重组慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质构建转基因组织工程材料

doi:10.12307/2025.501

中国组织工程研究 ›› 2025, Vol. 29 ›› Issue (23): 4851-4858.doi: 10.12307/2025.501

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重组慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质构建转基因组织工程材料

宁寅宽1，刘林志1，周次腊2，隆宇斌3

邵阳市中心医院，1血管外科，2内分泌科，3脊柱外科，湖南省邵阳市 422000

收稿日期:2024-04-02 接受日期:2024-06-24 出版日期:2025-08-18 发布日期:2024-09-25
通讯作者: 隆宇斌，硕士，邵阳市中心医院脊柱外科，湖南省邵阳市 422000
作者简介:宁寅宽，男，1986年生，2015年桂林医学院毕业，硕士，主治医师，主要从事血管与骨组织工程、生物矿化、基因治疗研究。
基金资助:
广西壮族自治区自然科学基金项目 (2014GXNSFAA118263)，项目参与人：宁寅宽；邵阳市科技计划项目(2022NS4150)，项目负责人：宁寅宽

Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells transfected with recombinant lentivirus and decalcified bone matrix to construct transgenic tissue engineering materials

Ning Yinkuan1, Liu Linzhi1, Zhou Cila2, Long Yubin3

1Department of Vascular Surgery, 2Department of Endocrinology, 3Department of Spinal Surgery, Shaoyang Central Hospital, Shaoyang 422000, Hunan Province, China

Received:2024-04-02 Accepted:2024-06-24 Online:2025-08-18 Published:2024-09-25
Contact: Long Yubin, Master, Department of Spinal Surgery, Shaoyang Central Hospital, Shaoyang 422000, Hunan Province, China
About author:Ning Yinkuan, Master, Attending physician, Department of Vascular Surgery, Shaoyang Central Hospital, Shaoyang 422000, Hunan Province, China
Supported by:
Natural Science Foundation of Guangxi Zhuang Autonomous Region, No. 2014GXNSFAA118263 (to NYK); Shaoyang Science and Technology Plan Project, No. 2022NS4150 (to NYK)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

增强型绿色荧光蛋白：是一种荧光标记工具，将增强型绿色荧光蛋白与目的基因融合后通过基因载体转染细胞，用于监测目的基因的位置和表达情况。
转基因组织工程材料：种子细胞、细胞因子和支架材料是组织工程的三要素。骨髓间充质干细胞的获取、扩增相对容易，又避免了胚胎干细胞的伦理学问题，是比较理想的种子细胞。经处理的松质脱钙骨支架含有天然的骨形态发生蛋白细胞因子。增强型绿色荧光蛋白重组慢病毒转染骨髓间充质干细胞与脱钙骨支架复合培养可以体外构建转基因组织工程材料。

摘要
背景：缺损组织的修复重建受限于自体或异体可替代移植材料的来源问题而导致临床应用受限，转基因干细胞和组织工程材料研究开辟了新的治疗思路。
目的：探究增强型绿色荧光蛋白重组慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞在体外的生物学特性以及与脱钙骨基质体外构建转基因组织工程材料的生物矿化特性。
方法：细胞贴壁及密度离心法获得兔骨髓间充质干细胞，增强型绿色荧光蛋白重组慢病毒以感染复数为100转染第5代兔骨髓间充质干细胞，体外观察转染细胞与未转染细胞的增殖能力、细胞表型、细胞周期以及成骨诱导后碱性磷酸酶、Runx2、骨钙素表达的差异；增强型绿色荧光蛋白重组慢病毒转染骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质在体外构建转基因组织工程材料，对其进行扫描电镜观察及元素能谱分析。

