1.1 设计 细胞学体外实验，组间比较采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点 实验于2022年5月至2023年11月在广州中医药大学第三附属医院完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞、质粒 MC3T3-E1小鼠胚胎成骨细胞[赛百慷(上海)生物技术股份有限公司 (no. iCell-m031]；pCDNA3.1对照质粒、pCDNA3.1-雌激素受体α过表达质粒、shNC、shLKB1(广州艾基生物技术有限公司)。
1.3.2 实验试剂 Compound C (CC，Dorsomorphin，大连美仑，MB4533) ；rimeScript™ RT reagent；t with gDNA Eraser (Takara，#RR047A)；SYBR Green qPCR Mix (Beyotime，#D7260)；ChIP Assay Kit(碧云天，#P2078)；TB Green Premix Ex Taq(Tli RNaseH Plus)(Takara，# RR420A)；雌激素受体α抗体、肝激酶B1抗体、AMPKα抗体、骨保护素抗体、Runx2抗体(abcam，ab32063，ab15095，ab271188，ab183910，ab236639)；磷酸化肝激酶B1抗体、p-AMPKα抗体(cell signaling technology，#3482，#50081)；CaMKK2抗体、p-CaMKK2抗体(Affinity Biosciences，#DF4793，#AF4487)；Trypsin Enzyme(Hyclone，#SH30042.01)；170kD彩色预染蛋白质分子量标准 (Thermo，#26616) ；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)(鼎国，#IH-0011)；Anti-alpha Tubulin Rabbit pAb(赛维尔，# GB11200)。HRP Conjugated Goat anti-Mouse IgG Goat Polyclonal Antibody、HRP Conjugated Goat anti-Rabbit IgG Goat Polyclonal Antibody(二抗，杭州华安生物，HA1006，HA1001)；GAPDH、β-actin(servicebio，GB11002，GB11001)；骨桥蛋白抗体(HUABIO，0806-6)。
1.3.3 实验仪器 PCR仪(伯乐，T100)；Q-PCR仪(Roche，LightCycler®96)；台式冷冻离心机(Thermo，ST16R)；微量分光光度计(奥盛仪器，Nano-300)；离心机(Thermo，LEGEND MICRO17)；酶标仪(Tecan，F50)；电泳仪(北京六一，DYY-6C)；跷跷板摇床(Kylin-Bell，ZD-9550)；水平摇床(Kylin-Bell，TS-2)；二氧化碳培养箱(Thermo，371)；生化培养箱(赛得利斯，SPX-150BE)；超声波细胞破碎仪(ULTRASONICS，F5-150N)。
1.4 实验方法
1.4.1 MC3T3-E1小鼠胚胎成骨细胞的细胞培养
(1)将MC3T3-E1细胞(5×105)注入离心管并加入5 mL的含体积分数10%胎牛血清的细胞培养液，以1 000 r/min离心5 min，去上清液，加入1 mL培养液吹打形成悬浮液，再以体积分数20%胎牛血清细胞培养液稀释，置于37 ℃、饱和湿度、体积分数5% CO2孵箱中，每天在显微镜下观察细胞生长状态，当观察培养瓶贴壁面至70%-80%融合，用0.25%胰蛋白酶消化传代。
