双膦酸盐修饰生长分化因子5促进MC3T3-E1细胞的成骨分化

doi:10.12307/2023.981

中国组织工程研究 ›› 2024, Vol. 28 ›› Issue (3): 373-379.doi: 10.12307/2023.981

• 组织工程骨材料 tissue-engineered bone • 上一篇下一篇

双膦酸盐修饰生长分化因子5促进MC3T3-E1细胞的成骨分化

李立斯1，2，3，张成栋2，李小龙2，叶姿妤3，蒲超2，杨在君1，3，匙峰1，3，肖东琴2

西华师范大学，1组织修复材料工程技术协同创新中心，3生命科学学院，四川省南充市 637000；2川北医学院第二临床学院·南充市中心医院组织工程与干细胞研究所，四川省南充市 637000

收稿日期:2022-12-19 接受日期:2023-02-11 出版日期:2024-01-28 发布日期:2023-07-10
通讯作者: 杨在君，博士，教授，西华师范大学，组织修复材料工程技术协同创新中心，生命科学学院，四川省南充市 637000 匙峰，博士，副教授，西华师范大学，组织修复材料工程技术协同创新中心，生命科学学院，四川省南充市 637000 肖东琴，博士，副研究员，川北医学院第二临床学院·南充市中心医院组织工程与干细胞研究所，四川省南充市 637000
作者简介:李立斯，男，1994 年生，四川省成都市人，汉族，西华师范大学在读硕士，主要从事骨组织修复研究。
基金资助:
国家自然科学基金(82002289)，项目负责人：肖东琴；四川省自然科学基金(2022NSFSC0685)，项目负责人：肖东琴；四川省自然科学基金(23NSFSC3371)，项目负责人：张成栋；南充市市校合作科研项目(22SXJCQN0002)，项目负责人：肖东琴；南充市市校合作项目(22SXQT0385)，项目负责人：蒲超

Growth differentiation factor-5 modified by bisphosphonate promotes osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells

Li Lisi1, 2, 3, Zhang Chengdong2, Li Xiaolong2, Ye Ziyu3, Pu Chao2, Yang Zaijun1, 3, Shi Feng1, 3, Xiao Dongqin2

1Organization and Repair Materials Engineering Technology Collaborative Innovation Center, West China Normal University, Nanchong 637000, Sichuan Province, China; 2Second Clinical College of North Sichuan Medical College·Institute of Tissue Engineering and Stem Cells of Nanchong Central Hospital, Nanchong 637000, Sichuan Province, China; 3College of Life Sciences, West China Normal University, Nanchong 637000, Sichuan Province, China

Received:2022-12-19 Accepted:2023-02-11 Online:2024-01-28 Published:2023-07-10
Contact: Yang Zaijun, PhD, Professor, Organization and Repair Materials Engineering Technology Collaborative Innovation Center, West China Normal University, Nanchong 637000, Sichuan Province, China; College of Life Sciences, West China Normal University, Nanchong 637000, Sichuan Province, China Shi Feng, PhD, Associate professor, Organization and Repair Materials Engineering Technology Collaborative Innovation Center, West China Normal University, Nanchong 637000, Sichuan Province, China; College of Life Sciences, West China Normal University, Nanchong 637000, Sichuan Province, China Xiao Dongqin, PhD, Associate researcher, Second Clinical College of North Sichuan Medical College·Institute of Tissue Engineering and Stem Cells of Nanchong Central Hospital, Nanchong 637000, Sichuan Province, China
About author:Li Lisi, Master candidate, Organization and Repair Materials Engineering Technology Collaborative Innovation Center, West China Normal University, Nanchong 637000, Sichuan Province, China; Second Clinical College of North Sichuan Medical College·Institute of Tissue Engineering and Stem Cells of Nanchong Central Hospital, Nanchong 637000, Sichuan Province, China; College of Life Sciences, West China Normal University, Nanchong 637000, Sichuan Province, China
Supported by:
National Natural Science Foundation of China, No. 82002289 (to XDQ); Natural Science Foundation of Sichuan Province, No. 2022NSFSC0685 (to XDQ); Natural Science Foundation of Sichuan Province, No. 23NSFSC3371 (to ZCD); Nanchong City-School Cooperative Scientific Research Project. No. 22SXJCQN0002 (to XDQ); Nanchong City-School Cooperative Scientific Research Project. No. 22SXQT0385 (to PC)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

