川芎嗪对脂多糖诱导大鼠心肌细胞炎症及氧化应激的作用

doi:10.12307/2023.494

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (20): 3253-3258.doi: 10.12307/2023.494

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川芎嗪对脂多糖诱导大鼠心肌细胞炎症及氧化应激的作用

孙芳园，孟佳磊，马宇慧，耿欢，张涛

上海中医药大学附属第七人民医院，上海市 200137

收稿日期:2022-02-28 接受日期:2022-08-18 出版日期:2023-07-18 发布日期:2022-11-21
通讯作者: 张涛，副主任医师，硕士生导师，上海中医药大学附属第七人民医院，上海市 200137
作者简介:孙芳园，女，1988年生，辽宁省兴城市人，上海中医药大学毕业，硕士，主治医师，主要从事中西医结合急危重症方面的研究。
基金资助:
上海中医药大学预算内项目(2020LK078)，项目负责人：张涛；上海市健委卫生行业临床研究专项(20214Y0281)，项目负责人：孙芳园；浦东新区卫生系统浦东名中医继承人培养计划(PWRzj2020-02)，项目负责人：孙芳园；上海中医药大学附属第七人民医院人才培养计划(JCR2022-01)，项目负责人：孙芳园

Effects of ligustrazine on inflammation and oxidative stress in rat cardiomyocytes induced by lipopolysaccharide

Sun Fangyuan, Meng Jialei, Ma Yuhui, Geng Huan, Zhang Tao

Seventh People’s Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200137, China

Received:2022-02-28 Accepted:2022-08-18 Online:2023-07-18 Published:2022-11-21
Contact: Zhang Tao, Associate chief physician, Seventh People’s Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200137, China
About author:Sun Fangyuan, Master, Attending physician, Seventh People’s Hospital Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200137, China
Supported by:
Project within the budget of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, No. 2020LK078 (to ZT); Shanghai Municipal Health Commission Clinical Research Project, No. 20214Y0281 (to SFY); Pudong Famous Traditional Chinese Medicine Successor Training Program, No. PWRzj2020-02 (to SFY); Funded by Talents Training Program of the Seventh People’s Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, No. JCR2022-01 (to SFY)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

H9C2细胞：来自大鼠心脏基层的H9C2细胞，因其具有广泛的研究基础，且能够模拟人体心肌细胞的部分结构与功能，在心肌相关疾病中应用广泛。
脂多糖：是革兰阴性菌细胞壁的重要组成部分，能够通过识别细胞膜上的受体激活下游信号分子，从而促进炎症因子的产生及释放，是目前普遍认同的脓毒症相关炎性损伤性疾病的诱导剂，在构建脓毒症心肌损伤疾病细胞模型中广泛应用，能够通过Toll样受体4和核因子κB信号通路发挥作用，使促炎细胞因子大量释放。

背景：脓毒症心肌损伤与炎症反应及氧化应激损伤有关。既往研究表明川芎嗪具有抗氧化、维持钙稳态等多种功能。
目的：探讨川芎嗪对脂多糖诱导的大鼠心肌细胞炎症反应及氧化应激作用的影响。
方法：利用脂多糖(1 μg/mL)诱导大鼠心肌细胞建立脓毒症心肌细胞炎性模型，通过不同浓度的川芎嗪(40，80，160 μmol/L)干预治疗，24 h
后进行检测。利用试剂盒检测川芎嗪对脂多糖诱导H9C2细胞乳酸脱氢酶以及活性氧释放的影响，荧光显微镜观察细胞凋亡情况，检测炎症因子白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6及Toll样受体4、MyD88的表达变化。
结果与结论：①与对照组比较，模型组细胞中乳酸脱氢酶、活性氧表达水平显著上升(P < 0.05)，荧光显微镜下观察发现大量细胞被PI染色，且白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的表达水平显著升高(P < 0.05)；Toll样受体4、MyD88基因表达均显著上升(P < 0.05)； ②与模型组比较，川芎嗪治疗组能够有效降低乳酸脱氢酶释放，降低活性氧水平，抑制PI染色H9C2细胞数目，降低白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的表达水平，抑制Toll样受体4、MyD88 mRNA及蛋白的表达(P < 0.05)；③提示川芎嗪可能通过抑制Toll样受体4/MyD88的表达降低细胞的炎症因子及氧化应激反应。
https://orcid.org/0000-0003-0788-3734(孙芳园)
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 川芎嗪, 脂多糖, H9C2, 炎症, 氧化应激

