葡萄籽提取物抑制大鼠生长板软骨细胞凋亡及促进胫骨的生长

doi:10.12307/2024.310

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (20): 3216-3222.doi: 10.12307/2024.310

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葡萄籽提取物抑制大鼠生长板软骨细胞凋亡及促进胫骨的生长

宁桃丽，谢艳，王娜，王庆丰，吉建，张冬纳

河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)，河南省洛阳市 471000

收稿日期:2023-03-07 接受日期:2023-04-24 出版日期:2024-07-18 发布日期:2023-09-11
通讯作者: 王娜，副主任技师，河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)，河南省洛阳市 471000
作者简介:宁桃丽，女，1985年生，河南省洛阳市人，汉族，主管药师，主要从事临床药学和骨科基础研究。
基金资助:
河南省中医药科学研究专项课题(2019ZY1034)，项目负责人：王娜；河南省中医药科学研究专项课题(2019ZY2098)，项目负责人：宁桃丽

Grape seed extract inhibits apoptosis in growth plate chondrocytes and promotes tibial growth in rats

Ning Taoli, Xie Yan, Wang Na, Wang Qingfeng, Ji Jian, Zhang Dongna

Henan Provincial Luoyang Orthopedic-Traumatological Hospital (Henan Provincial Orthopedic Hospital), Luoyang 471000, Henan Province, China

Received:2023-03-07 Accepted:2023-04-24 Online:2024-07-18 Published:2023-09-11
Contact: Wang Na, Associate chief technician, Henan Provincial Luoyang Orthopedic-Traumatological Hospital (Henan Provincial Orthopedic Hospital), Luoyang 471000, Henan Province, China
About author:Ning Taoli, Pharmacist-in-charge, Henan Provincial Luoyang Orthopedic-Traumatological Hospital (Henan Provincial Orthopedic Hospital), Luoyang 471000, Henan Province, China
Supported by:
Special Research Projects of Traditional Chinese Medicine of Henan Province, Nos. 2019ZY1034 (to WN) and 2019ZY2098 (to NTL [project participant])

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

细胞凋亡：又称细胞程序性死亡，是一定条件下有核细胞启动的自身内部机制，细胞凋亡后期的共同途径是Caspase。有研究表明，软骨终板细胞凋亡可能的主要途径是线粒体途径，由Caspase-9起始。
Caspase-9：是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族成员之一，称为启动Caspase，位于细胞凋亡信号转导通路级联反应上游，是内源性凋亡通路中的关键蛋白。

背景：已有文献报道，葡萄籽提取物在抑制雄激素依赖型肿瘤的生长(如乳腺癌等)方面具有一定的作用，因此理论上葡萄籽提取物可以抑制青少年后期由于雌激素产生的骨骺闭合现象。

目的：观察葡萄籽提取物对大鼠生长板软骨细胞凋亡及骨骺闭合的影响。
方法：①体外实验：取对数生长期的大鼠胫骨及股骨生长板软骨细胞，分组培养：正常对照组、模型对照组(加入17β雌二醇诱导细胞凋亡)、阳性对照组(加入来曲唑与17β雌二醇)、葡萄籽提取物组(加入17β雌二醇和10 µg/mL葡萄籽提取物)、Caspase-9抑制剂组(加入17β雌二醇和Caspase-9抑制剂)、Caspase-9激动剂组(加入17β雌二醇和Caspase-9激动剂)，培养48 h后，采用流式细胞术检测细胞凋亡。②体内实验：将30只3月龄SD大鼠随机分为模型对照组、阳性对照组及药物低、中、高剂量组，每组5只，均皮下注射17β雌二醇(3次/周)建立骨骺闭合模型，阳性对照组灌胃给予来曲唑，药物低、中、高剂量组分别灌胃给予0.05，0.2，0.8 g/kg的葡萄籽提取物，1次/d，直至模型对照组大鼠胫骨平台骨骺闭合2/3以上停药，观察各组大鼠胫骨长度。将18 只SD大鼠随机分为模型对照组、阳性对照组、药物中剂量组，每组6只，按照如上方法处理，连续给药1.5个月后，Western blot检测大鼠胫骨生长板软骨Caspase-9蛋白表达。