生长分化因子5：也被称为软骨源性形态发生蛋白1，属于骨形态发生蛋白家族的一个亚群，其与软骨和骨形成密切相关。
帕米膦酸钠：为双膦酸盐类，因含有2个磷酸基，能与磷酸钙中钙离子发生络合作用，从而能快速高效地定向于骨表面，因其与骨组织的高度亲和力和对破骨细胞的抑制作用，已被广泛用于治疗骨组织代谢性疾病。

背景：生长分化因子5作为骨形态发生蛋白的一员在软骨及骨组织修复领域表现出良好的应用潜力，增强生长分化因子5与骨组织的亲和力是提高蛋白使用效率的关键，因而开发具有骨靶向性的生长分化因子5蛋白具有重要意义。

目的：利用双膦酸盐修饰生长分化因子5并探讨改性后蛋白对小鼠成骨前体细胞生长分化的影响。
方法：采用化学交联法将生长分化因子5与帕米膦酸钠偶联，得到偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5，采用傅里叶变换红外光谱、圆二色谱对其基团及结构进行表征，利用ELISA试剂盒测定生长分化因子5与磷酸钙的结合量以及生长分化因子5的体外释放量，用于表征其体外骨靶向性。将生长分化因子5(对照组)、偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5(实验组)分别与成骨前体细胞MC3T3-E1共培养，以单独培养的细胞为空白对照，评价复合物对细胞增殖及分化等的影响。

结果与结论：①红外光谱及圆二色谱结果表明，实验成功制备了双膦酸盐/生长分化因子5复合物且蛋白二级结构无显著变化；体外磷酸钙吸附结果表明，偶联帕米膦酸钠后，生长分化因子5与磷酸钙的吸附率增加了约1倍；在半胱氨酸存在条件下，偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5的蛋白可释放出来；②CCK-8实验结果显示，实验组培养4，7 d的吸光度值高于对照组、空白对照组(P < 0.000 1)；培养7 d后，实验组碱性磷酸酶表达明显高于对照组、空白对照组(P < 0.000 1)；培养13 d后，实验组钙结节含量明显高于对照组、空白对照组(P < 0.000 1)；qRT-PCR结果检测结果显示，培养7 d后，实验组碱性磷酸酶、骨钙素及Runx2的mRNA表达高于对照组、空白对照组(P < 0.01，P < 0.001，P < 0.000 1)；③结果表明，双膦酸盐修饰有利于增强生长分化因子5与磷酸钙的结合能力，同时有利于增强其生物活性。

https://orcid.org/0000-0002-4833-0100(李立斯)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

关键词: 生长分化因子5, 双膦酸盐, 释放, MC3T3-E1细胞, 增殖, 分化

Abstract: BACKGROUND: As a member of bone morphogenetic proteins, growth differentiation factor-5 shows promising potential in the application of cartilage and bone repair. The affinity of growth differentiation factor-5 onto bone tissue determines protein use efficiency, so it is of great significance to prepare growth differentiation factor-5 with bone targeting capability.
OBJECTIVE: To modify growth differentiation factor-5 using bisphosphonates and investigate the effects of modified protein on the growth of preosteoblasts in mice.
METHODS: Pamidronate disodium/growth differentiation factor-5 complex was prepared using chemical crosslinking to couple growth differentiation factor-5 with pamidronate disodium. The functional groups and structures of the complex were characterized using Fourier transform infrared spectroscopy and circular dichromatography. To determine the bone targeting in vitro, the binding of the modified growth differentiation factor-5 with calcium phosphate and in vitro release amount of growth differentiation factor-5 were measured with an ELISA kit. Growth differentiation factor-5 (control group) and the pamidronate disodium/growth differentiation factor-5 complex (experimental group) were co-cultured with preosteoblasts MC3T3-E1. Individually cultured cells were blank controls. The effect of the complex on cell proliferation and differentiation was evaluated.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The infrared spectroscopy and circular dichromatography results indicated that the bisphosphonate/growth differentiation factor-5 complex was successfully prepared without significant changes in the protein secondary structure. In vitro protein adsorption results showed that growth differentiation factor-5 adsorption on calcium phosphate was increased by about one time after coupling with a bisphosphonate. In the presence of cysteine, growth differentiation factor-5 could be released from the bisphosphonate/growth differentiation factor-5 complex. (2) CCK-8 assay results showed that the absorbance value of the experimental group cultured for 4 and 7 days was higher than that of the control group and blank control group (P < 0.000 1).
After 7 days of culture, the expression of alkaline phosphatase in the experimental group was significantly higher than that in the control group and blank control group (P < 0.000 1). After 13 days of culture, the content of calcium nodules in the experimental group was significantly higher than that in the control group and the blank control group (P < 0.000 1). The results of qRT-PCR showed that the mRNA expression of alkaline phosphatase, osteocalcin and Runx2 in the experimental group was higher than that in the control group and the blank control group after 7 days of culture (P < 0.01, P < 0.001, P < 0.000 1). (3) These findings exhibit that bisphosphonate modification can enhance the binding capacity of growth differentiation factor-5 to calcium phosphate as well as improve its biological activity.