结果与结论：增强型绿色荧光蛋白重组慢病毒成功转染骨髓间充质干细胞后，在转染24，48 h细胞增殖较未转染细胞缓慢 (P < 0.05)；在转染72 h后，细胞表型未发生变异，细胞周期、细胞增殖能力以及成骨诱导后碱性磷酸酶、Runx2、骨钙素表达量与未转染细胞无明显差异(P > 0.05)；增强型绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞在脱钙骨基质支架上有较好的生物相容性，根据荧光表达强度推测目的基因在2周左右发挥最大生物学功能，且出现了钙磷矿化物沉积，体现出优越的生物矿化特性。

https://orcid.org/0000-0003-4771-6930 (宁寅宽)；https://orcid.org/0009-0000-9380-5577 (隆宇斌)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 重组慢病毒载体, 增强绿色荧光蛋白, 骨髓间充质干细胞, 基因治疗, 生物学特性

Abstract: BACKGROUND: The use of autologous or allogeneic transplantation materials for tissue repair and reconstruction is limited and carries limitations in clinical applications. Transgenic stem cells and tissue engineering materials offer new therapeutic possibilities.
OBJECTIVE: To investigate the in vitro biological characteristics of enhanced green fluorescent protein recombinant lentivirus transfected into rabbit bone marrow mesenchymal stem cells and the biommineralization characteristics of transgenic tissue engineering materials constructed using decalcified bone matrix.
METHODS: Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells were obtained through adherent culture and density gradient centrifugation. The fifth-generation bone marrow mesenchymal stem cells were transfected with enhanced green fluorescent protein recombinant lentivirus at the optimal multiplicity of infection (MOI=100). The differences in cell proliferation capacity, cell phenotype, cell cycle, alkaline phosphatase expression, osteogenic transcription factor (Runx2) expression, and osteocalcin gene expression after osteogenesis were observed between the transfected cells and non-transfected cells in vitro. The micromorphology and elemental energy spectrum analysis of the transgenic tissue engineering materials constructed from cells and decalcified bone matrix scaffold were also observed.
RESULTS AND CONCLUSION: Bone marrow mesenchymal stem cells transfected with enhanced green fluorescent protein recombinant lentivirus showed that cell proliferation at 24 and 48 hours after transfection was slower than that of untransfected cells (P < 0.05). After 72 hours, the cell phenotype remained unchanged, and the expressions of alkaline phosphatase, Runx2, and osteocalcin after osteogenic induction were not significantly different from those of untransfected bone marrow mesenchymal stem cells (P > 0.05). The transgenic tissue engineering materials constructed in vitro using enhanced green fluorescent protein recombinant lentivirus transfected bone marrow mesenchymal stem cells and decalcified bone matrix showed good biocompatibility on the decalcified bone matrix scaffold. Based on fluorescence expression intensity, it was estimated that the target gene would exert its maximum biological function in about 2 weeks, and calcium phosphate deposits would continue to appear, demonstrating superior biomineralization characteristics.

Key words: recombinant lentiviral vector, enhanced green fluorescent protein, bone marrow mesenchymal stem cell, gene therapy, biological characteristics

中图分类号:

宁寅宽, 刘林志, 周次腊, 隆宇斌. 重组慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质构建转基因组织工程材料[J]. 中国组织工程研究, 2025, 29(23): 4851-4858.

Ning Yinkuan, Liu Linzhi, Zhou Cila, Long Yubin. Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells transfected with recombinant lentivirus and decalcified bone matrix to construct transgenic tissue engineering materials[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2025, 29(23): 4851-4858.

图/表（结果） 8

2.1 BMSCs在显微镜下的形态 两组细胞形态和生长情况基本一致，单个细胞呈长梭形，细胞轮廓较清楚，呈涡旋状、放射状密集排列。实验组细胞转染24 h后在倒置荧光显微镜下观察到荧光，转染72 h后荧光标记细胞形态清晰，转染效率高达90%，转染后细胞未见明显肿胀和死亡，对照组细胞未观察到荧光，见图1。

2.2 MTT比色法检测BMSCs增殖情况 实验组细胞转染第1，2天，细胞增殖能力较对照组缓慢 (P < 0.05)。从第3天开始，实验组细胞进入指数生长期，第7天达到最高峰，进入平台期，72 h后两组细胞增殖无统计学意义(P > 0.05)，见图2。

