2.1   干扰素γ显著增加血管平滑肌细胞的迁移能力   由图1可以看出，与对照组相比，10 ng/mL干扰素γ处理24 h后侵袭的细胞数量显著增加(对照组：70.87±5.17；干扰素γ组：112.10±5.17，P < 0.01)，表明干扰素γ显著增加血管平滑肌细胞的迁移能力。
2.2   干扰素γ显著增加血管平滑肌细胞的凋亡率   由图2可以看出，与对照组相比，10 ng/mL 干扰素γ处理24 h后的血管平滑肌细胞与TUNEL荧光共定位现象明显增加；流式细胞术分析结果显示，与对照组相比，10 ng/mL 干扰素γ处理后血管平滑肌细胞凋亡率明显升高[对照组：(4.033±0.528)%；干扰素γ组：(6.073±0.528)%，P < 0.01]。
2.3   干扰素γ显著增加血管平滑肌细胞NLRP3、caspase-1 mRNA的表达   qPCR检测结果发现，血管平滑肌细胞经过干扰素γ处理后NLRP3、caspase-1 mRNA表达量均明显高于对照组。NLRP3 mRNA表达：对照组为1.000±1.479，干扰素γ组为16.930±1.479；caspase-1 mRNA表达：对照组为1.000±1.893，干扰素γ组为13.000±1.893，差异均有显著性意义(P < 0.05)，见图3。
2.4   干扰素γ显著增加血管平滑肌细胞NLRP3、caspase-1、cleaved N-terminal GSDMD蛋白表达   Western blot检测结果显示，与对照组相比，干扰素γ组血管平滑肌细胞焦亡相关蛋白NLRP3、caspase-1、cleaved N-terminal GSDMD的表达均显著提高(NLRP3：对照组为0.230±0.011，干扰素γ组为0.613±0.011；caspase-1：对照组为0.330±0.013，干扰素γ组为0.680±0.013；cleaved N-terminal GSDMD：对照组为0.300±0.011，干扰素γ组为0.620±0.011)，差异均有显著性意义(P < 0.000 1)，见图4。

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子宫螺旋动脉重铸顺利进行是维持正常妊娠的必要条件之一[1]。子宫螺旋动脉重铸异常与子痫前期、胎儿生长受限、晚期流产和早产有关[2-3]。子宫螺旋动脉重铸过程中血管平滑肌细胞大量丢失，最终完全被类纤维蛋白所取代[4-5]，主要是在蜕膜自然杀伤细胞和绒毛外滋养细胞的作用下，血管平滑肌细胞发生迁移、凋亡以及去分化等一系列生物学功能改变而导致的[6]。如果血管平滑肌细胞生物学功能改变失衡，子宫螺旋动脉无法被改造成高灌注、低阻力的血管以满足胎儿血液供应[1]。由此可见，血管平滑肌细胞的生物学功能与子宫螺旋动脉重铸的顺利完成息息相关。
子宫螺旋动脉重铸的触发因素尚不清楚，但是越来越多的证据表明，在妊娠早期缺失绒毛外滋养细胞的情况下，蜕膜自然杀伤细胞便聚集于子宫螺旋动脉周围，并分泌干扰素γ、血管生成素Ang-1、Ang-2和血管内皮生长因子C等一系列细胞因子[7-8]。干扰素γ是子宫螺旋动脉重铸的关键调节因子[9-10]，介导血管平滑肌细胞的细胞外基质降解从而促进血管平滑肌细胞层的分离，导致重铸过程中血管平滑肌细胞的丢失[11-12]，然而，干扰素γ调节血管平滑肌细胞层完整性的具体机制尚不完全清楚。
焦亡是一种炎症性程序性细胞死亡，参与了多种生物和病理生理过程，近年来引起了人们的广泛关注和研 究[13]。有研究表明，干扰素γ的释放能够激活多种细胞类型中的炎性小体引发细胞焦亡，在抗病毒、抗肿瘤、免疫调控等多种病理生理过程中发挥重要作用[14-18]。
