状态受到严格控制，其极化状态对于调节伤口愈合至关重要。活化的巨噬细胞传统上被定义为“M1”和“M2”极化状态，分别为驱动促炎或免疫调节表型[28]。ZHANG等[29]为了评估M1及M2型巨噬细胞对骨关节炎的影响，采用胶原酶注射和半月板不稳定2种小鼠模型，分别观察巨噬细胞极化偏置对高水平和低水平滑膜骨关节炎模型的影响。正如预测的那样，M1型巨噬细胞比值更大的小鼠出现了更严重的滑膜炎症和软骨病理；而M2型巨噬细胞比值更大的小鼠则得到了保护，减轻了骨关节炎症状。因此，探索合适的促使巨噬细胞向M2极化重编程的物质及具体机制将有助于骨关节炎的早期防治。
如前文所述，mTOR通路是细胞内重要的信号通路，对调控细胞生长、发育及细胞代谢过程具有重要作用，且mTOR在骨关节炎疾病进展中也发挥了重要作用。谷氨酰胺合成酶可以通过调控mTOR影响巨噬细胞极化[30]。由此作者推测SLC1A5可能通过调节mTOR信号通路从而影响巨噬细胞的极化，这需要在后续研究中进行验证。
此次研究成功构建了小鼠SLC1A5过表达和敲低的慢病毒载体并获得稳定转染的RAW264.7细胞株，可为进一步探究SLC1A5在巨噬细胞极化以及炎症和代谢疾病中的作用提供有力的工具，对于进一步验证其在相关疾病中的作用机制奠定了一定的前期基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

过表达溶质载体家族1成员5和敲低慢病毒载体构建及稳定转染RAW264.7细胞株

Construction of lentiviral vectors for solute carrier family 1 member 5 overexpression and knockdown and stably transfected RAW264.7 cell line

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 3

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	胡涛涛, 刘兵, 陈诚, 殷宗银, 阚道洪, 倪杰, 叶凌霄, 郑祥兵, 严敏, 邹勇. 过表达神经调节蛋白1的人羊膜间充质干细胞促进小鼠皮肤创面愈合[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(7): 1343-1349.
[2]	林书倩, 赵玺龙, 高景, 潘兴华, 李自安, 阮光萍. 干扰和过表达端粒酶卡哈尔体蛋白1小鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性对比[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(31): 6616-6624.
[3]	杨锋, 徐金凡, 龙欢, 杨冯春, 张桂鑫, 姜涛, 陈庆真, 邵敏. 雌激素受体α激活腺苷酸活化蛋白激酶信号通路促进成骨细胞的增殖与分化[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(24): 5061-5070.
[4]	宁寅宽, 刘林志, 周次腊, 隆宇斌. 重组慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质构建转基因组织工程材料[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(23): 4851-4858.
[5]	邱晓燕, 李碧欣, 黎敬弟, 范垂钦, 马廉, 王鸿武. MAFA-PDX1过表达慢病毒感染人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(7): 1000-1006.
[6]	刘春丽, 闫雨娟, 莫礼文, 吴志杰, 张黎. 葛根素通过Notch1信号通路抑制Raw264.7细胞向破骨细胞的分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(35): 5636-5641.
[7]	姚婷, 官蓉威, 高原. SMAD4过表达干预骨质疏松大鼠铁代谢相关蛋白的表达[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(23): 3648-3653.
[8]	唐亮, 李熙恒, 牛瑞娟, 李欣悦, 邹馨颖, 毛天骄, 李江. 柚皮苷通过调控RAW264.7细胞功能影响MC-3T3-E1细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1205-1210.
[9]	胡新明, 乔艳华, 王肖帆, 李林玉, 赵冰. 长链非编码RNA浆细胞瘤变异性易位基因1参与盆腔器官脱垂的机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 669-675.
[10]	何琴, 卜艳, 林光磊, 罗晶, 雍敏, 黄永清. RNA结合蛋白Lin28A差异表达可调控牙周膜干细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(33): 5283-5291.
[11]	刘春丽, 闫雨娟, 莫礼文, 吴志杰, 张黎. 葛根素对RAW264.7细胞破骨分化的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(32): 5114-5119.
[12]	刘官娟, 宋娜, 霍花, 罗珊珊, 程余婷, 熊玥, 洪伟, 廖健. 唑来膦酸调控NLRP3信号通路抑制脂多糖诱导的破骨细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(29): 4677-4683.
[13]	韩行, 李雯雯, 马文盛. 静压力作用下三维培养人牙周膜干细胞促进RAW264.7细胞的破骨向分化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(24): 3810-3817.
[14]	胡维帆, 郑力, 李大地, 孙阳, 赵凤朝. 过表达miR-25通过 NFATc1信号通路调控钛颗粒诱导的破骨细胞分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 682-687.
[15]	杨锐娟, 李阳阳, 蔡瑞艳, 刘慧兵, 郭春. 白细胞介素1α诱导破骨细胞活化和骨流失[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(23): 3691-3699.