Key words: growth differentiation factor-5, bisphosphonate, release, MC3T3-E1 cell, proliferation, differentiation

中图分类号:

李立斯, 张成栋, 李小龙, 叶姿妤, 蒲超, 杨在君, 匙峰, 肖东琴. 双膦酸盐修饰生长分化因子5促进MC3T3-E1细胞的成骨分化[J]. 中国组织工程研究, 2024, 28(3): 373-379.

Li Lisi, Zhang Chengdong, Li Xiaolong, Ye Ziyu, Pu Chao, Yang Zaijun, Shi Feng, Xiao Dongqin. Growth differentiation factor-5 modified by bisphosphonate promotes osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2024, 28(3): 373-379.

图/表（结果） 10

2.1 偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5蛋白结构表征对照红外光谱结果可知，相比于生长分化因子5，偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5的红外光谱图谱中新增1 169，1 076及918 cm-1的峰，归属于PO43-的不对称伸缩振动峰[19]，表明偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5中含有磷酸基团，见图1。525 cm-1为二硫键的特征吸收峰[20]，表明双膦酸盐与生长分化因子5以二硫键的形式连接。综上结果表明，成功获得了双膦酸盐偶联的生长分化因子5。

接着，对生长分化因子5和偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5蛋白位于1 600-1 700 cm-1处酰胺Ⅰ带的峰进行去卷积及二阶导数拟合，见图2。

在生长分化因子5的红外图谱中，1 600-1 700 cm-1区域内由4个吸收峰组成，其中心位置分别为1 621，1 643，1 661及1 679 cm-1。类似地，在偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5的红外图谱中，1 600-1 700 cm-1区域内由4个吸收峰组成，其中心位置分别为1 623，1 640，1 660及1 676 cm-1。对比酰胺Ⅰ带峰对应蛋白二级结构，可知吸收峰1 621-1 623，1 640-1 643，1 660-1 661，1 676-1 679 cm-1分别归属于β-折叠、无规则卷曲结构、α-螺旋、β-转角。再根据峰面积计算蛋白二级结构比率，结果显示：在生长分化因子5蛋白二级结构中，α-螺旋占比31.5%，无规则卷曲占比31.5%，β-折叠占比16.6%，β-转角占比20.4%；在偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5样品中，α-螺旋占比33.6%，无规则卷曲占比33.7%，β-折叠占比18.8%，β-转角占比13.9%，见表2。

对偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5样品和生长分化因子5样品进行圆二色谱测试，结果显示两种蛋白图谱峰形、峰位无显著差别，见图3，蛋白质二级结构数据由CDPro中SELCON3模型计算。计算得到两种蛋白的二级结构各构象单元的百分含量，见表3所示。生长分化因子5蛋白的二级结构中，α-螺旋占比33.6%，无规则卷曲占比32.5%，β-折叠占比13.0%，β-转角占比19.8%；偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5样品中，α-螺旋占比37.0%，无规则卷曲占比32.5%，β-折叠占比11.9%，β-转角占比18.6%，实验结果与傅里叶红外光谱结果相符。结合红外光谱数据和圆二色谱数据表明，双膦酸盐改性前后，生长分化因子5蛋白的二级结构无显著变化。

2.2 偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5双膦酸盐结合率测定接着对偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5蛋白溶液中的磷酸根含量进行测定，结果显示，帕米膦酸钠的浓度为(12.4±1.9) nmol/L，偶联双膦酸盐的生长分化因子5的浓度为(5.8±0.4) nmol/L，即约为2个双膦酸盐分子与一个蛋白分子相结合，见图4。

2.3 偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5骨靶向性及体外释放表征利用磷酸钙吸附实验验证改性蛋白的骨靶向性，磷酸钙上偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5的吸附量为(1 516.6±14.1) ng，生长分化因子5的吸附量为(728.0±8.2) ng。由此可知，经过双膦酸盐修饰的生长分化因子5蛋白与磷酸钙微球的结合率为(75.8±5.5)%，而生长分化因子5与磷酸钙的结合率仅为(36.4±1.0)%，见图5A，这表明双膦酸盐改性后，生长分化因子5对磷酸钙及骨矿物的亲和力显著提高。
此外，进一步研究了偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5在Tris缓冲液及含半胱氨酸Tris缓冲液中的释放情况，蛋白释放结果显示：当溶液中无半光氨酸存在时，24 h后蛋白的释放量仅为(4.6±0.7) ng，而在添加半胱氨酸的溶液中，蛋白的释放量达到(20.8±3.4) ng，见图5B，这表明溶液中半光氨酸的存在有利于蛋白的释放。14 d累计释放结果显示：在含5 mmol/L半胱氨酸Tris缓冲溶液中，偶联帕米膦酸钠的生长因分化因子5的释放速率及释放量显著高于无半胱氨酸的Tris缓冲液，且释放过程中无明显突释现象，见图5C。