2.3 BMSCs表面标志物表达 EGFP重组慢病毒转染细胞72 h后，流式细胞仪分析显示两组细胞表面标志物CD44、CD29均呈阳性，CD45阴性。两组细胞表面标志物CD29、CD44、CD45表达量无统计学差异(P > 0.05)，见表2。

2.4 BMSCs的细胞周期 EGFP重组慢病毒转染细胞72 h后，流式细胞仪分析显示两组G1、S、G2各期细胞所占百分比及增殖指数差异无显著性意义(P > 0.05)，见图3，表3。

2.5 BMSCs的成骨分化情况 经成骨诱导后，两组第7，14，21天的碱性磷酸酶水平呈递增趋势且差异无显著性意义(P > 0.05)。成骨诱导第21天，两组BMSCs中Runx2、骨钙素基因的相对表达量比较，差异无显著性意义(P > 0.05)，见图4，表4。

2.6 BMSCs在脱钙骨基质支架上的生长示踪和扫描电镜观察、元素能谱分析 实验组细胞黏附脱钙骨基质72 h，倒置荧光显微镜下可见脱钙骨基质三维立体孔隙结构，可见支架上有绿色荧光，呈满天星样，说明EGFP基因对细胞成功进行了标记。随着观察时间延长，至成骨诱导第7天，标记细胞逐渐增多，并沿脱钙骨基质支架空隙攀爬生长，荧光表达逐渐增强；成骨诱导第14天，荧光表达强度最亮，并且能清晰看见细胞形态，呈现出较好的空间示踪能力；成骨诱导第14-21天，荧光表达逐渐减弱，细胞开始出现衰老、死亡，根据荧光表达强度推测目的基因在2周左右发挥最大生物学功能。对照组未观察到荧光，仅见不透光的脱钙骨基质支架和支架边缘贴壁生长的细胞，对照组BMSCs在脱钙骨基质支架上的生长动态和整体形态未能很好地体现出来，见图5。
在扫描电镜下观察，第3天时两组均可见少量细胞贴壁支架孔隙；第7天可见细胞不断增殖，细胞数目逐渐增多，细胞基质填满支架孔隙；第14天，细胞长满支架，细胞基质分泌旺盛。由此可见EGFP基因转染的BMSCs在脱钙骨基质支架上有较好的生物相容性，见图6。

对扫描电镜样品微区随机进行元素能谱检测(C、H、O、Ca、S、P元素)，得出各元素质量百分比和能谱分析图谱，见图7。两组样品在3，7，14 d的钙、磷元素及钙磷比值无明显统计学差异(P > 0.05)，见表5。BMSCs在脱钙骨基质支架上增殖生长的同时发生了生物矿化现象，伴随着钙磷元素的不断富集、调整和动态改变。