干扰素γ是否也能通过焦亡影响血管平滑肌细胞功能参与子宫螺旋动脉重铸尚未明确，该研究以血管平滑肌细胞为研究对象，探讨干扰素γ对血管平滑肌细胞迁移、凋亡的影响，为寻找子宫螺旋动脉重铸机制提供新的理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1    设计   体外细胞学实验，各实验均重复3次。
1.2   时间及地点   实验于2022年6月至2023年2月在西南医科大学公共实验技术中心免疫学技术平台完成。
1.3   材料
1.3.1   实验试剂   人血管平滑肌细胞为西南医科大学公共实验技术中心免疫学技术平台保存；TUNEL试剂盒购自瑞士罗氏公司；Annexin V-PE/7-AAD流式试剂盒购于中国三箭公司；引物序列合成、制作由ThermoFisher公司完成；DMEM高糖培养基和胎牛血清购于美国Gibco公司；胰蛋白酶-EDTA消化液和青链霉素混合液购于中国碧云天公司；RNA提取试剂盒(TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit)和反转录试剂盒(PrimeScript™ II 1st Strand cDNA Synthesis Kit)购于日本Takara公司；实时荧光定量PCR试剂盒(AceQ® qPCR SYBR Green Master Mix)购于中国Vazyme公司；干扰素γ购于美国Sigma公司；核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)兔来源抗体、cleaved N-terminal Gasdermin D(GSDMD)兔来源抗体和β-actin兔来源抗体购于英国Abcam公司；caspase-1兔来源抗体购于美国CST公司；羊抗兔IgG二抗购于美国Sigma公司。
1.3.2   实验仪器   超净工作台、生物安全柜购自上海博讯实业有限公司；倒置显微镜及照相系统购自日本Nikon公司；Transwell(膜孔径8 μm)购自美国Costar公司；二氧化碳培养箱购自日本Sanyo公司；流式细胞仪购自美国Beckman公司；AB Step One plus Real Time PCR System购自美国Applied Biosystems AB公司；电泳仪购自美国Bio-Rad公司；凝胶成像仪稳压DNA电泳仪购自中国Tanon公司；GDS8000凝胶扫描系统购自美国UVP公司。
1.4   实验方法
1.4.1   血管平滑肌细胞的培养及分组   第3代血管平滑肌细胞接种于T25培养瓶中，在37 ℃、相对湿度100%、体积分数5%CO2培养箱中，用含体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基培养，待细胞培养至对数生长期时开始分组干预。对照组继续予以DMEM培养基培养24 h，干扰素γ组则在DMEM培养基内加入干扰素γ(10 ng/mL)孵育24 h[19-20]，每组3个样本。
1.4.2   Transwell实验检测血管平滑肌细胞的迁移能力   收集上述两组细胞，消化，用PBS和无血清DMEM培养基先后洗涤1次，用无血清DMEM培养基悬浮细胞，计数，调整细胞浓度为5×107 L-1。将Transwell小室放置于24孔板中，在下室加入500 μL含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基，上室加入200 μL细胞悬液，继续在孵箱培养24 h，取出Transwell小室，吸去培养液，PBS洗2遍，将小室下表面浸泡在70%甲醇溶液中固定30 min，用结晶紫染色20 min，显微镜下观察，计算侵袭的细胞数，计数中间和四周5个视野，取平均值。
1.4.3   荧光TUNEL实验及流式细胞术检测血管平滑肌细胞的凋亡率  