结果与结论：①体外实验：17β雌二醇可诱发生长板软骨细胞的凋亡，而来曲唑、葡萄籽提取物与Caspase-9抑制剂均可抑制生长板软骨细胞的凋亡；②体内实验：当模型对照组大鼠胫骨平台骨骺闭合2/3以上时，阳性对照组、药物中剂量组骨骺闭合数量少于模型对照组(P < 0.05)，且胫骨长度大于模型对照组(P < 0.05)，胫骨生长板软骨Caspase-9蛋白表达低于模型对照组(P < 0.05)；③结果表明：适宜浓度的葡萄籽提取物可有效抑制生长板软骨细胞的凋亡并延迟骨骺闭合，具有促进骨骼生长的潜能。

https://orcid.org/0009-0006-1970-4608(宁桃丽)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 葡萄籽提取物, 生长板软骨细胞, 细胞凋亡, 骨骺闭合, Casepase-9

Abstract: BACKGROUND: Grape seed extract has been shown to be effective in inhibiting the growth of androgen-dependent tumors (e.g., breast cancer), and thus grape seed extract could theoretically inhibit epiphyseal closure induced by estrogen in late adolescence.
OBJECTIVE: To screen the effects of grape seed extract on apoptosis of growth plate chondrocytes and epiphyseal closure in rats.
METHODS: (1) In vitro experiment: Growth plate chondrocytes from rat large tibia and femur at logarithmic growth stage were obtained and cultured in groups: normal control group, model control group (adding 17β-estradiol to induce apoptosis), positive control group (adding letrozole and 17β-estradiol), grape seed extract group (adding 17β-estradiol and 10 µg/mL grape seed extract), Caspase-9 inhibitor group (adding 17β-estradiol and Caspase-9 inhibitor), Caspase-9 agonist group (adding 17β-estradiol and Caspase-9 agonist). Cell apoptosis was detected by flow cytometry after 48 hours of culture. (2) In vivo experiment: Thirty 3-month-old Sprague-Dawley rats were randomly divided into model control group, positive control group and low-, medium- and high-dose groups, with five rats in each group. All rats were injected subcutaneously with 17β-estradiol (3 times per week) to establish epiphyseal closure models, followed by intragastric administration of letrozole in positive control group and 0.05, 0.2 and 0.8 g/kg grape seed extract in low-, medium- and high-dose groups, respectively, once a day until over 2/3 of the epiphyseal plate in the model control group was closed. The length of the tibia was then observed. Another 18 Sprague-Dawley rats were randomly divided into model control group, positive control group, and medium-dose group, with 6 rats in each group, treated as above for 1.5 continuous months. The expression of Caspase-9 protein in rat growth plate cartilage was detected by western blot.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) In vitro experiment: 17β-estradiol could induce apoptosis in growth plate chondrocytes, and letrozole, grape seed extract, and caspase-9 inhibitors could all inhibit apoptosis in growth plate chondrocytes. (2) In vivo experiment: When more than 2/3 of the epiphyseal plate in the model control group was closed, the number of rats with epiphysis closure in the positive control and medium-dose groups was less than that in the model control group (P < 0.05), and the tibial length was longer than that in the model control group (P < 0.05), and the Caspase-9 protein expression in the tibial growth plate was lower than that in the model control group (P < 0.05). To conclude, the appropriate dose of grape seed extract can effectively inhibit the apoptosis of growth plate chondrocytes and delay epiphyseal closure, which has the potential to promote bone growth.

Key words: grape seed extract, growth plate chondrocyte, apoptosis, epiphyseal closure, Casepase-9

中图分类号:

宁桃丽, 谢艳, 王娜, 王庆丰, 吉建, 张冬纳. 葡萄籽提取物抑制大鼠生长板软骨细胞凋亡及促进胫骨的生长[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(20): 3216-3222.

Ning Taoli, Xie Yan, Wang Na, Wang Qingfeng, Ji Jian, Zhang Dongna. Grape seed extract inhibits apoptosis in growth plate chondrocytes and promotes tibial growth in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(20): 3216-3222.

