神经源性膀胱miRNA-mRNA调控网络的筛选与验证

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (在线): 1-8.

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神经源性膀胱miRNA-mRNA调控网络的筛选与验证

郭淑慧1，杨晔1，江杨洋2，许建文1

1广西医科大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530000；2广西医科大学第四附属医院，广西壮族自治区柳州市 545000

收稿日期:2022-07-09 修回日期:2022-08-27 出版日期:2023-01-08 发布日期:2022-09-30
通讯作者: 许建文，博士，主任医师，教授，博士生导师，广西医科大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530000
作者简介:郭淑慧，女，1996年生，福建省漳浦县人，汉族，广西医科大学第一附属医院在读硕士，医师，主要从事神经、脊髓损伤的中西医结合康复研究。
基金资助:
国家自然科学基金(81960417)，项目负责人：许建文；广西自然科学基金项目(2018GXNSFAA050033)，项目负责人：许建文

Screening and validation of neurogenic bladder miRNA-mRNA regulatory network

Guo Shuhui1, Yang Ye1, Jiang Yangyang2, Xu Jianwen1

1The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2The Fourth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Liuzhou 545000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Guo Shuhui, Master candidate, Physician, The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2022-07-09 Revised:2022-08-27 Online:2023-01-08 Published:2022-09-30
Contact: Xu Jianwen, MD, Chief physician, Professor, Doctoral supervisor, The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Guo Shuhui, Master candidate, Physician, The First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University, Nanning 530000, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81960417 (to XJW); Guangxi Natural Science Foundation Project, No. 2018GXNSFAA050033 (to XJW)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：

神经源性膀胱：是一种由于神经损伤导致的膀胱功能障碍，表现为尿急、尿频、排尿不尽、排尿费力和尿失禁，严重影响患者的生活质量；随着疾病的进展，患者可能出现泌尿系感染、肾积水甚至肾功能衰竭，严重者可危及生命。
脑源性神经营养因子：是一种神经营养因子蛋白，可以促进轴突生长、抑制神经炎症、保护神经细胞免受氧化应激，是神经组织损伤修复的关键调控因子。

摘要
背景：miRNA-mRNA调控网络在各种生物过程中发挥重要作用，但其在脊髓损伤后神经源性膀胱中的具体作用机制尚不清楚。
目的：基于生物信息学挖掘神经源性膀胱的相关靶点，并构建miRNA-mRNA调控网络，加以动物实验验证。
方法：从GEO数据库筛选神经源性膀胱的差异基因，构建miRNA-mRNA调控网络。利用David数据库对差异基因进行GO和KEGG分析，利用STRING数据库进行PPI分析，并通过Cytoscape和ROC曲线筛选关键基因，最终通过神经源性膀胱大鼠模型对关键基因进行RT-PCR验证。
结果与结论：①共筛选出188个神经源性膀胱的差异基因，GO及KEGG分析发现其主要在炎症反应、Cytokine-cytokine受体相互作用、趋化因子信号通路等方面显著富集；通过Cytoscape及ROC曲线结果筛选出miR-147-脑源性神经营养因子和miR-362-5p-Scn9a 2个关键调控网络；②RT-PCR检测结果显示，与对照组比较，神经源性膀胱模型大鼠中miR-147、miR-362-5p、脑源性神经营养因子表达量上调，Scn9a基因下调；③结果提示，miR-147-脑源性神经营养因子、miR-362-5p-Scn9a作为炎症、氧化应激等病理生理过程的重要调控因子，有望成为诊断和治疗神经源性膀胱的新靶点。