(1)荧光TUNEL实验：收集上述两组细胞，分别用含0.3%TritonX-100的PBS室温孵育8 min，1×PBS洗涤3次，每次3 min；按照试剂说明书配制TUNEL反应混合液并充分混匀，加入50 μL TUNEL反应混合液于样本上，放入湿盒，于恒温培养箱中孵育60 min，1×PBS洗涤3次，每次3 min；加入50 μL荧光素标记POD，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37 ℃×30 min，1×PBS洗涤3次，每次3 min；滴加DAPI避光孵育15 min，1×PBS洗涤4次，每次5 min，洗去多余的DAPI；用含抗荧光淬灭剂的封片液封固，在激光扫描共聚焦显微镜下观察采集图像。
(2)流式细胞术：收集上述两组细胞，加入7-AAD染液，混匀；室温、避光反应5-15 min；加入450 μL Binding Buffer，混匀；加入1 μL Annexin V-PE，混匀；室温、避光反应5-15 min；1 h内上流式细胞仪检测。Annexin V-PE橙红色荧光，激发波长Ex=488 nm，发射波长Em=578 nm；7-AAD红色荧光，激发波长Ex=546 nm，发射波长Em=647 nm。

1.4.4   qPCR检测血管平滑肌细胞中焦亡因子mRNA 水平   收集上述两组细胞，使用1×PBS清洗1次，消化，4 ℃、8 000×g离心2 min，弃上清，加入适量的裂解Buffer RL，使用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀，室温静置2 min。将gDNA Eraser Spin Column安放到2 mL的Column Tube上，将裂解液转入到gDNA Eraser Spin Column中，12 000 r/min离心1 min，弃gDNA Eraser Spin Column，保留2 mL Tube中的滤液，向滤液中加入等体积的体积分数70%乙醇，混合均匀，立即将混合液全部转入到RNA Spin Column中，12 000 r/min离心1 min，弃滤液。将500 μL的Buffer RWA加入至RNA Spin Column中，12 000 r/min离心30 s，弃滤液。将500 μL的Buffer RWB加入至RNA Spin Column中，12 000 r/min离心30 s，弃滤液。将RNA Spin Column重新安置于2 mL Column Tube上，12 000 r/min离心2 min。将RNA Spin Column安置于1.5 mL的 RNase Free Column Tube上，在RNA Spin Column膜中央处加入50-200 μL的RNase Free dH2O，室温静置5 min，12 000 r/min离心2 min洗脱RNA，进行定量分析并调平后，用反转录试剂盒合成cDNA。反转录条件为：65 ℃变性5 min，30 ℃ 10 min，95 ℃ 5 min，冰上冷却。引物序列见表1。PCR扩增条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，重复循环40次；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，进行熔解曲线分析。以GAPDH为内参照，2-ΔΔCt法计算各组NLRP3和caspase-1 mRNA的相对表达量。