图/表（结果） 12

2.1 体外实验结果
2.1.1 生长板软骨细胞形态观察倒置显微镜下观察软骨细胞形态，刚接种未贴壁的细胞呈小圆球形，悬浮在培养液中；培养12 h后细胞开始贴壁，培养24 h后大部分细胞贴壁，细胞形态已发生变化，伸长形成伪足(图1A)，均匀散在生长，出现较多细胞分裂相；培养3-5 d，软骨细胞90%融合形成单层，细胞形态不规则，呈多边形、星形等，胞体丰富，胞浆均匀，相互密集连接呈“铺路石”状外观(图1B)；3代后细胞大多为长梭形，遮光性差，部分细胞由贴壁状态脱落，悬浮于培养液中(图1C)。

2.1.2 Ⅱ型胶原免疫荧光鉴定生长板软骨细胞 Ⅱ型胶原是软骨细胞基质内主要成分，可作为软骨细胞鉴定的指标。大鼠生长板软骨细胞经培养72 h后进行Ⅱ型胶原免疫荧光染色，结果如图2所示，在荧光显微镜下可见典型的软骨细胞形态，经DAPI染色后细胞核激发出蓝色荧光，而细胞质呈红色荧光，证明该实验方法能够分离培养出纯度较高的软骨细胞。

2.1.3 葡萄籽提取物对生长板软骨细胞凋亡的影响 MTT检测显示，与正常对照组比较，模型对照组及葡萄籽提取物6-8组细胞增殖吸光度值降低(P < 0.01)，阳性对照组及葡萄籽提取物1-5组细胞增殖吸光度值升高(P < 0.01)；与模型对照组比较，阳性对照组及葡萄籽提取物1-5组细胞增殖吸光度值升高(P < 0.01)；葡萄籽提取物2-5组细胞增殖吸光度值高于阳性对照组(P < 0.5)，见表1。

由图3可见，正常对照组、阳性对照组与葡萄籽提取物组细胞生长活跃，细胞均质而透明，培养基内少见悬浮的细胞和碎片；模型对照组细胞生长缓慢，细胞轮廓不清晰，细胞不饱满，培养基内可见大量悬浮的细胞和碎片。

由图4流式细胞术检测检测结果可见，模型对照组细胞凋亡较正常对照组明显增多；正常对照组多为正常活细胞，模型对照组早期凋亡及中晚期凋亡细胞较多，而5 μmol/L的来曲唑和10 μg/mL的葡萄籽提取物均可以抑制生长板软骨细胞的凋亡，葡萄籽提取物组抑制细胞凋亡的效果较好，优于阳性对照组。各组细胞凋亡率见图5。

2.1.4 Caspase-9在生长板软骨细胞凋亡中的作用由图6可见，正常对照组、阳性对照组、Caspase-9抑制剂组和葡萄籽提取物组细胞均质而透明，细胞生长活跃，培养基内少见悬浮的细胞和碎片；模型对照组和Caspase-9激动剂组细胞生长缓慢，细胞不饱满，培养基内可见大量悬浮的细胞和碎片。

由图7流式细胞术检测结果可见，与正常对照组比较，模型对照组和Caspase-9激动剂组早期凋亡及中晚期凋亡细胞较多，而来曲唑、Caspase-9抑制剂、葡萄籽提取物处理均可以抑制生长板软骨细胞的凋亡。各组细胞凋亡率见图8。

2.2 体内实验结果
2.2.1 实验动物数量分析 48 只SD大鼠全部进入结果分析。
2.2.2 各组大鼠胫骨平台骨骺闭合及胫骨生长情况如图9的X射线片所示，模型对照组及药物低、高剂量组大鼠胫骨平台骨骺与干骺端软骨完全骨化，形成一条紧密的缝，阳性对照组和药物中剂量组大鼠胫骨平台骨骺与干骺端软的软骨显示的是一条透明带。