2.4 体外细胞实验结果
2.4.1 偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5对MC3T3-E1细胞增殖活力的影响使用含不同蛋白的培养基与MC3T3-E1细胞共培养，CCK-8实验结果表明，随着时间的延长，3组培养的细胞均表现出良好的增殖行为，培养第1天，实验组、对照组细胞增殖明显快于空白组(P < 0.001)；培养第4，7天时，实验组细胞增殖明显快于空白组、对照组(P < 0.000 1)，见图6。这表明相比于生长分化因子5，偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5在培养后期(4，7 d)可明显促进MC3T3-E1细胞的增殖。

2.4.2 偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5对MC3T3-E1细胞成骨能力的影响见图7。

碱性磷酸酶染色结果显示，实验组被染成蓝紫色的细胞数量明显最多且颜色最深，对照组次之，空白组最浅，见图7A。碱性磷酸酶试剂盒定量测试结果显示，培养7 d后，对照组细胞碱性磷酸酶表达明显高于空白组(P < 0.01)，实验组细胞碱性磷酸酶表达明显高于对照组、空白组(P < 0.000 1)，见图7C。这说明相比于生长分化因子5，偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5更有利于增强细胞的碱性磷酸酶表达。
茜素红S染色结果显示，实验组细胞周围形成的橘红色钙结节含量最多，对照组明显减少，空白组细胞周围几乎看不见橘红色钙结节，见图7B。定量分析结果显示，实验组钙结节含量明显高于对照组、空白组(P < 0.000 1)，见图7D。这表明比于生长分化因子5，偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5更有利于增强细胞的矿化能力。
综合上述，相比于生长分化因子5，偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5更有利于促进细胞的成骨分化能力。
2.4.3 偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5对MC3T3-E1细胞成骨相关基因表达的影响 qRT-PCR检测结果显示，在成骨诱导第7天时，相比于空白组，对照组及实验组显著促进细胞碱性磷酸酶、骨桥蛋白、骨钙素及Runx2 mRNA的表达(P < 0.01，P < 0.001，P < 0.000 1)；相比于对照组，实验组显著促进细胞碱性磷酸酶、骨钙素及Runx2 mRNA的表达(P < 0.01，P < 0.000 1)，见图8。这表明生长分化因子5及偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5均有利于上调细胞成骨分化相关基因的表达，而偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5促进成骨分化基因表达上调的作用更显著。