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引言

转基因骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)与脱钙骨基质复合培养可在体外构建转基因组织工程材料应用于缺损组织的修复重建[1-2]。慢病毒基因载体可以将目的基因高效整合到BMSCs染色体上，从而实现目的基因持久、稳定的表达[3]。增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，EGFP)是一种报告基因，将EGFP与目的基因融合后通过基因载体转染细胞，用于监测目的基因的位置和表达情况[4]。研究表明病毒基因载体的感染复数影响BMSCs的转染效率，在最适感染复数下细胞转染效率最大，对细胞的生长形态、增殖及分化能力等影响最小[5]。使用EGFP基因和慢病毒载体工具对BMSCs进行研究时，EGFP重组慢病毒能够在不影响BMSCs增殖生长和分化潜能的情况下显示出较好的转染效率，可以安全用于BMSCs的示踪及基因转染等相关研究[6]。体外构建转基因组织工程材料用于人体缺损组织的修复重建是未来的发展方向，但是其基础研究仍面临许多瓶颈问题，例如转基因细胞目的基因的标记监测和表达是否安全高效、转基因细胞构建的组织工程材料是否具备良好的生物学特性，仍需要大量实验进行验证。
作者前期研究通过观察细胞转染效率和细胞毒性等确定了最适感染复数[7]，该研究通过慢病毒介导EGFP基因在最适感染复数下转染兔BMSCs，验证EGFP重组慢病毒转染BMSCs后的安全性和有效性，然后将EGFP重组慢病毒转染BMSCs与脱钙骨基质在体外构建转基因组织工程材料，通过荧光显微镜、扫描电镜和元素能谱分析观察材料的微观形貌和生物矿化能力，为后期干细胞目的基因修饰、体内动物实验及临床转化提供实验依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计 体外细胞学与组织学实验。
1.2 时间及地点 实验于2015年1月至2020年1月在桂林医学院科学实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验试剂 低糖DMEM(美国Gibco)；胎牛血清(美国HyClone)；小鼠抗兔CD45、CD44、CD29(美国Antigenix)；同型对照小鼠抗兔IgG1K、Per CP标记(美国eBioscien)；山羊抗小鼠IgG/辣根过氧化物酶标记、维生素C、β-磷酸甘油、地塞米松、MTT(韩国Biosharp)；Ⅰ型胶原单克隆抗体(武汉博士德)；碱性磷酸酶试剂盒(南京建成生物)；茜素红(美国Sigma)；总RNA提取试剂盒(北京天根生化)；PCR扩增试剂盒(北京康为世纪)；HiFi-MMLV反转录试剂盒(上海英俊生物)；2×Tap PCR Mix(北京艾德莱生物)；EGFP重组慢病毒(上海吉凯基因)。
1.3.2 实验仪器 生物安全柜(苏州净化)；倒置荧光显微镜(上海锘海生物)；全波长酶标仪(美国Thermo)；JS-780凝胶成像仪(上海培清科技)；电子扫描电镜(荷兰飞利浦)；X能谱分析仪(英国牛津公司)。
1.3.3 实验动物 新西兰大白兔2只，雄性，SPF级，12周龄，体质量0.8 kg，由桂林医学院动物实验中心提供，实验动物中心生产许可证号：SCXK(桂)2013-0001。实验方案经桂林医学院动物实验伦理委员会批准，审批号为2018-0005。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.4 实验方法
1.4.1 BMSCs的获取 使用细胞贴壁及密度梯度离心法获取原代兔BMSCs，在无菌条件下用骨髓穿刺针穿刺兔双侧股骨干骺端，获取骨髓约8 mL，转移至15 mL离心管以1 500 r/min速度离心5 min后弃上清液，加入10 mL L-DMEM重悬，再加入等体积密度为1.073 g/mL的Percoll分离液，以2 500 r/min速度离心20 min，取界面层细胞转移至另一只离心管，再加入5 mL L-DMEM洗涤离心、弃上清液后加入含体积分数15%胎牛血清的L-DMEM完全培养基，以2×105/cm2的密度培养在25 cm2塑料培养皿中，在饱和湿度、37 ℃、体积分数5% CO2培养箱中培养，48 h后更换培养液，以后每72 h更换1次培养液，细胞长到80%-90%汇合时，吸管吸取培养液丢弃，PBS冲洗后加入0.25%胰蛋白酶消化细胞，再加入8 mL L-DMEM重悬，以1 500 r/min速度离心5 min后弃上清液，再加入6 mL L-DMEM完全培养基混匀，以1∶2传代培养，细胞传代培养至第5代进行后续实验研究。
1.4.2 脱钙骨基质支架的制备 取兔双侧髂骨及干骺端四肢松质骨，置于-80 ℃低温冰箱，经过1周冻存后仔细对外层附着软组织进行剥离，将处理后的松质骨经脱钙液脱钙浸泡7 d，再将松质骨分别浸泡在乙醚、无水乙醇中脱脂、脱水各48 h，再使用蒸馏水反复浸泡呈中性，晾干后剪成大小约 2 mm×4 mm×6 mm块状，最后使用环氧乙烷对脱钙骨基质支架进行消毒包装，4 ℃保存备用。
1.4.3 实验分组及细胞转染 实验分为2组：实验组细胞转染EGFP重组慢病毒，对照组细胞未转染EGFP重组慢病毒。取第5代骨髓间充质干细胞以5×104个/孔接种于6孔塑料培养板，设置EGFP重组慢病毒滴度，以最适感染复数(MOI=100)与细胞进行共同培养，转染后24 h换液，使用倒置荧光显微镜观察细胞形态。
1.4.4 MTT检测细胞增殖能力 转染24 h后，两组细胞经过胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，以2×103个/孔培养于96孔塑料培养板，并设置7板，每板9个复孔，每隔24 h随机抽取1块96孔板，按照MTT试剂盒流程进行操作，设置酶标仪波长参数为490 nm，连续检测7 d吸光度值，表示细胞的增殖情况。
1.4.5 流式细胞仪检测细胞表型 转染72 h后，两组各随机选取3皿细胞，胰蛋白酶消化离心后PBS重悬制成细胞悬液，按操作说明分别标记CD44/CD45/CD29-PerCP，流式细胞仪上机检测。实验结果重复3次。
1.4.6 流式细胞仪检测细胞周期 转染72 h后，两组各随机选取3皿细胞，胰蛋白酶消化离心后PBS重悬制成细胞悬液，体积分数70%冰乙醇固定细胞，根据流式细胞仪操作说明检测细胞周期，得出各周期细胞数量所占总细胞的百分比，通过圈门分析法算出增殖指数=(S+G2/M)/(G0/1+S+G2/M)。实验结果重复3次。