当模型对照组大鼠胫骨平台骨骺闭合例数超过2/3时，阳性对照组和药物中剂量组大鼠胫骨平台的骨骺闭合数均少于模型对照组(P < 0.05)，结果见表2。用游标卡尺测量胫骨长度，发现药物中剂量物组和阳性对照组大鼠胫骨长度大于模型对照组(P < 0.01)，见表2。

2.2.3 各组大鼠胫骨生长板软骨Caspase-9蛋白表达如图10所示，药物中剂量组和阳性对照组Caspase-9蛋白表达量较模型对照组下降，说明葡萄籽提取物和阳性对照药物均可以抑制胫骨生长板软骨Caspase-9蛋白的表达。定量分析结果显示，模型对照组、阳性对照组、药物中剂量组大鼠胫骨生长板软骨Caspase-9蛋白分别为0.43±0.08，0.13±0.08，0.05±0.01，阳性对照组、药物中剂量组大鼠胫骨生长板软骨Caspase-9蛋白低于模型对照组(P < 0.05)。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞水平实验，随机对照动物体内药效实验，多组间差异比较采用单因素方差分析，组间行LSD检验。
1.2 时间及地点实验于2020年8月至2022年1月在河南省洛阳正骨医院(河南省骨科医院)医学实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验药物葡萄籽提取物(95%，西安四季生物科技，货号：SJG160722)，来曲唑(CTESTINGBIO，货号：112809-51-5)，17β雌二醇(Sigma)，以上药物均用细胞级DMSO使其完全溶解，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基调至一定浓度，用0.22 µm细胞过滤器过滤除菌，4 ℃保存备用，使用时用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基稀释至所需浓度。
1.3.2 实验动物 4 周龄雄性SD大鼠2 只，SPF级，体质量80-100 g，购于河南省实验动物中心；48 只3 月龄雄性SD大鼠，SPF级，体质量230-270 g，均购于河南省实验动物中心，动物合格证号SCXK(豫)2017-0001。动物饲养环境温度20-24 ℃，湿度50%-70%，12 h明暗交替，光照7：00-19：00，噪声< 50 dB。
1.3.3 实验试剂 0.25%胰蛋白酶(含0.02%乙二胺四乙酸，Gibco，货号：25200-072)；胎牛血清(iCell，货号：iCell 0500)；DMEM/F12培养基(iCell，货号：iCell-0005)；胶原蛋白酶Ⅱ(Gibco，货号：17101015)；封闭山羊血清(Solarbio，货号：SL038)；兔抗人 Ⅱ 型胶原抗体 (Proteintech，货号：15943-1-AP)；ANNEXIN V- FITC/PI 凋亡检测试剂盒(Solarbio，货号：CA1020)；HRP标记驴抗山羊(Servicebio，货号：GB23404)；HRP标记山羊抗大鼠(Servicebio，货号：GB23302)；氟甲基酮(Caspase-9抑制剂，Biovision公司，货号：1149-1)；恩贝酸(Caspase-9激动剂，Selleck公司，货号S7025)。
1.3.4 实验仪器 37 ℃恒温细胞培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂，规格型号：BC-J160S)；高速离心机(Thermo Fisher，货号：75004250)；高级分析倒置显微镜(Nikon，型号：DS-Ri2)；多功能酶标仪(LabsystemsMultiskan MS，芬兰，352型)；电热恒温振荡水槽(上海精宏实验设备有限公司，型号：DK-2B)；德国MiltenyiMACSQuant Analyzer流式细胞仪(Miltenyi，型号：130-092-197)；脱色摇床(Servicebio，TSY-B)；双垂直电泳仪(北京六一仪器厂，DYCZ-24DN)；灰度分析软件(Alpha Innotech，alphaEaseFC)。
1.4 实验方法
1.4.1 体外实验
大鼠生长板软骨细胞的分离与培养[11]：取4 周龄SD大鼠，腹腔注射3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后脱颈椎处死，置于体积分数75%乙醇中消毒5 min；取胫骨近端生长板软骨，剪碎成约1 mm3大小的碎块，冲洗，加入0.1%Ⅱ型胶原酶2 mL，37 ℃恒温水浴锅振荡消化5 h，200 目不锈钢滤网过滤，将滤液以1 000 r/min离心5 min，收集细胞沉淀；PBS清洗2 次，弃上清液，将细胞沉淀重悬于DMEM/F12培养基中制成细胞悬液，血球计数板计数，锥虫蓝染色液测定细胞的活力。按1×1011 L-1的细胞浓度接种到T25培养瓶中，加入含体积分数10%胎牛血清DMEM/F12培养基，在37 ℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养箱中孵育，培养基每2 d更换一次。每天在倒置显微镜下观察细胞生长情况。