Abstract: BACKGROUND: Sepsis-induced myocardial injury is related to inflammatory response and oxidative stress injury. Previous studies have shown that ligustrazine has many functions such as anti-oxidation and maintaining calcium homeostasis.
OBJECTIVE: To investigate the effects of ligustrazine on inflammation and oxidative stress in lipopolysaccharide-induced rat cardiomyocytes.
METHODS: Rat cardiomyocytes were induced by lipopolysaccharide (1 μg/mL) to establish septic cardiomyocyte inflammatory models. Twenty-four hours after intervention with different concentrations of ligustrazine (40, 80, 160 μmol/L), the samples were collected and detected. The effects of ligustrazine on the release of lactate dehydrogenase and reactive oxygen species from H9C2 cells induced by lipopolysaccharide were detected. Apoptosis was observed by fluorescence microscope. RT-qPCR was used to detect the changes of inflammatory factors such as interleukin-1 β, tumor necrosis factor-α, and interleukin-6 as well as the expression of Toll like receptor 4 and MyD88.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the normal control group, the expression of lactate dehydrogenase and reactive oxygen species in H9C2 cells increased significantly in the model group (P < 0.05) and a large number of cells were stained with propidium iodide under fluorescence microscope. The expression levels of interleukin-1β, tumor necrosis factor-α, and interleukin-6 were significantly increased (P < 0.05) and the expression of Toll like receptor 4 and MyD88 genes were significantly increased in the model group compared with the normal control group (P < 0.05). Compared with the model group, ligustrazine treatment could effectively inhibit the release of lactate dehydrogenase and reactive oxygen species, reduce the number of H9C2 cells stained by propidium iodide, downregulate the expression of interleukin-1β, tumor necrosis factor α and interleukin-6, and suppress the expression of Toll like receptor 4 and MyD88 genes (P < 0.05). To conclude, ligustrazine may reduce intracellular inflammatory factors and oxidative stress by inhibiting the expression of Toll like receptor 4/MyD88.

Key words: ligustrazine, lipopolysaccharide, H9C2, inflammation, oxidative stress

中图分类号:

孙芳园, 孟佳磊, 马宇慧, 耿欢, 张涛. 川芎嗪对脂多糖诱导大鼠心肌细胞炎症及氧化应激的作用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(20): 3253-3258.

Sun Fangyuan, Meng Jialei, Ma Yuhui, Geng Huan, Zhang Tao. Effects of ligustrazine on inflammation and oxidative stress in rat cardiomyocytes induced by lipopolysaccharide[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(20): 3253-3258.

图/表（结果） 6

2.1 CCK-8检测细胞增殖活力为确定药物干预浓度，将川芎嗪终浓度分别设置为0，1，2.5，5，10，20，40，80，160 μmol/L进行细胞干预。结果显示，与对照组相比，川芎嗪各浓度干预组差异无显著性意义(P > 0.05)，见图2，即各浓度川芎嗪对细胞增殖活力无明显影响，故选择川芎嗪40，80，160 μmol/L组作为后续实验的低、中、高浓度药物干预治疗组。

2.2 川芎嗪对脂多糖诱导的H9C2细胞乳酸脱氢酶释放量的影响脂多糖诱导的心肌细胞在不同剂量川芎嗪(40，80，160 μmol/L)处理24 h后，心肌细胞乳酸脱氢酶释放量随着川芎嗪剂量的增大而减少，具有明显的剂量依赖性，提示川芎嗪干预治疗组能够有效降低脂多糖诱导心肌细胞乳酸脱氢酶的释放(P < 0.05)，见图3。