(2)将消化传代细胞接种于6孔板(细胞数量为5×105，加入培养基2 mL)，分为空白对照组、mock组(转染pCDNA3.1对照质粒)、雌激素受体α组(转染pCDNA3.1-雌激素受体α过表达质粒)。把培养有细胞的6孔板每孔换成2 mL新鲜培养液(含有血清和抗生素的完全培养液)，将待转染的6孔板细胞，每孔加入125 µL不含抗生素和血清的DMEM培养液，按组别加入相应2.5 µg质粒，并用枪轻轻吹打混匀；再加入4 µL Lipo8000™转染试剂，用枪轻轻吹打混匀，每孔125 µL Lipo8000™转染试剂-质粒混合物，随后轻轻混匀。
(3)继续培养24 h待细胞贴壁后，孔内更换为加入含药或不含药的新鲜成骨诱导培养基，每2 d换液1次。
1.4.2 RT-qPCR检测雌激素受体α对MC3T3-E1细胞中肝激酶B1、CaMKKβ和AMPKα1 mRNA表达的影响 将上述3组细胞培养7 d后，弃去培养液，用Trizol法抽提总RNA，使用微量分光光度计鉴定得到RNA的浓度，每组取1.0 μg总RNA，再将mRNA反转录成cDNA保存，PCR体系20 µL。PCR 仪反应条件设置为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃延伸30 s，共进行40个循环，从PCR仪中导出Ct值(热循环仪检测到反应体系中荧光信号的强度值)，采用2-ΔΔCt法(ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组，2-ΔΔCt即为两组的差异)并以GAPDH为内参计算上述指标的相对表达量。引物设计见表1。
1.4.3 Western blot检测雌激素受体α过表达对MC3T3-E1细胞中肝激酶B1、磷酸化肝激酶B1、CaMKKβ、p-CaMKKβ和p-AMPKα1蛋白表达的影响 收集成骨诱导14 d后的各组细胞，将细胞PBS洗2遍，加入RIPA(含1% PMSF)，用细胞刮刀刮下细胞，收集在1.5 mL EP管中，冰上摇晃60 min，于4 ℃、12 000 r/min下离心20 min，取上清至新的EP 管中，进行后续的电泳、Western，按照Bradford蛋白浓度测定试剂盒(去垢剂兼容型)操作要求测定蛋白浓度。将长短玻璃板对齐后按照方向垂直卡在制胶架子上。配制10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将胶加至适量高度(绿线附近)后，轻柔加上双蒸水压胶。当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝集。等待3 min使胶充分凝固倒去胶上层水并用滤纸将水吸干。配制5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶后将梳子插入浓缩胶中。待浓缩胶凝固后，将含胶的玻璃板加入电泳夹卡紧，放入电泳槽(电极红对红，黑对黑)。取出上样样品与5×SDS上样缓冲液按4∶1比例混合，混匀后沸水中煮5 min使蛋白变性。加足够的电泳液后按等量蛋白上样。电泳：80 V跑过浓缩胶后转换电压至120 V，待溴酚蓝跑至胶板底部刚好没有跑出即可。将夹子打开使黑的一面保持水平，在上面依次垫海绵垫、滤纸、胶、PVDF膜(经甲醇活化)、滤纸、海绵垫；同时将电泳液换成转移液。将电流调整到恒流200 mA，转移1-3 h。根据蛋白分子质量的大小，越大的蛋白转膜时所用的时间也越长，但太久则会转透到滤纸上。取出膜，并做好正反面标记，在TBST中清洗1 min，然后用5%脱脂牛奶封闭液室温封闭2 h。用封闭液将对应的一抗(肝激酶B1、磷酸化肝激酶B1、CaMKKβ、p-CaMKKβ、β-actin均稀释成1∶1 000)，温育1.5 h或4 ℃孵育过夜。用TBST洗3次，每次5 min 。用封闭液将二抗稀释成1∶1 000温育1.5 h。用TBST清洗4次，每次5 min。将ECL曝光液按A液∶B液1∶1混匀后均匀覆盖在整片膜上，反应2 min放入曝光仪曝光检测。
1.4.4 Chip-qPCR检测雌激素受体α与肝激酶B1启动子互作