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引言

组织工程支架、种子细胞及生长因子作为组织工程的三大重要组成要素，在骨组织修复中起着重要作用。调控细胞行为并促进骨组织高效修复，不仅依赖于支架材料本身的物理化学性能，常常还需结合药物、生长因子等对细胞生长行为进行调控。生长因子作为组织再生的关键因素，通过信号传导调节细胞增殖、分化及基因表达，诱导宿主细胞迁移与生长，进而促进骨组织再生[1]。在骨组织修复领域研究较多的生长因子是骨形态发生蛋白(以骨形态发生蛋白2和骨形态发生蛋白7为主)和血管内皮生长因子。但是，外源性骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子在使用过程中造成的附近组织异位成骨及非缺血部位的附带血管化等安全问题[2-3]，促使美国食品和药物管理局越来越限制这些生物因子的使用。考虑到骨形态发生蛋白2、血管内皮生长因子的生物安全性，有必要探索其他生长因子或生长因子替代物应用于骨缺损修复。
生长分化因子5，也被称为软骨源性形态发生蛋白1，属于骨形态发生蛋白家族的一个亚群，其与软骨和骨形成密切相关[4]。作为机体生长发育的重要调节因子，生长分化因子5在肢体发育早期以及长骨骨折愈合中起着重要作用[5]。生长分化因子5能募集间充质干细胞并促进其向软骨细胞分化，进而促进软骨发生和关节形成[6-7]。近年来，生长分化因子5在骨组织修复方面的应用潜力逐渐被揭示。与骨形态发生蛋白2类似，生长分化因子5能募集和诱导间充质干细胞成骨分化[8]，同时刺激内皮细胞迁移和增殖，促进血管发生[9]。此外，LEKNES 等[10]在钛表面携载生长分化因子5植入动物体内发现，所有植入体周围无异位成骨和浆液肿形成等副反应发生。前期研究将生长分化因子5与磷酸钙支架复合，植入动物体内骨缺损处发现其能显著促进血管生成及骨组织再生[11]。因此，生长分化因子5有望作为骨形态发生蛋白2替代物应用于骨组织修复。
在以往的研究中，常采用简单吸附或共沉积方法在植入体表面引入生物活性因子，此类方法可行性取决于活性物质的化学结构以及与植入体表面的亲和力，且与植入体结合不牢的生物活性因子在释放初期易造成突释现象[12]。鉴于生物活性因子的携载和释放对其功能发挥具有重要影响，因而开发具有高度组织选择性的生物活性因子并提高生物活性因子利用率尤为关键。双膦酸盐分子因含有2个膦酸基，能与磷酸钙中钙离子发生络合作用，从而能快速高效地定向于骨表面，其与骨组织的高度亲和力和对破骨细胞的抑制作用，已被广泛用于治疗骨组织代谢性疾病[13]。此外，研究表明，双膦酸盐在抑制破骨细胞活性的同时，还能激活ERKs(extracellular signal-regulated kinases)磷酸化，促进成骨细胞增殖及成骨相关基因表达，进而促进成骨[14-15]。因此，此次研究拟将生长分化因子5与双膦酸盐偶联，以增强生长因子与磷酸钙载体或骨组织的结合能力，同时实现生长因子在骨组织周围的有效释放，以达到修复骨缺损的目的。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计化学合成、复合物理化性质表征，体外细胞学实验，
多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey检验。
1.2 时间及地点实验于2021年7月至2022年10月在南充市中心医院组织与干细胞研究所实验室、西华师范大学协同创新中心实验室完成。
1.3 材料重组人生长分化因子5(Abcam公司)；小鼠成骨前体细胞MC3T3-E1 subclone 14(上海酶研生物科技有限公司-细胞库)；N-乙基马来酰亚胺、二甲基甲酰胺、3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯、帕米膦酸钠、2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；α-MEM培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶、β-甘油磷酸钠、L-抗坏血酸-2-磷酸酯、PBS(北京索莱宝科技有限公司)；地塞米松(美国Sigma-Aldrich公司)；40 g/L多聚甲醛、CCK-8试剂盒、BCIP/NBT碱性磷酸酶显色试剂盒、茜素红染色液(上海碧云天生物技术有限公司)；PCR引物(北京擎科生物科技有限公司)；增强型BCA蛋白测定试剂盒、RIPA裂解液、TRIzol试剂(诺唯赞科技有限公司)；生长因分化因子5 ELISA试剂盒(泽叶生物科技有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 制备偶联帕米膦酸钠的重组人生长分化因子5蛋白将N-乙基马来酰亚胺溶解在二甲基甲酰胺溶液中，配置成浓度为100 mmol/L的溶液。取10 mL含100 μg/mL生长分化因子5的PBS溶液于20 mL N-乙基马来酰亚胺溶液中孵育30 min；将交联剂3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯溶于二甲基甲酰胺溶液中，配置成浓度为50 mmol/L的溶液；将孵育后的蛋白溶液离心后加入10 mL 3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯溶液中孵育2 h，未反应的试剂在PBS中经透析除去；另一方面，将帕米膦酸钠(20 mmol/L)的PBS溶液加入等体积2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐(100 mmol/L)的PBS溶液中孵育2 h，进行硫醇化；最后，将3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯处理的生长分化因子5溶液与硫醇化的帕米膦酸钠溶液等体积混合，孵育1 h，未反应的试剂通过碳酸缓冲液(100 mmol/L)及去离子水透析除去；分离后获得偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5蛋白。以上反应均在室温下进行。