2.3 川芎嗪对脂多糖刺激下促炎因子白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的表达白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6是重要的促炎因子，其高表达是炎症反应发生或增强的有效指标。通过荧光定量PCR检测炎症因子水平的表达，结果发现脂多糖组中白细胞介素1β、肿瘤坏死因子α和白细胞介素6的表达水平与对照组相比均上调(P < 0.05)，川芎嗪治疗干预后有效降低炎症因子的表达水平(P < 0.05)，见图4。

2.4 川芎嗪对脂多糖诱导的H9C2细胞Hochest 33342/PI双染 Hochest 33342/PI荧光双染结果显示，与对照组相比，脂多糖处理后细胞凋亡数目增多，且经PI染色标记的坏死红染细胞核数目增多，川芎嗪各浓度组中的PI标记的细胞核染色数减少，表明川芎嗪干预治疗后能够有效降低心肌细胞损伤，见图5。

2.5 川芎嗪对脂多糖诱导的H9C2细胞活性氧生成的影响活性氧检测结果显示，模型组活性氧水平与对照组相比明显增加，川芎嗪药物治疗组能够有效降低活性氧的生成，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图6。

2.6 川芎嗪对脂多糖诱导的H9C2细胞中TLR4、MyD88基因及蛋白表达的影响检测TLR4、MyD88基因及蛋白的表达，结果显示脂多糖能够诱导TLR4、MyD88表达量的提高(P < 0.05)；与模型组相比，川芎嗪干预治疗组能够有效降低TLR4、MyD88的表达量，差异有显著性意义(P < 0.05)，见图7。