(1)交联、解交联：细胞培养于10 cm培养皿(细胞数量为1.0×107，培养液10 mL)中，取270 μL 37%甲醛加入，使得甲醛终质量浓度为10 g/L，37 ℃处理10 min。再加入1.1 mL Glycine Solution (10×)，轻轻混匀，室温放置5 min，期间用5-10 mL含冰浴预冷的1 mmol/L PMSF的PBS反复洗涤细胞2次。
(2)裂解、超声：完成上述交联、解交联过程后，细胞刮下置于加入1 mL冰浴预冷的含1 mmol/L PMSF的PBS的离心管中并进行细胞计数，将细胞分装成每管约1×106，4 ℃，(800-1 000)×g离心一两分钟，充分沉淀细胞后，用0.2 mL含有1 mmol/L PMSF的SDS Lysis Buffer重悬，在冰浴上孵育10 min裂解细胞。超声处理后 (冰浴工作6 s，静息10 s时冰浴降温，持续10 min，20%功率)，将染色质切至200-1 000 bp大小。
(3)免疫沉淀：①对经超声处理的样品行4 ℃，(12 000-14 000)×g离心5 min，取约0.2 mL上清至2 mL离心管中冰浴，在加入1.8 mL含有1 mmol/L PMSF的ChIP Dilution Buffer以稀释经过超声处理的样品，最终为2 mL，取出20 μL样品作为Input用于后续检测。②余近2 mL样品加入70 μL Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA，4 ℃缓慢转动或摆动混匀30 min。③再次行4 ℃，1 000×g离心1 min，转移上清至另一新的2 mL离心管，参考抗体加入适量一抗， 4 ℃缓慢转动或摆动混匀过夜，用兔lgG抗体作为阴性对照，加入60 μL Protein A+G Agarose/Salmon Sperm DNA，在4 ℃缓慢转动或摆动混匀60 min，以沉淀一抗识别的蛋白或相应的复合物。④4 ℃，1 000×g左右离心1 min后，小心去除液体，勿触及沉淀，随后依次用Low Salt Immune Complex Wash Buffer、High Salt Immune Complex Wash Buffer、LiCl Immune Complex Wash Buffer对沉淀各洗涤1次，再以TE Buffer洗涤2次，每次洗涤液的用量为1 mL，每次在4 ℃缓慢转动或摆动洗涤3-5 min，随后4 ℃、1 000×g左右离心1 min，去除液体，切勿触及沉淀。
(4)洗脱、解交联：完成上述所有洗涤步骤后，加入250 μL Elution buffer，Vortex混匀，室温转动或摆动继续洗脱3-5 min，1 000×g离心1 min后，转移上清至一新离心管。沉淀中再加入250 μL Elution buffer。Vortex混匀，室温转动或摆动继续洗脱3-5 min，1 000×g离心1 min，转移上清至前次上清离心管中合并(约500 μL)。合并后上清离心管中加入20 μL 5 mol/L NaCl，65 ℃加热4 h解交联。将免疫沉淀取出作为Input的20 μL样品，加入1 μL 5 mol/L NaCl，65 ℃加热4 h，同样行解交联处理。对解交联后获得的约520 μL样品中加入10 μL 0.5 mol/L EDTA、20 μL 1 mol/L Tris pH 6.5、1 μL 20 mg/mL蛋白酶K，混匀45 ℃孵育60 min后，以DNA纯化回收试剂盒纯化。
(5)Q-PCR：纯化后DNA行Q-PCR。PCR体系30 µL，见表2。PCR仪反应条件设置为：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，延伸60 ℃ 30 s，40个循环。以ΔCt值行统计分析，ΔCt=Ct (Ch IP)-[Ct (Input)-Log2 (Input稀释倍数)]，平均相对表达量 (2-ΔΔCt) 表示各组间相对量。肝激酶B1 启动子(promoter)引物序列：F：5’-CTG GGC TGG ATC TCT TTA G-3’，R：5’-AAG CAA GCG ACT GTA AGG-3’。