利用傅里叶红外光谱(FITR，spectrum two，PerkinElmer)及圆二色谱(CD，Jasco J -810 Spectropolarimeter)测定偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5和生长分化因子5的化学基团组成及蛋白二级结构，利用SELCON3(CDPro- N. Sreerama)计算圆二色谱光谱数据。
1.4.2 双膦酸盐结合率测定根据GB/T6913-93磷钒钼黄分光光度法测定双膦酸盐在生长分化因子5中的取代度。根据酸性介质中磷酸根与钼酸根和偏钒酸根反应生成黄色磷钒钼酸配合物的原理[16]，测定磷酸根浓度。称取5 g钼酸铵和0.25 g偏钒酸铵于40 mL去离子水中，加入20 mL硫酸(5 mol/L)，将溶液稀释至100 mL。将偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5蛋白溶液1 mL加入到配制好的5 mL钼钒酸显色液中，于420 nm处测量吸光度值，吸光度值与磷酸根含量呈正比。偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5蛋白浓度采用生长分化因子5 ELISA试剂盒测定。利用双膦酸盐浓度(nmol/L)除以蛋白浓度(nmol/L)得到平均膦酸盐结合率，即每个蛋白分子结合的双膦酸盐数量。
1.4.3 双膦酸盐修饰蛋白体外骨靶向性验证及体外释放测定采用羟基磷灰石微球吸附蛋白验证其体外骨靶向性。羟基磷灰石微球的制备方法参照文献[17]。将5 mg羟基磷灰石微球加入到5 mL偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5和生长分化因子5(质量浓度均为400 ng/mL)的离心管中，100 r/min振荡3 h。高速离心(7 000 r/min离心10 min)并用缓冲液洗涤粉体。采用ELISA试剂盒测定溶液上清液蛋白浓度，对照组为不含羟基磷灰石的离心管，蛋白浓度=(不含羟基磷灰石的蛋白浓度-含羟基磷灰石的蛋白浓度)/不含羟基磷灰石的蛋白浓度×100%。配制含有0，5 mmol/L半胱氨酸的Tris缓冲液，将5 mg携载蛋白的磷酸钙加入10 mL的Tris缓冲液中，37 ℃下恒温振荡，于特定时间取上清液测定蛋白浓度。
1.4.4 双膦酸盐修饰蛋白的细胞生物学性能评价
实验分组：将MC3T3-E1细胞以1×104/孔的密度接种在24孔板中，加入1 mL α-MEM培养基(含1%双抗+体积分数10%胎牛血清)。培养24 h后吸去旧培养基，PBS洗涤3次，加入含不同蛋白的培养基，每2 d进行换液：①空白组加入α-MEM培养基；②实验组加入含100 ng/mL偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5的α-MEM培养基；③对照组加入含100 ng/mL生长分化因子5的α-MEM培养基。
细胞增殖情况测定：细胞接种1，4和7 d后，采用CCK-8法测定细胞的增殖情况。吸弃旧培养基后，以无菌PBS洗3次，随后向每孔加入200 µL CCK-8检测液与各组培养基的混合液(两者体积比为1∶10)，并置于37 ℃、体积分数5%CO2细胞培养箱中孵育1 h，孵育结束后，每孔吸取100 µL待检测液，利用酶标仪检测其在450 nm处的吸光度值。
细胞成骨分化能力测定：细胞接种7 d后，利用碱性磷酸酶染色试剂盒及定量测试评价细胞的成骨分化能力。吸弃旧培养基后以PBS洗3次，向每孔加入300 µL的0.1% TritonX-100细胞裂解液，4 ℃冰箱过夜裂解。用碱性磷酸酶检测试剂盒测量各组细胞碱性磷酸酶含量[18]。利用酶标仪检测各待测样品在405 nm波长下的吸光度值；同时，取20 µL细胞裂解上清液加入160 µL总蛋白工作液，培养箱中孵育20 min后，测定其在562 nm处的吸光度值，得到总蛋白浓度，对样品进行归一化处理，计算细胞的碱性磷酸酶活性。利用BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒对各组细胞进行染色，吸弃旧培养基，PBS洗3次后，利用40 g/L多聚甲醛固定细胞15 min，以PBS再洗3次，随后向每个培养孔内加入1 mL BCIP/NBT染色工作液，室温避光反应30 min；反应结束后，吸弃BCIP/NBT染色工作液，以PBS洗2次，利用体视显微镜观察。
细胞矿化能力测定：细胞接种13 d后，利用茜素红S染色评估各组蛋白对MC3T3-E1细胞外基质矿化能力的影响。吸弃旧培养基，以去离子水洗3次，40 g/L多聚甲醛固定15 min，以PBS洗3次，随后向每个培养孔加入1 mL的1%茜素红S染色液，染色5-10 min，染色结束后再用去离子水洗3次，吸弃去离子水，利用体视显微镜记录各组材料表面桔红色钙结节形成情况。随后，向每个培养孔内加入500 µL 10%氯代十六烷基吡啶溶解钙结节，待钙结节完全溶解后，每孔吸取100 µL溶解液，利用酶标仪测量其在562 nm波长下的吸光度值。