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引言

脓毒症(Sepsis)通常由严重感染、创伤所致系统性炎症反应失调所致，早期的高炎症反应状态是脓毒症多器官功能障碍的重要原因。其中脓毒症心肌功能损伤是脓毒症患者出现的严重并发症之一，其引起的心肌功能障碍主要表现为心肌收缩及舒张功能的损害，以心脏扩大、心室射血分数下降以及对容量负荷收缩反应性的降低等为主要特征，具有死亡率高、救治费用高等特点[1]，因此加强脓毒症心功能障碍的防治仍是目前亟需解决的主要问题之一。
在脓毒症的疾病过程中炎症起到了重要作用，不仅能够直接影响心肌损伤，还通过影响心肌细胞的线粒体功能、氧化应激反应、心肌细胞凋亡及心脏微循环等环节，引起心功能障碍。研究表明脓毒症心功能损伤性疾病的发病机制涉及了包括遗传、结构、微血管状态改变等在内的多个因素[2]，在细胞层面难以模仿脓毒症疾病发展的整个过程，只能通过脂多糖诱导疾病发展中的某一个阶段。其中脂多糖作为革兰阴性菌细胞壁的重要组成部分，能够通过识别细胞膜上的受体激活下游信号分子，从而促进炎症因子的产生及释放[3]，脂多糖在构建脓毒症心肌损伤疾病细胞模型中被广泛应用，能够通过Toll样受体4(toll like receptor 4，TLR4)和核因子κB信号通路发挥作用，使促炎细胞因子如白细胞介素1β、白细胞介素6和肿瘤坏死因子α等释放，是目前普遍认同的脓毒症相关炎性损伤性疾病的诱导剂。中药川芎始见于《神农本草经》，为血中之气药，具有“上行头目，下调经水，中开郁结”的作用[4]，其中生物碱作为中药川芎的重要活性成分对心血管疾病具有重要保护作用[5]，进一步对中药川芎进行现代提取分离鉴定，发现生物碱含量在中药单体川芎嗪中最为丰富[6]。川芎嗪，又名四甲基吡嗪，最早发现系枯草杆菌的代谢产物，于1977年从川芎中提取、分离并结构鉴定，且研究表明川芎嗪作为中药川芎中提取的有效成分之一(化学结构式见图1)，具有丰富的药理活性[7-8]，相关研究发现川芎嗪具有保护脓毒症血脑屏障、抑制炎症反应、减轻线粒体功能损伤及细胞凋亡、减少氧自由基等作用[3，9]，且有大量研究表明川芎嗪与心血管疾病关系密切，涉及抗炎、抗氧化、钙稳态等多种作用机制[10-12]，但其在脓毒症心肌功能障碍中的作用机制尚不清晰。此次研究旨在通过脂多糖建立脓毒症心肌损伤的细胞模型，探究川芎嗪对脂多糖诱导H9C2细胞炎症及氧化应激的影响，以进一步明确其发病机制，探寻新的治疗靶点，为临床治疗脓毒症心肌功能障碍性疾病提供实验理论基础。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞模型实验，心肌细胞氧化应激损伤、凋亡等数据采用单因素方差分析。
1.2 时间及地点实验于2020 年 12 月至2022年1月在上海中医药大学实验中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验药物川芎嗪(标准品，CAS号：1124114)20 mg/瓶，购自成都普菲德对照品科技有限公司，利用细胞级二甲基亚砜配置；脂多糖购自美国Sigma，用无菌水配置。
1.3.2 细胞大鼠心肌细胞(H9C2)细胞株，购自中科院上海细胞库。
1.3.3 实验试剂胎牛血清、DMEM培养基均购自美国