1.4.5 双荧光素酶实验证明雌激素受体α与肝激酶B1启动子区域互作激活其转录表达
(1)细胞分6组：pCDNA3.1(mock)+pGL3组、pCDNA3.1+pGL3-LKB1 promoter-WT组、pCDNA3.1+pGL3-LKB1 promoter-Mut组、pCDNA3.1-FLI1(雌激素受体α)+pGL3组、pCDNA3.1-FLI1(雌激素受体α)+ pGL3-LKB1 promoter-WT组、pCDNA3.1-FLI1(雌激素受体α)+ pGL3-LKB1 promoter-Mut组。野生型(WT)、突变型(Mut)两种基因型启动子序列见表3。
(2)接种细胞：将细胞培养基、0.25%胰酶和PBS平衡至室温后，弃去旧培养基，PBS洗2遍，加入1 mL Trypsin Enzyme(可浸泡细胞后弃去)，置于室温消化一两分钟。再次加入培养基终止消化，吹打收集细胞，以离心条件1 000 r/min、4 min，离心结束后弃上清，适量培养基重悬细胞(0.5×105，0.5 mL)加入24孔板中，使得第2天细胞融合度达60%-70%。
(3)转染：按 Lipofectamine 2000 试剂盒说明书的步骤进行转染试验。
(4)蛋白提取：①裂解细胞：吸去细胞培养基，用PBS缓慢轻柔地洗涤1次，洗去残留的培养基，然后将液体全部吸弃。②加入适量的1×Cell Lysis Buffer，室温下静置裂解15 min，吹打并吸取全部细胞裂解产物至1.5 mL离心管中，14 000×g离心15 min，取上清用于后续检测。③Firefly Luciferase反应检测：小心吸取20 μL细胞裂解上清依次加入至96孔板中，再加入100 μL平衡至室温的含有底物的Firefly Luciferase Reaction Buffer，迅速混匀后立即于化学发光仪或酶标仪中检测Firefly Luciferase报告基因活性。④Renilla Luciferase反应检测：在以上反应液中加入100 μL现配制的Renilla检测工作液迅速混匀后立即于化学发光仪或酶标仪中检测Renilla Luciferase报告基因活性。
(5)以空载质粒pGL3-Basic和pRL-TK转染检测得到的荧光素酶活性值作为参照基底处理结果，计算各组所测的荧光素酶活性值分别与之对比，求得相应的比值，从而比较转录活性差异，用Graphpad prism作图并分析。
1.4.6 雌激素受体α通过调控肝激酶B1转录表达激活AMPK信号通路 细胞分3组：mock+shNC组、雌激素受体α+shNC组、雌激素受体α+shLKB1组，转染14 d后收集以上各组细胞，进行Western blot检测肝激酶B1、磷酸化肝激酶B1、p-AMPKα1蛋白的表达水平。Western blot检测方法同上述1.4.3。
1.4.7 Western blot检测不同浓度梯度AMPK抑制剂干预AMPK信号通路相关蛋白及成骨分化相关蛋白的表达
(1)细胞分4组：mock组、雌激素受体α组、雌激素受体α+5 μmol/L Compound C (AMPK抑制剂) 组、雌激素受体α+10 μmol/L Compound C组，经转染pCDNA3.1-雌激素受体α过表达质粒24 h后，其中两组给予不同浓度AMPK抑制剂处理14 d。
(2)在干预14 d后收集以上各组细胞，进行Western blot检测AMPK信号通路相关蛋白AMPKα1、p-AMPKα1、成骨分化相关蛋白骨保护素、骨桥蛋白、Runx2蛋白的表达水平。
1.4.8 碱性磷酸酶染色及活性检测各组细胞碱性磷酸酶的活性情况
(1)细胞分4组：mock组、雌激素受体α组、雌激素受体α+5 μmol/L Compound C组、雌激素受体α+10 μmol/L Compound C组，经转染pCDNA3.1-雌激素受体α过表达质粒24 h后，其中2组给予不同浓度AMPK抑制剂处理14 d。