细胞成骨相关基因表达测定：培养第7天时，采用荧光定量PCR检测细胞成骨相关基因碱性磷酸酶、Runx2、骨桥蛋白、骨钙素mRNA的表达。利用TRIzol试剂提取细胞的总RNA，反转录成 cDNA，行qPCR扩增分析，GAPDH作为内参。相关引物序列见表1。基于RT-qPCR原理设置反应参数，预变性条件为：95 ℃ 2 min；循环条件为：95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，循环数40。

1.5 主要观察指标两种蛋白的体外骨靶向性及对MC3T3-E1细胞增殖、分化的影响。
1.6 统计学分析实验中所有数据分析均设置3个平行样，采用SPSS 23.0软件分析实验数据，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用Tukey检验，P < 0.05则认为差异有显著性意义，实验数据以x±s表示。该文统计学方法已经川北医学院生物统计学专家审核。

讨论

随着组织工程学技术的快速发展，生长因子在促进骨组织修复中的显著优势得到广泛关注和研究，但生长因子价格昂贵且存在异位成骨或异位血管化的问题，所以提高生长因子在骨组织周围的靶向沉积显得尤为重要。鉴于双膦酸盐良好的骨组织亲和力，此次实验采用3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯为交联剂，偶联双膦酸盐与生长分化因子5，合成了具有良好骨靶向性的偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5。通过蛋白二级结构分析及与磷酸钙的结合可知，偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5不仅保持了生长分化因子5的生物活性，还具有高骨矿物亲和力。与成骨前体细胞MC3T3-E1共培养实验结果表明，相比于生长分化因子5，偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5具有更为优异的促细胞增殖及成骨分化功能。
合成具有高矿物亲和力的蛋白是实现骨靶向治疗的关键所在。以往关于生长分化因子5的研究往往集中在软骨修复及再生，这可能与其早期在肢体发育的软骨原基和关节形成部位表达相关。但近年来，生长分化因子5在骨组织工程领域表现出良好的应用潜力。预实验将生长分化因子5蛋白与磷酸钙支架复合，植入动物体内骨缺损处发现其能显著促进血管生成及骨组织再生，但同时也发现此方法需要蛋白总量较多，蛋白与磷酸钙支架结合效率不高。为了提高生长因子与支架的结合效率，目前的研究往往采用明胶、壳聚糖及聚乳酸/乙醇酸共聚物等高分子材料或二氧化硅纳米微球等无机材料为载体[21]，负载生长因子以达到缓释的目的，但生长因子的释放都不具备骨靶向性，难以控制生长因子在骨组织周围的靶向递送。研究表明双膦酸盐具有良好的骨靶向性，已被用作配体制备骨靶向递送药物，但其作为生长因子靶向配体的研究较少。因此，利用双膦酸盐良好的骨靶向性开发具有高度骨亲和力的蛋白有利于将蛋白靶向输送到骨组织处，提高蛋白使用效率。作为双膦酸盐，帕米膦酸钠磷酸基团上的氧原子与骨矿物质中的钙离子形成配位络合，因而对骨组织具有强大的亲和力；此外，帕米膦酸钠侧链中含有氨基，便于对其进行化学功能修饰。因此，为了增强蛋白的骨靶向性，此次实验选用了交联剂3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯，将生长分化因子5与帕米膦酸钠偶联在一起。
3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯作为异型双功能交联剂，偶联帕米膦酸钠与生长分化因子5的原理如下：一方面3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯与蛋白质侧链的伯氨基反应，引入吡啶二硫基；另一方面，利用2-亚氨基硫烷与帕米膦酸钠上的氨基自由基反应生成巯基；最后，通过帕米膦酸钠上巯基与蛋白质上二硫键的交换，实现生长分化因子5与帕米膦酸钠的偶联[22]。相比于其他常用的蛋白质交联试剂，如戊二醛、碳化二亚胺等，3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯作为蛋白质交联剂反应容易控制、不良反应少，不易发生蛋白质自身交联，且交联后的蛋白质生物活性高，还能通过还原裂解使其再生。因此，采用3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯交联双膦酸盐与生分化因子5是一种极具应用价值的方法。
由傅里叶红外光谱检测结果可知，偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5中含有磷酸根，且观察到二硫键的形成，表明成功制备了通过二硫键偶联的双膦酸修饰生长分化因子5。定量结果表明，2个双膦酸盐分子与1个蛋白分子成功实现偶联。接着，对偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5的二级结构进行分析。红外光谱和圆二色谱测试是分析蛋白质二级结构的常用方法，其操作简便，对样品损坏小。该文红外光谱与圆二色谱分析结果一致，均表明相比于生长分化因子5蛋白的二级结构图谱，偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5的峰形、峰位并无明显变化，但偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5的α-螺旋构象占比略有上升、β-转角比例降低。α-螺旋是蛋白质中最普遍的构象，其肽链上的所有氨基酸残基均参与氢键的形成，以维持螺旋结构的稳定[23]，这表明双膦酸盐改性前后，蛋白结构的稳定性未遭到破坏，还趋向于具有更好的空间稳定性。总体来看，蛋白的二级结构无明显变化。