Gbico；CCK8试剂盒、Hochest33342均购自大连美仑生物技术有限公司；活性氧试剂盒购自碧云天；乳酸脱氢酶试剂盒购自上海翊圣；PI试剂盒购自BD公司；TLR4、Myd88购自Santa；HRP标记二抗及GAPDH购自CST；引物由上海生工生物有限公司合成。
1.3.4 仪器细胞培养箱、细胞超净工作台、PCR扩增仪等均购自Thermo scientific公司；倒置显微镜(德国徕卡)；多功能酶标仪(美国Molecular devices)。
1.4 方法
1.4.1 细胞培养将H9C2细胞放入含有体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基中，后置于37 ℃恒温、体积分数5%CO2细胞培养箱中孵育，待细胞传两三代后进行后续实验。
1.4.2 CCK-8筛选药物浓度将H9C2细胞铺板于96孔板(5×103个/孔)，培养至对数生长期。将川芎嗪终浓度分别设置为0，1，2.5，5，10，20，40，80，160 μmol/L进行细胞干预，每组3个复孔，24 h后进行细胞增殖活力检测。弃去旧培养基，加入含90%基础培养基配置的CCK-8检测混合液100 μL/孔，37 ℃培养箱中放置两三小时后，将酶标仪波长设置为450 nm处检测各孔的吸光度(A)值并计算细胞活力。
细胞活力(%)=(A样品孔-A空白孔)/(A对照孔-A空白孔)×100%
1.4.3 乳酸脱氢酶活性测定将H9C2细胞铺板于96孔板(5×103个/孔)，24 h后弃去旧的完全培养基，加入新鲜的无血清培养基培养12 h。将细胞分为对照组、模型组及川芎嗪各治疗浓度组，其中模型组加入1 mg/L的脂多糖；川芎嗪治疗组分别利用不同浓度40，80，160 μmol/L进行干预治疗。每组设置3个复孔，药物处理24 h后参照实际说明书进行乳酸脱氢酶活性的检测。
1.4.4 Hoechst/PI双染细胞培养处理方式参照1.4.3，细胞加药处理24 h后，PBS洗涤后，避光操作，加入200 μL无血清培养基(含1∶200的Hochest33342和1∶20的PI)，37 ℃避光孵育30 min，孵育完成后，PBS轻轻洗涤一两次，于倒置荧光显微镜下进行拍照观察[13]。
1.4.5 活性氧检测细胞培养处理方式参照1.4.3，细胞加药处理24 h，PBS洗涤后，避光操作，加入200 μL无血清培养基(含1∶200 Hochest33342和1∶1 000 DCFH-DA)，37 ℃避光孵育30 min，孵育完成后，利用酶标仪在488 nm激发波长、530 nm发射波长处检测各孔A值，并进行计算。
1.4.6 荧光定量PCR检测基因的表达水平利用Trizol法提取H9C2细胞总RNA，并采用分光光度计检测A260 nm/A280 nm值及浓度，计算上样RNA量，将gDNA去除反应体系与反转录反应体系混合后，42 ℃孵育15 min(95 ℃)孵育3 min后置于冰上备用。将cDNA模板、正反向引物、2×Talent qPCR Premix按照一定的比例混合后，上机进行扩增反应，反应条件为：95 ℃(3 min)-95 ℃(5 s)-60 ℃(15 s)，利用公式2-ΔΔCt法计算基因相对表达量，并通过内参基因GAPDH进行校正。基因序列见表1。