1.4.5   Western blot检测血管平滑肌细胞中焦亡蛋白水平   根据实验分组处理细胞后，吸掉6孔细胞板培养基上清，每孔加入1 mL预冷的PBS清洗细胞3次，RIPA裂解获得总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，将蛋白放入沸水中进行沸水浴10 min使蛋白变性，变性完后冷却至室温再放入-20 ℃保存。制备电泳胶，电泳分离，电转移，湿法转膜转移蛋白条带至PVDF膜。将膜放入Western封闭液中室温下封闭2 h，分别加入NLRP3、caspase-1、cleaved N-terminal GSDMD、β-actin一抗工作液(稀释比例：1∶1 000)于4 ℃冰箱过夜；TBST缓冲液(pH=7.4)洗膜5次，每次5 min；加入二抗(稀释比例：1∶1 000)室温下孵育
1.5 h；TBST洗膜5次，每次5 min；电化学发光(ECL)显影，Image J软件对条带进行灰度分析。
1.5   主要观察指标   干扰素γ处理后血管平滑肌细胞的迁移能力、凋亡率变化以及NLRP3、caspase-1、cleaved N-terminal GSDMD焦亡相关蛋白的表达。

1.6   统计学分析   采用SPSS 19.0统计软件进行分析，结果以x±s表示，两组数据比较采用非配对t检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过西南医科大学生物统计学专家审核。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

该实验证明炎症因子干扰素γ可以显著提高血管平滑肌细胞的迁移能力，促进其凋亡；干扰素γ使血管平滑肌细胞中NLRP3及caspase-1的mRNA、蛋白表达明显上调，cleaved N-terminal GSDMD焦亡蛋白也明显上调，表明干扰素γ对血管平滑肌细胞迁移、凋亡生物学功能的调控可能是通过NLRP3/caspase-1/GSDMD介导的焦亡途径所实现的。
子宫螺旋动脉是子宫动脉最小的末端分支，从子宫肌层延伸到蜕膜，在妊娠期间将氧气和营养物质输送到胎盘，并最终输送给胎儿。在妊娠前20周，为了满足胎儿生长的高营养需求以及清除代谢废物，子宫螺旋动脉必须完成重铸来适应母体血容量和流量的急剧增加[19]。成功的子宫螺旋动脉重铸是通过一系列连续的生理改变完成的，包括血管扩张、内皮细胞肿胀、血管平滑肌细胞层破坏和丢失、纤维蛋白样基质沉积和绒毛外滋养细胞侵袭。在重铸完全的子宫螺旋动脉中，血管平滑肌细胞被纤维蛋白样物质取代而彻底消失。至此，子宫螺旋动脉最终形成缺乏血管舒缩控制的宽孔通道，完成由高阻力、低流量的血管向低阻力、高流量的血管转变，使得母体输送到胎盘绒毛间隙的血液至少增加三四倍，从而保障胎儿在妊娠期发育、成长所必须的血氧供应[1，21-23]。
既往的研究认为，子宫螺旋动脉重铸主要依赖于绒毛外滋养细胞。然而，越来越多的研究表明，绒毛外滋养细胞并非子宫螺旋动脉重铸启动的主要因子。根据绒毛外滋养细胞在母体蜕膜中出现与否，子宫螺旋动脉重铸过程可被分为绒毛外滋养细胞侵袭之前由母体介导的“蜕膜相关”阶段以及随后的“滋养层相关”阶段。蜕膜自然杀伤细胞是妊娠早期蜕膜中最丰富的淋巴细胞，承担了启动子宫螺旋动脉重铸过程的重要作用[24-26]。在“蜕膜相关”阶段，蜕膜自然杀伤细胞包围子宫螺旋动脉，通过分泌血管生成素Ang-1、Ang-2、血管内皮生长因子C和干扰素γ等多种细胞因子破坏血管平滑肌细胞的完整性，导致血管平滑肌细胞大量丢失[7-8，11-12]。既往关于子宫螺旋动脉重铸的研究大都集中于绒毛外滋养细胞及蜕膜自然杀伤细胞，对于子宫螺旋动脉重铸过程中血管平滑肌细胞丢失的具体机制知之甚少。