1.4.7 细胞成骨分化指标检测 转染72 h后，两组细胞以1×105个/孔接种于6孔板，待细胞铺满培养皿80%左右更换成骨诱导液(含10 nmol/L地塞米松，15 mmol/L维生素C，10 mmol/L β-磷酸甘油，体积分数15%胎牛血清的低糖DMEM，pH=7.3)进行不传代细胞培养。成骨诱导第7，14，21天，各组随机取3孔，按碱性磷酸酶试剂盒说明计算碱性磷酸酶含量，实验重复3次。成骨诱导第21天，随机取3×106个细胞，TRIzol法提取总RNA，根据MMLV反转录试剂盒说明合成第一条链cDNA，按照PCR MasterMix试剂盒说明行PCR扩增，使用凝胶成像系统对PCR产物进行图像分析，计算目的基因与对应内参基因吸光度比值确定基因相对表达量，测量结果重复3次。目的基因为Runx2、骨钙素，内参基因为GAPDH。引物设计见表1。

1.4.8 BMSCs复合脱钙骨基质的动态示踪、扫描电镜观察及能谱分析 转染72 h后，两组细胞经胰蛋白酶消化后加入5 mL L-DMEM重悬，用细胞计数板计数后，收集1×108个细胞转移至离心管中，以1 500 r/min速度离心5 min后弃上清液，加入10 mL L-DMEM再次重悬，调整细胞浓度为1×1010 L-1，使用吸管将细胞悬液滴入事先放有脱钙骨基质的25 cm2培养皿中，加入L-DMEM完全培养基10 mL，24 h后更换成骨诱导培养液，每天在倒置荧光显微镜下观察细胞在脱钙骨基质上的空间分布和动态生长情况。成骨诱导第3，7，14天，分别进行戊二醛固定、丙酮逐级脱水、临界点干燥和表面喷镀，制成扫描电镜样本，对样本进行微观形貌观察和元素能谱分析。元素能谱分析实验结果重复3次。
1.5 主要观察指标 观察EGFP重组慢病毒转染BMSCs与未转染BMSCs的增殖能力、细胞表型、细胞周期以及成骨诱导后的碱性磷酸酶、Runx2、骨钙素基因表达差异。对转基因组织工程材料进行微观形貌观察和元素能谱分析。

1.6 统计学分析 应用SPSS 25.0软件进行统计学分析，以P > 0.1为检验水准，对两组数据作正态性分析和方差齐性检验。数据满足上述条件则两组数据进行两独立样本t检验，若不满足则进行两个独立样本的非参数检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经通过桂林医学院生物统计学专家审核。