(2)碱性磷酸酶活性测定：干预14 d后收集以上各组细胞，将细胞培养基、0.25%胰酶和PBS平衡至室温后，弃去旧培养基，PBS洗2遍，加入适量的胰酶，置于37 ℃消化一两分钟。加入培养基终止消化，吹打收集细胞。调节细胞密度，接种于6孔板，每组3个重复。待细胞长满后，吸取培养液，1 000-1 500 r/min离心10 min，取上清进行测定。各孔加入试剂量及水浴时间见表4。轻轻振摇孔板混匀，波长520 nm酶标仪测定各孔吸光度值。
碱性磷酸酶活力=测定吸光度值-空白吸光度值/标准吸光度值-空白吸光度值×标准品浓度(0.02 mg/mL)×100 mL样本测试前稀释倍数
(3)碱性磷酸酶染色：细胞培养及药物处理方法同上一部分，药物诱导14 d后进行碱性磷酸酶染色。弃去旧PBS清洗干净，加入碱性磷酸酶固定液固定3 min固定10-15 min，PBS清洗。取AS-BI染色液：FBB染色液按1∶1混合，配置碱性磷酸酶孵育液，即配即用。滴加配制好的碱性磷酸酶孵育液，放入湿盒中，避光孵育15-20 min，水洗。入核固红染色液复染3-5 min后，进行水洗、镜检。
1.4.9 茜素红染色检测矿化结节形成情况 细胞培养及药物处理方法同1.4.8部分，药物诱导21 d后进行茜素红染色。弃细胞培养基，PBS洗涤3次，用40 g/L多聚甲醛固定10 min，弃固定液，用ddH2O洗3次，将水完全吸干净后慢慢加入茜素红染色液，染色20-30 min，弃染色液，用ddH2O洗5次，每孔加入适量ddH2O防止干燥，显微镜下观察拍照。
1.4.10 CCK8法探究Compound C对过表达雌激素受体α后MC3T3-E1细胞增殖的影响
(1)细胞处理及分组：①将MC3T3-E1细胞消化下来，重悬，调整细胞浓度为5×107 L-1细胞液，接种100 μL至96孔板，置于37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中，培养过夜。②实验分为对照组、mock组、雌激素受体α (pCDNA3.1-雌激素受体α过表达质粒)组、雌激素受体α+5 μmol/L Compound C组和雌激素受体α+10 μmol/L Compound C组。③按实验分组转染雌激素受体1及对应空载，转染24-48 h后，加入对应浓度Compound C处理16 h。每组5个重复。
(2)检测与读数：①将基础培养基与CCK8按照1 000∶100的比例配制成混合液后，弃掉旧培养基，PBS洗涤1次，每孔加100 µL混合液，37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中孵育0.5 h。②450 nm下检测吸光度值。
1.5 主要观察指标 ①雌激素受体α过表达对MC3T3-E1细胞中肝激酶B1、CaMKKβ(mRNA和蛋白)、AMPKα1 mRNA的表达及磷酸化肝激酶B1、磷酸化CaMKKβ、磷酸化AMPKα1蛋白表达的影响。②雌激素受体α与肝激酶B1启动子区域互作激活其转录表达的结果。③雌激素受体α过表达单独或与shLKB1共转染MC3T3-E1细胞对肝激酶B1、磷酸化肝激酶B1、p-AMPKα1蛋白表达的影响。④Compound C干预后AMPK信号通路相关蛋白及成骨分化相关蛋白的表达水平。⑤各组细胞碱性磷酸酶染色和茜素红染色结果。⑥Compound C对过表达雌激素受体α后MC3T3-E1细胞增殖的影响。
1.6 统计学分析 采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。所有数据均呈正态分布，方差齐，组间均数的比较采用成组样本的单因素方差分析法，LSD法检验对组间样本均数进行两两比较，P < 0.05为差异有显著性意义。文章的统计学方法已经广州中医药大学第三附属医院生物统计学专家审核。