接着，利用蛋白与羟基磷灰石的结合作为骨亲和力测试模型。相比于生长分化因子5与磷酸钙的结合，偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5与磷酸钙的结合率提升了1倍，表明偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5与骨矿物具有良好的骨亲和力，这归因于偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5上偶联的双膦酸盐增强了蛋白的骨靶向性。相比于生长分化因子5蛋白与磷酸钙微球的表面吸附作用，在双膦酸盐磷酸基团作用下，生长分化因子5与钙离子发生络合作用，其结合效应更为牢靠且迅速。
利用3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯偶联双膦酸盐与生长分化因子5，不仅能实现生长分化因子5在骨矿物表面的靶向沉积，还能实现生长分化因子5在骨组织周围的有效释放。将吸附偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5的磷酸钙微球置于含半胱氨酸的缓冲液中，当缓冲液中无半光氨酸存在时，24 h内溶液中蛋白释放量很低；但当溶液中存在半胱氨酸时，蛋白释放量明显增加，蛋白的释放量增加4.5倍，这是由于半胱氨酸分子中含有巯基，在巯基作用下，偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5中二硫键会被裂解，进而蛋白质与双膦酸盐发生解离[24]。由于缺损骨组织所处微环境存在较多活性氧及过氧自由基等，此还原环境有利于二硫键的断裂[25]。因此，偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5结合支架植入人体后，在缺损骨组织周围能够保持有效释放。
随后，将偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5与成骨前体细胞MC3T3-E1共培养，发现相比于生长分化因子5，偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5更有利于促进细胞的增殖、碱性磷酸酶的表达、钙结节生成以及成骨相关基因的表达，这说明偶联双膦酸盐后，不仅增强了生长分化因子5的骨靶向性，还有利于增强细胞的成骨分化能力。同时大量研究表明，双膦酸盐促进骨密度增强，不仅是因为其能抑制破骨细胞功能，还由于双膦酸盐能促进成骨前体细胞和成骨细胞增殖分化[26]。双膦酸盐浓度对骨髓间充质干细胞以及成骨细胞的增殖分化具有重要影响[27]。在高浓度下(≥10-4 mol/L)，帕米膦酸钠对成骨细胞的增殖具有明显抑制作用；低浓度下(10-8 mol/L)，帕米膦酸钠对成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶活性具有明显促进作用[28]，这与此次实验观察到的结果相一致。PCR检测结果表明，偶联帕米膦酸钠的生长分化因子5和生长分化因子5能够促进成骨基因碱性磷酸酶、骨钙素及Runx2的表达，但实验组骨桥蛋白基因表达情况略低于对照组。骨桥蛋白作为一种非胶原性骨基质蛋白，在骨基质的吸收及矿化过程中起着重要作用。作为成骨细胞分化中期表达的重要指标，骨桥蛋白的表达量在分化中期达到峰值后随之下降。此次实验中实验组骨桥蛋白表达量略低，可能是由于双膦酸盐修饰生长分化因子5，有利于成骨分化快速进入后期，导致其骨桥蛋白表达量降低。相似的结果在袁斯远等[29]的研究中也观察到。综上所述，此次实验制备的双膦酸盐修饰生长分化因子5具有良好的生物活性，极有希望应用于骨组织工程及骨再生领域。但研究的局限在于尚没有对蛋白的体内骨靶向性及蛋白的体内活性展开深入研究，在下一步研究中会继续探讨。
结论：实验利用交联剂3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-琥珀酰亚胺酯成功制备了双膦酸盐偶联的生长分化因子5蛋白，一方面增强了蛋白与骨矿物的亲和力，另一方面能在半胱氨酸存在下能实现蛋白的有效释放，从而增强生长分化因子5的骨靶向性以及在骨组织周围的有效释放。细胞共培养实验结果表明，双膦酸盐修饰的生长分化因子5具有更强的促细胞增殖及成骨分化能力。实验制备的双膦酸盐修饰生长分化因子5不仅具有良好的骨靶向性，还具有优越的生物活性，有望应用于骨组织修复。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料；口腔生物材料；纳米材料；缓释材料；材料相容性；组织工程

双膦酸盐修饰生长分化因子5促进MC3T3-E1细胞的成骨分化

Growth differentiation factor-5 modified by bisphosphonate promotes osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells

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