Ⅱ型胶原免疫荧光鉴定生长板软骨细胞[10，12]：收集对数生长期的生长板软骨细胞，按2×107 L-1的细胞浓度接种于放有无菌玻片的24 孔板内，每孔1 mL，培养基为含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于37 ℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养箱中孵育。待细胞爬片后吸出培养基，PBS清洗3 次，每次5 min；加入40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗3 次，每次5 min；加入50 µL破膜封闭液(0.5%TritionX-100与PBS按体积比1∶1混合，再加入体积分数10%山羊血清)封闭，透化2 h；然后加入50 µL兔抗人 Ⅱ 型胶原抗体一抗(1∶100)孵育液，4 ℃孵育过夜；PBS清洗3 次，每次5 min，避光滴加Alexa Fluor594标记的山羊抗兔IgG(H+L)荧光二抗工作液(1∶500)，避光孵育2 h；PBS清洗3 次，每次5 min，滴加适量的荧光封固剂，盖玻片封固片，荧光显微镜下鉴定培养的细胞。
MTT法筛选抑制生长板软骨细胞凋亡的最佳药物质量浓度：取对数生长期的生长板软骨细胞，按1×107 L-1的细胞浓度接种于96 孔板内，每孔200 μL，置于37 ℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养箱中培养，观察细胞贴壁后分为13 组处理：正常对照组(加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基200 µL)、模型对照组(加入含20 ng/mL 17β雌二醇及体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基200 µL)、阳性对照组(加入含5 µg/mL来曲唑、20 ng/mL 17β雌二醇及体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基200 µL)、DMSO组(加入200 µL DMSO)、非造模组(加入含10 μg/mL葡萄籽提取物及体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基200 µL)、葡萄籽提取物1-8组[加入含20 ng/mL 17β雌二醇及不同质量浓度(5，10，25，50，100，200，300，400 μg/mL)葡萄籽提取物、体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基200 µL]，每组设6 个复孔(实验重复3 次)。置于37 ℃、体积分数5%CO2饱和湿度培养箱中培养48 h后，每个培养孔加入20 µL MTT(5 mg/mL)继续培养4 h后，弃去上清液，每孔加入150 µL DMSO，置摇床上低速振荡30 min，待结晶物充分溶解后，使用酶标仪于570 nm测定吸光度(A)值，检测细胞活性。
流式细胞术检测药物对17β雌二醇引起细胞凋亡的影响[13-14]：取对数生长期的生长板软骨细胞，按照2×108 L-1的细胞浓度接种于6 孔板，每孔2 mL，分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组、葡萄籽提取物组(10 μg/mL)，按照如上方法处理。处理48 h后，0.25%胰蛋白酶消化处理后，用PBS洗涤1 遍，用1 mL 缓冲液悬浮细胞，300×g离心10 min，弃上清，再用1 mL缓冲液重悬细胞，制成细胞浓度为1×109 L-1的单细胞悬液；取100 μL单细胞悬液，加入5 μL Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂，避光下轻轻混匀10 min；加5 μL 碘化丙啶避光孵育5 min，加PBS至500 μL，避光混匀后上流式细胞仪，检测细胞凋亡情况。
流式细胞术检测Caspase-9在生长板软骨细胞凋亡中的作用：取对数生长期的生长板软骨细胞，按照2×108 L-1的细胞浓度接种于6 孔板，每孔2 mL，分为正常对照组、模型对照组、阳性对照组、葡萄籽提取物组(10 μg/mL)、Caspase-9抑制剂组(加入17β雌二醇和50 μmol/L Caspase-9抑制剂)[15-17]、Caspase-9激动剂组(加入17β雌二醇和30 μmol/L Caspase-9激动剂)[18-19]，处理软骨细胞48 h，按照如上方法检测细胞凋亡。
1.4.2 体内实验