干扰素γ是Ⅱ型干扰素的唯一成员，干扰素γ作为一种具有广泛生物活性的细胞因子，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等作用[19，27]。干扰素γ通过与同源受体(干扰素γ receptor，IFNGR)结合，激活JAK-STATI信号通路，启动靶基因的转录，从而对多种细胞发挥多重生物学效应[28-29]。如：在免疫细胞CD8 T细胞中，干扰素γ诱导前体T细胞向效应T细胞分化，进一步增强其细胞毒性和运动性，并参与免疫记忆的形成；在肿瘤细胞中，干扰素γ通过细胞凋亡、坏死性凋亡诱导细胞停止生长直接抑制肿瘤细胞和增加免疫细胞的杀伤作用间接抑制肿瘤细胞这两种方式发挥抗肿瘤作用[30]；在病毒感染时，干扰素γ通过上调胆固醇25-羟化酶(cholesterol 25-hydroxylase，CH25H)降低病毒颗粒对靶细胞的亲和力从而改变病毒病原体在体内的组织向性，降低了病毒在体内复制的机会[31]。
在妊娠期间，母胎界面的干扰素γ主要由蜕膜自然杀伤细胞产生[32-33]。既往研究表明，蜕膜自然杀伤细胞来源的干扰素γ在启动子宫螺旋动脉重铸、促进血管平滑肌细胞层的破坏及丢失中有着重要作用[34]，但其具体机制不完全清楚。目前认为，子宫螺旋动脉重铸中血管平滑肌细胞的破坏和丢失主要通过细胞凋亡和远离血管壁的迁移完成，这两种生物学功能改变可能在子宫螺旋动脉重塑的不同阶段各自或同时发生[35-36]。SMITH等[33]通过TUNEL染色实验在经历重铸的子宫螺旋动脉中观察到部分血管平滑肌细胞发生凋亡，但这一研究没有被量化。BULMER等[37]观察到子宫螺旋动脉重铸期间血管平滑肌细胞从血管壁向蜕膜间质迁移，且子宫螺旋动脉壁外部分血管平滑肌细胞更容易迁移出血管，绒毛外滋养细胞的存在增强了血管平滑肌细胞的迁移，他们证明了血管平滑肌细胞迁移是子宫螺旋动脉重铸过程中血管平滑肌细胞从子宫螺旋动脉壁丢失的机制之一。
在此次研究中，采用体外实验比较凋亡率变化，实验结果证实经干扰素γ处理后的血管平滑肌细胞凋亡率显著上升。既往实验表明，封闭血管平滑肌细胞中IFNGR后，凋亡率和迁移率降低[11]。该研究也证明经干扰素γ处理后，血管平滑肌细胞的迁移能力显著上升。由此可以推测，干扰素γ可能通过提升血管平滑肌细胞的凋亡、迁移能力促进子宫螺旋动脉中血管平滑肌细胞层的破坏及丢失，从而参与子宫螺旋动脉重铸。
焦亡是细胞的一种炎症性程序性死亡，首次在感染沙门氏菌的巨噬细胞中被发现[38]。目前，已经确定的诱导焦亡的信号通路主要有4种，包括典型和非典型炎性小体途径、凋亡caspase介导的途径和基于颗粒酶的途径[39]。其中，典型炎性小体途径是最广为人知的一种，此途径通过损伤相关分子模式(damage-associated molecular molecules，DAMPs)直接组装炎症小体NLRP3并激活半胱氨酸蛋白酶caspase-1，使GSDMD蛋白的N端结构域片段易位至细胞膜形成β-桶状跨膜孔，导致质膜迅速破裂，释放细胞内容物和大量炎症因子，并向邻近细胞发送促炎信号，招募炎症细胞并诱导炎症反应，最终导致细胞死亡[40-41]。
细胞焦亡在多种生理病理过程中被发现，是近年来的研究热点[13]。例如：小鼠caspase-11、人类caspase-4和人类caspase-5可识别细胞溶质脂多糖，通过切割成孔蛋白GSDMD1-5诱导细胞焦亡，其中的非典型炎症小体可抵御革兰阴性细菌[42]；焦亡通过肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡作用激活淋巴细胞，肿瘤细胞浸润于被激活的细胞毒性淋巴细胞，再通过caspase-3依赖性和非依赖性机制诱导肿瘤细胞进一步发生焦亡，从而完成一个抗肿瘤免疫的正反馈循环[43]；甘露糖介导的AMPK激活可以负性调节GSDME介导的焦亡，而GSDME介导的焦亡与化疗引起的不良反应有关，如肾毒性、肺损伤和胃肠道损伤，补充甘露糖可以减轻癌症患者化疗引起的毒副作用[44]。