讨论

慢病毒基因载体和EGFP基因都是生物医学领域中常用的工具[8]。EGFP基因通常与目的基因融合标记生物组织或细胞，以便监测目的基因的表达，被标记的细胞在显微镜下呈现出绿色荧光，有利于活细胞在显微镜下的示踪观察[9]。在该实验中，经EGFP重组慢病毒转染后的BMSCs可观察到荧光，转染效率高达90%，表明慢病毒基因载体成功实现了EGFP基因高效导入和细胞标记。但是，结果显示在EGFP基因与BMSCs基因整合初期，EGFP重组慢病毒对细胞增殖能力产生了抑制，在持续感染72 h后，实验组恢复了与对照组相似的增殖能力。作者考虑由于慢病毒所携带的基因组会逐渐整合到BMSCs的DNA中，导致BMSCs基因表达紊乱抑制细胞增殖，当感染持续一段时间，宿主细胞通过细胞重塑机制逐渐恢复了增殖功能，慢病毒基因载体利用宿主细胞的基因组和转录机制产生新的病毒RNA，从而进一步促进了BMSCs的高效转染[10]。随着外源基因的导入，慢病毒基因载体有可能通过病毒基因型改变、细胞基因突变等多种机制来改变细胞表型和类型[11]。该实验结果显示EGFP重组慢病毒转染BMSCs后细胞表型未发生改变，两组细胞表面抗原CD44、CD29均呈阳性，CD45均呈阴性，其中CD45是造血干细胞表面标志物，CD44、CD29是BMSCs表面标志物，仍符合BMSCs表面抗原特征[12]。另外，由于物种的细胞类型与细胞周期的时间长短密切相关[13]。该实验结果显示两组存在相似的细胞周期，说明EGFP基因与细胞基因整合后细胞类型未发生改变，因此，EGFP重组慢病毒并未对BMSCs的细胞表型和细胞类型产生影响。成骨诱导液可促使BMSCs成骨分化，其主要由地塞米松、维生素C、β-磷酸甘油组成，可促进细胞成骨基因Runx2、骨钙素的表达，并能激活细胞碱性磷酸酶的表达，促进钙盐沉积和矿化结节形成[14]。该实验结果显示BMSCs经成骨诱导后，实验组和对照组细胞内碱性磷酸酶、Runx2、骨钙素基因表达无明显统计学差异，表明EGFP重组慢病毒不对BMSCs成骨分化产生明显影响。BUICHA等[15]研究表明，慢病毒基因载体亦可高效率转染分裂中的BMSCs，并容纳多片段外源基因和多个转录启动子，持久稳定表达目的基因，弥补了腺病毒基因载体缺陷，在目的基因表达持续时间上更具有优势。课题组前期对腺病毒和慢病毒基因载体对比研究表明，腺病毒基因载体可以让细胞短时间内有较高的瞬时转染效率，但是腺病毒载体系统在导入目的基因后有时会出现导入的外源基因丢失现象，从而降低了目的基因表达，慢病毒载体系统介导的目的基因相对于腺病毒载体系统，在表达持续时间上更具有优越性[7]。该实验发现EGFP重组慢病毒在最适感染复数下对BMSCs进行转染，对细胞的生长形态、细胞类型及成骨分化能力未产生明显影响，可以安全用于BMSCs的标记示踪及基因转染实验研究，从而进一步验证了EGFP重组慢病毒转染BMSCs的高效性和安全性。但是，该研究仅通过EGFP重组慢病毒转染兔BMSCs的增殖能力、细胞表型、细胞周期以及成骨诱导后的碱性磷酸酶表达、Runx2、骨钙素基因表达等探讨转基因细胞的部分生物学特性，仍有一定的实验局限性。