影像学观察葡萄籽提取物延迟骨骺闭合及促进长骨增长的作用[11]：取30 只3 月龄SD大鼠，采用随机数字表法分为模型对照组、阳性对照组和药物低、中、高剂量组，每组6 只。5 组均皮下注射17β雌二醇50 μg/kg，每周3 次；阳性对照组每天灌胃给予0.325 mg/kg的来曲唑，药物低、中、高剂量组每天分别灌胃给予0.05，0.2，0.8 g/kg的葡萄籽提取物。每15 d照射一次X射线片，观察胫骨平台骨骺闭合情况，直至模型对照组胫骨平台骨骺闭合2/3以上停止给药，统计所有大鼠骨骺闭合情况。腹腔注射3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后脱颈椎处死大鼠，取后肢双侧胫骨，用游标卡尺测量胫骨长度。

Western blot检测药物对大鼠胫骨生长板软骨Caspase-9表达的影响[20]：采用随机数字表法将18 只3 月龄SD大鼠随机分为模型对照组、阳性对照组和药物中剂量组，给药方法同上。连续给药1.5 个月后，腹腔注射3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后处死大鼠，取胫骨生长板软骨，剪成小块置于匀浆管中匀浆100 s，期间间断降温；匀浆后样本冰浴30 min，每隔5 min振荡1次，待组织完全裂解；2 000 r/min离心10 min，收集上清即为总蛋白溶液；上样，浓缩胶电压75 V，分离胶电压120 V，转膜；室温下脱色摇床上用5%的脱脂牛奶封闭1 h，用HRP标记山羊抗大鼠的一抗Caspase-9(1∶200)4 ℃孵育过夜，辣根过氧化物酶HRP标记驴抗山羊二抗(1∶200)室温下孵育30 min，用TBST在室温下脱色摇床上洗3 次，每次5 min；进行曝光、显影、定影，然后采用Alpha软件处理系统分析Caspase-9表达条带的吸光度值。
1.5 主要观察指标各组生长板软骨细胞的凋亡情况，各组大鼠胫骨平台骨骺闭合、胫骨长度及胫骨生长板软骨Caspase-9蛋白表达。
1.6 统计学分析以EXCEL软件录入数据，用软件SPSS 22.0对数据进行统计分析，计量资料采用x±s表示，多组间差异比较采用单因素方差分析，组间行LSD检验；计数资料采用卡方检验。P < 0.05表示差异有显著性意义。文章统计学方法已经河北医科大学生物统计学专家审核。