1.4.7 Western blot检测蛋白表达水平利用蛋白质免疫印迹法检测通路蛋白表达的变化。将细胞裂解液4 ℃、12 000 r/min离心10 min后取上清液，利用BCA检测蛋白浓度。将变性后的蛋白样品电泳后转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h后洗膜，加入一抗4 ℃过夜(1∶1 000)，充分洗膜后加入HRP标记二抗(1∶1 000)，室温孵育1 h后，TBST洗膜3次，每次10 min。均匀滴加ECL化学发光液进行显色曝光拍照，利用Image J软件测得各组蛋白灰度值，计算蛋白相对表达量。
1.5 主要观察指标利用CCK-8检测细胞增殖活力，进一步检测乳酸脱氢酶活性、活性氧表达水平，Hoechst/PI染色判断心肌细胞损伤严重情况及心肌细胞凋亡，利用荧光定量PCR及蛋白印迹实验检测通路蛋白的表达水平。
1.6 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行实验数据的统计分析，计量资料以x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，以P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经上海中医药大学生物统计学专家审核。

讨论

脓毒症是机体对于严重的感染反应失调而产生的危及患者自身生命健康安全的多器官功能障碍综合征[14]，是ICU常见病、多发病[15-16]。作为血流循环动力器官，心脏最易受累及，故脓毒症患者在疾病早期就会出现不同程度的心功能障碍，而心肌功能损伤的发生也能进一步加重机体血流动力学的紊乱，从而对机体其他脏器功能及供血产生影响，加重多脏器功能的障碍[17]。因此针对脓毒症心肌损伤的治疗在一定程度上能够避免或减轻脓毒症多器官障碍综合征的产生。
川芎嗪作为中药川芎的重要有效成分，许多研究表明其在包括急性肺损伤、动脉粥样硬化等炎症性疾病中具有治疗作用[18-19]。为研究川芎嗪对脓毒症心肌损伤的作用，此次研究通过脂多糖诱导H9C2细胞建立脓毒症心肌损伤的细胞模型，相关文献表明体外研究心血管疾病最常用的是H9C2心肌细胞系，尤其涉及研究心脏疾病相关信号通路、凋亡、蛋白表达等方面[20]。相较于原代心肌细胞不可分裂传代、重复性不足的特点，H9C2细胞在具有心肌细胞的典型形态结构和特征的同时，还具有容易获取及传代培养、细胞性质相对稳定、细胞纯度较高等特点。由于H9C2细胞具有广泛的研究基础，且能够模拟人体心肌细胞的部分结构与功能，在心肌相关疾病中应用广泛。因此，在细胞系的选择上，作者选择了来自大鼠心脏基层的H9C2细胞。
炎症递质损伤、线粒体功能障碍、微循环障碍在脓毒症相关脏器损伤过程中十分重要。在脓毒症早期，肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素1β作为促炎因子广泛参与炎症反应的启动和调节[21]，抑制炎症反应能够有效改善包括心肌功能障碍、急性肾损伤等在内的脓毒症相关脏器损伤[22]。此次研究发现脂多糖诱导H9C2细胞建立脓毒症心肌损伤细胞模型后，心肌细胞中促炎因子(肿瘤坏死因子α、白细胞介素6、白细胞介素1β)水平显著升高，而川芎嗪干预治疗后能够显著抑制炎症因子的表达，提示川芎嗪具有减轻脂多糖诱导脓毒症大鼠心肌细胞的炎症反应，从而改善心肌细胞损伤。氧化应激是脓毒症诱导心肌损伤的重要发病机制，当脓毒症心肌损伤发生时，炎症及氧化应激反应能够引起线粒体功能障碍和结构破坏[12]，其中活性氧的产生与线粒体电子传递链内有氧呼吸有关，其过度产生是导致心肌功能障碍的原因之一。此次研究发现川芎嗪能够降低脂多糖诱导心肌细胞中活性氧的水平，说明川芎嗪具有抗氧化作用，这也与文献报道一致[10]。活性氧能够介导心肌细胞氧化应激反应的发生，在心肌细胞凋亡过程中起着至关重要的作用，当过多的氧自由基与蛋白质、脂类、核酸等生物大分子发生反应，在此基础上造成生物大分子变性、生物膜的损伤以及脂质过氧化的产生，从而引起心肌细胞结构和功能受损，导致细胞凋亡的发生[23-25]。乳酸脱氢酶是一种广泛存在于心肌细胞中的同工酶，当细胞发生损伤受损或细胞死亡时，乳酸脱氢酶会大量释放，可以作为衡量心肌损伤、凋亡的重要评价指标[26-27]，此次研究通过脂多糖诱导脓毒症心肌损伤细胞模型的建立，利用乳酸脱氢酶及PI染色观察脂多糖作用下心肌细胞损伤及凋亡情况，结果发现脂多糖能够诱导H9C2心肌细胞乳酸脱氢酶的释放，促进细胞凋亡，而通过不同浓度川芎嗪进行干预后，显著降低了乳酸脱氢酶释放量及PI染色入核，降低了心肌细胞损伤凋亡。
TLRs是固有免疫免疫系统中识别病原相关模式分子的主要受体，能够参与机体非特异性免疫，介导多种炎症性疾病的发生与发展[28]，其中TLR4作为研究相对广泛的TLRs家族成员，能够通过招募白细胞介素1的接头蛋白、包含TIR结构域的IFN诱导连接蛋白等相关接头分子，从而启动下游MyD88信号通路，对脂多糖具有选择性识别和应答作用，从而影响脓毒症相关性疾病的发生与发展[29-35]。为进一步探究川芎嗪在脓毒症心肌损伤疾病中的作用机制，通过检测TLR4、MyD88基因和蛋白在各组别中的表达水平，结果发现川芎嗪各干预治疗组能够有效降低TLR4、MyD88的表达水平，从而发挥对脂多糖诱导的心肌细胞损伤的保护作用。
综上所述，脂多糖诱导H9C2心肌细胞建立脓毒症心肌损伤细胞模型后，川芎嗪能够有效降低细胞凋亡及氧化应激损伤，其作用机制可能与调节TLR4/MyD88通路蛋白表达、发挥降低细胞炎症因子及氧化应激水平有关，这一发现为川芎嗪在脓毒症相关性疾病的临床应用提供了新的细胞分子学证据，为脓毒症心肌疾病的治疗提供了新思路，值得进一步深入研究与探讨。中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

川芎嗪对脂多糖诱导大鼠心肌细胞炎症及氧化应激的作用

Effects of ligustrazine on inflammation and oxidative stress in rat cardiomyocytes induced by lipopolysaccharide

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