BMSCs具有多向分化能力和较强的不衰减增殖能力，且与胚胎干细胞相比不受伦理学限制，是比较理想的组织工程种子细胞 [16-17]。BMSCs与脱钙骨基质支架复合培养可在体外构建组织工程材料[18]。由于脱钙骨基质支架在显微镜下具有不透光性，不能很好地观察细胞在支架上的生长形态和空间分布，通过扫描电镜观察细胞与支架的黏附生长情况和生物相容性，也不能很好地体现细胞在支架上的动态生长情况。通过EGFP重组慢病毒标记细胞，再与脱钙骨基质支架复合培养体外构建转基因组织工程材料，结果显示BMSCs标记后能动态呈现出脱钙骨基质支架上的细胞形态和空间分布情况，通过扫描电镜观察微观形貌进一步验证了EGFP转染的BMSCs与脱钙骨基质支架体外构建的组织工程材料具有较好的生物相容性。实验结果还显示，EGFP基因标记的细胞在14 d有最大的荧光表达强度，至第21天荧光表达强度逐渐减弱或消失，间接说明体外构建的转基因组织工程材料将在2周左右发挥最大生物学功能，可能是生物材料进行体内移植的最优时间段。因此，EGFP重组慢病毒转染BMSCs在脱钙骨基质支架上相对于对照组更能较好地呈现出空间分布示踪能力，并能根据荧光的表达强度间接推测出最佳目的基因表达时间。研究表明成骨活性相关细胞因子如骨形态发生蛋白、血管内皮生长因子等能调控BMSCs的成骨分化 [19]，利用基因工程技术将外源成骨活性细胞因子基因导入BMSCs，与支架材料复合体外构建转基因组织工程材料，植入体内可实现缺损组织的修复重建，是一种科学可行的基因治疗策略[20-21]。HE等[22]研究表明，利用基因工程技术将骨形态发生蛋白2基因通过质粒基因载体导入BMSCs与Ti-P/p复合构建组织工程植入物，加速了股骨髁缺损大鼠的骨愈合能力。课题组研究也表明骨形态生发蛋白2和血管内皮生长因子165双基因重组慢病毒复合脱钙骨基质治疗兔股骨头坏死实现了较好的修复效果[23]。
生物矿化是一种普遍的自然现象，机体骨骼中羟基磷灰石的形成是生物矿化最常见的表现形式[24-25]。生物矿化是生物体内细胞有机大分子与周围环境无机矿物质相互作用的结果。目前生物矿化研究是一个多学科交叉研究领域，已从单纯的生物学矿化研究拓展到生物合成材料应用研究[26-27]。该研究发现，两组组织工程材料都发生了相似的体外生物矿化过程，随着体外培养时间的延长，钙、磷元素含量都发生了无规律的动态改变，随着钙磷元素发生持续增加和消减的调整，最终钙磷元素的比值也发生了改变，钙磷比值在研究终点分别为1.71±0.18和1.50±0.19，非常接近骨骼中羟基磷灰石的比值1.67，说明其体外矿化过程与体内骨骼生成存在某种联系，值得进一步研究。目前生物体的生物矿化调控机制和矿化过程仍不明确[28]。研究表明，胶原蛋白在骨组织的形成过程中可以促进羟基磷灰石成核和晶体生长[29]。脱钙松质骨具有天然立体孔隙结构，其主要成分为Ⅰ型胶原蛋白。另外，BMSCs成骨分化后在细胞内高效表达碱性磷酸酶、Runx2和骨钙素，通过细胞内合成和细胞外分泌的方式产生胶原蛋白，这也促进了细胞外基质的矿化过程 [30]。因此，作者认为生物矿化过程是成骨分化后细胞基质矿化和脱钙骨基质胶原蛋白共同矿化的结果。
综上所述，该实验验证了EGFP重组慢病毒转染BMSCs的安全性及其与脱钙骨基质体外构建组织工程材料的组织相容性及生物矿化特性，为后期体内实验研究提供理论依据。但是，如何将这些技术真正应用于临床基因治疗仍然需要进一步研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

重组慢病毒转染兔骨髓间充质干细胞与脱钙骨基质构建转基因组织工程材料

Rabbit bone marrow mesenchymal stem cells transfected with recombinant lentivirus and decalcified bone matrix to construct transgenic tissue engineering materials

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