讨论

生长板又称为骺板，长骨通过生长板软骨内成骨实现线性生长。生长板软骨细胞从静止、增殖、分化到凋亡是一个有序的过程，而该过程受多种内分泌激素的调节[1]。已有大量研究表明，雌激素在生长板闭合过程中起关键作用，雌激素介导的软骨细胞凋亡是促进生长板生理性结构衰退和闭合的细胞学基础 [21-26]。芳香化酶是细胞色素P450酶，是雄激素转化为雌激素过程中的关键酶之一，主要分布于胎盘和卵巢组织等组织。芳香化酶抑制剂通过抑制芳香化酶而抑制雄性激素向雌性激素转变，使内源性雌性激素水平降低95%，且不影响其他类固醇激素生物合成，可专一性降低雌激素水平[27-28]。文献报道，芳香化酶抑制剂单独或联合其他药物可延缓骨龄、最终改善成年人身高，芳香化酶抑制剂的促生长作用日益受到儿科内分泌医生的关注[29-31]。第3 代芳香化酶抑制剂虽然具有高效、可选择性及可逆性等特点，但是其安全性仍需要进一步临床大样本量、随机、长期的观察[32]。
到目前为止，尚没有专门延缓骨骺闭合的药物来促进身高增长。儿童身材矮小的最终原因都是骨骺提前闭合，所以如果从根本上延缓骨骺闭合，无疑会促使最终的身高增高，这些促使人们继续寻找更为安全有效的新型芳香化酶抑制剂。天然产物是先导化合物的重要来源，从天然产物中寻找芳香化酶抑制剂是其主要途径之一。近年来临床研究发现，葡萄籽提取物具有很高的营养和保健价值，葡萄籽提取物是从葡萄籽中提取的一种多酚类物质，其中多酚的含量大多超过95%[33]，主要成分是低聚原花青素，而低聚原花青素具有独特的结构，且具有水溶性好、有效性高、生物利用度高、极易被人体吸收、安全无毒等特点[34-35]。YAMAKOSHI等[36]通过对原青花素急性毒性和慢性长期毒性实验发现，原花青素无毒、无致畸作用，临床使用安全性高，可广泛应用。
前期研究发现，芳香化酶抑制剂具有抑制生长板软骨细胞凋亡并延迟大鼠骨骺闭合的作用。此次研究采用葡萄籽提取物替代原花青素进行药物实验，可显著降低药物成本。此次研究通过17β雌二醇建立软骨细胞凋亡模型，然后用不同质量浓度的葡萄籽提取物干预软骨细胞，MTT实验发现，不同质量浓度葡萄籽提取物作用后的细胞存活率与模型对照组比较均有不同程度提高，其中以药物质量浓度10 μg/mL时细胞存活率最高，说明适宜质量浓度的葡萄籽提取物才具有抑制生长板软骨细胞凋亡的作用，与文献报道的芳香化酶抑制剂作用一致[37]；配置药物的溶剂DMSO和单纯加入药物组细胞存活率与正常对照组无统计学差异，说明DMSO与葡萄籽提取物正常情况下不影响软骨细胞的增殖。
AnnexinV/PI双参数法是反映药物下细胞凋亡的经典方法，双阴性是活细胞，双阳性是凋亡中后期细胞，AnnexinV单阳性是凋亡早期的细胞[38-39]。此次研究结果发现，模型对照组早期凋亡细胞多，葡萄籽提取物和阳性药物可以逆转这一现象，细胞基本是正常细胞。目前的研究表明，软骨终板细胞凋亡主要是线粒体途径[40]，随着人们对凋亡机制的研究发现，Caspase家族在细胞凋亡中的作用逐步受到人们的关注。Caspase家族成员按照功能分为两大类：一类是凋亡启动子，由Caspase-1、2、4、5、8、9组成；一类是凋亡执行子，由Caspase-3、6、7、14组成[41]。在凋亡诱导因素作用下，线粒体中的Caspase-9释放到细胞质中并与凋亡蛋白酶活化因子1(Apaf-1)形成聚合多聚体，聚合多聚体再进一步与凋亡起始因子Caspase-9结合形成凋亡小体，使Caspase-9前体大量活化后形成凋亡体，引发细胞凋亡[42]。此次研究流式细胞术检测发现，Caspase-9抑制剂、阳性药物和葡萄籽提取物抑制生长板软骨细胞的凋亡，细胞基本是正常细胞，模型对照组和Caspase-9激动剂组早期凋亡及中晚期凋亡细胞较多。体内实验结果显示，当模型对照组大鼠胫骨平台骨骺闭合例数超过2/3时，阳性对照组和葡萄籽提取物中剂量组的骨骺闭合例数均少于模型对照(P < 0.05)，通过Western blot检测大鼠生长板软骨Caspase-9蛋白的表达，药物中剂量组大鼠生长板软骨Caspase-9蛋白表达明显降低，说明葡萄籽提取物可以抑制大鼠生长板软骨中Caspase-9蛋白的表达，葡萄籽提取物抑制软骨细胞凋亡并延迟骨骺闭合的作用机制可能是通过抑制Caspase-9的表达有关。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

葡萄籽提取物抑制大鼠生长板软骨细胞凋亡及促进胫骨的生长

Grape seed extract inhibits apoptosis in growth plate chondrocytes and promotes tibial growth in rats

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