然而，在产科领域中，细胞焦亡研究主要集中于妊娠并发症中，如子痫前期、胎儿生长受限。妊娠合并早发型子痫前期时胎盘滋养细胞发生焦亡比例升高，并且过度激活的未折叠蛋白反应(unfolded protein response，UPR)与NLRP3炎性小体通过硫氧还蛋白相互作用蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)相互连接可能有助于子痫前期妇女胎盘焦亡的发生。过度的内质网应激和UPR活性以及焦亡可以增强炎症级联反应，这被认为是子痫前期全身性发病的原因[45-46]。
在妊娠生理改变中，细胞焦亡鲜有研究。该研究以子宫螺旋动脉重铸这一正常妊娠生理改变过程中的关键细胞——血管平滑肌细胞为研究对象，探讨干扰素γ对血管平滑肌细胞焦亡相关蛋白的影响，结果表明，干扰素γ导致血管平滑肌细胞迁移、凋亡生物学功能改变的同时，细胞焦亡经典途径相关蛋白在转录水平及蛋白表达水平均有所增加。参考HAN等[47-48]的研究，他们都证明了NLRP3表达下降会抑制血管平滑肌细胞的迁移作用；XU等[49]则通过实验证明了NLRP3/caspase-1/GSDME焦亡途径可以介导细胞凋亡，故可以初步推测干扰素γ可能通过NLRP3/caspase-1/GSDMD焦亡途径调控血管平滑肌细胞迁移、凋亡生物学功能而参与子宫螺旋动脉重铸。然而，该研究缺乏抑制NLRP3/caspase-1/GSDMD焦亡途径时干扰素γ对血管平滑肌细胞迁移能力及凋亡率影响的实验数据。在后续的实验中将进一步完善抑制NLRP3/caspase-1/GSDMD焦亡途径时干扰素γ对血管平滑肌细胞迁移能力及凋亡率的影响，同时进行更深入的分子机制实验探究干扰素γ、血管平滑肌细胞生物学功能以及NLRP3/caspase-1/GSDMD焦亡途径三者之间的联系。
综上，该研究发现干扰素γ显著增加血管平滑肌细胞迁移及凋亡能力，同时增加血管平滑肌细胞焦亡相关蛋白NLRP3及caspase-1的mRNA和蛋白表达，上调焦亡相关蛋白cleaved N-terminal GSDMD表达。研究结果表明，干扰素γ可能通过NLRP3/caspase-1/GSDMD焦亡途径对血管平滑肌细胞迁移、凋亡产生影响从而参与子宫螺旋动脉重铸。
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文题释义：

子宫螺旋动脉重铸：妊娠时，在蜕膜自然杀伤细胞以及绒毛膜外滋养细胞的作用下，子宫螺旋动脉的肌弹性动脉壁被含有绒毛膜外滋养细胞的无定形纤维蛋白物质所取代，子宫螺旋动脉由小直径、低流量、高阻力血管重铸为大直径、高流量、低阻力血管以满足胎儿血液供应。#br#

细胞焦亡：是近年来发现并证实的一种新的炎症性程序性细胞死亡方式，其特征是依赖于炎性半胱天冬酶(主要是caspase-1，4，5，11)，细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。

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子宫螺旋动脉重铸的顺利进行是正常妊娠的必要条件，此过程发生异常往往与子痫前期、胎儿生长受限、早产等异常妊娠有关。血管平滑肌细胞通过改变各种细胞生物学功能而参与子宫螺旋动脉重铸，是此过程的关键细胞，但是目前对于此过程中该细胞发生各种生物学功能改变的具体机制还尚不清楚。细胞焦亡作为目前程序性细胞死亡的研究热点之一，在子宫螺旋动脉重铸过程中血管平滑肌细胞是否通过细胞焦亡途径参与此过程值得探讨。本研究通过体外细胞实验初步探讨了干扰素γ这一常见的炎症因子对血管平滑肌细胞迁移、凋亡的影响，并揭示了干扰素γ导致血管平滑肌细胞焦亡水平的升高，为子宫螺旋动脉重铸机制提供了新的理论依据。

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