关键词: 神经源性膀胱, 脊髓损伤, 生物信息学, GEO数据库, 差异基因, 调控网络, miRNA-mRNA, 炎症, 氧化应激

Abstract: Abstract
BACKGROUND: The miRNA-mRNA regulatory network plays an important role in various biological processes, but its specific mechanism in neurogenic bladder after spinal cord injury remains unclear.
OBJECTIVE: To mine the related targets of neurogenic bladder based on bioinformatics and to construct the miRNA-mRNA regulatory network, verified by animal experiments.
METHODS: The differential genes of neurogenic bladder were screened from GEO database to construct the miRNA-mRNA regulatory network. The differential genes were analyzed by gene ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes analyses using the David database. Protein-protein interaction analysis was performed using the STRING database. Key genes were identified by Cytoscape and ROC curves. Finally the key genes were validated by RT-PCR in a rat model of neurogenic bladder.
RESULTS AND CONCLUSION: A total of 188 differential genes related to neurogenic bladder were identified. Gene ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes analyses revealed that they were enriched mainly in inflammatory response, cytokine-cytokine receptor interaction, and chemokine signaling pathway. Two key regulatory networks, miR-147-brain-derived neurotrophic factor and miR-362-5p-Scn9a, were identified based on the Cytoscape and ROC curve results. RT-PCR results showed that miR-147, miR-362-5p, and brain-derived neurotrophic factor were highly expressed in the neurogenic bladder rats, while Scn9a was lowly expressed compared with the control rats. Overall, these findings indicate that miR-147-brain-derived neurotrophic factor and miR-362-5p-Scn9a actas important regulators of pathophysiological processes such as inflammation and oxidative stress, which are expected to become new targets for the diagnosis and treatment of neurogenic bladder.

Key words: neurogenic bladder, spinal cord injury, bioinformatics, GEO database, differential genes, regulatory network, miRNA-mRNA, inflammation, oxidative stress

中图分类号:

郭淑慧, 杨晔, 江杨洋, 许建文. 神经源性膀胱miRNA-mRNA调控网络的筛选与验证[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-8.

Guo Shuhui, Yang Ye, Jiang Yangyang, Xu Jianwen. Screening and validation of neurogenic bladder miRNA-mRNA regulatory network[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(在线): 1-8.

图/表（结果） 14

2.1 差异基因筛选根据|logFC|>2，P < 0.05进行筛选后，得到脊髓损伤后第7，14，28天的差异基因各1 098，397，985个，将筛选结果通过火山图显示，详见图1。并根据logFC筛选每个时间点差异最明显的10个基因(上调与下调各5个)绘制热图，详见图2。将3个时间点的差异基因进行取交集后得到188个共同差异基因，详见图3。

2.2 miRNA-mRNA网络构建 188个差异基因经miRwalk和miRDB数据库预测与筛选后共得到168个miRNA，根据结果删除无法预测到miRNA的mRNA后共剩余58个mRNA。将最终结果导入cytoscape 3.8.0构建miRNA-mRNA网络，见图4。

2.3 PPI网络构建及Hub基因筛选结果将58个mRNA导入STRING数据库进行蛋白质互作网络，该网络共有节点58个，214条边。互作结果导入cytoscape 3.8.0进行可视化，如图5所示。通过cytoHubba插件筛选Degree排名前10的Hub基因，详见表2、图6。

2.4 潜在诊断生物标志物筛选 ROC曲线结果表明，AUC值范围在0.778-1.000之间(表3)，提示筛选出的Hub基因具有良好的诊断价值。其中，脑源性神经营养因子、Scn9a、Tubb3、Atp1a2、Slc6a1、Cxcl1在脊髓损伤后第7，14，28天的AUC 值都为1，表明这些基因可能是潜在诊断生物标志物；分析miRNA-mRNA网络，发现以上6个潜在诊断生物标志物共对应22个miRNA，具体见表4。通过文献查询对22个miRNA进一步交叉验证，采用SHANG等[7]通过 MiRs芯片检测神经源性膀胱组间差异表达的miRNAs数据作为验证数据，发现在 SHANG 等的研究中，rno-miR-147 和 rno-miR-362-5p在脊髓损伤后 7，14，28 d 表达量均明显上调。
以上生信分析结果表明，相较于对照组，脊髓损伤组大鼠膀胱组织中rno-miR-147、rno-miR-362-5p、脑源性神经营养因子、Scn9a的表达量在脊髓损伤后7，14，28 d天都存在显著差异，提示rno-miR-147-脑源性神经营养因子与
rno-miR-362-5p-Scn9a可能在脊髓损伤后神经源性膀胱的发生、发展过程中有重要作用，有望成为后续神经源性膀胱康复治疗的重要靶点，值得进一步研究。实验将从疾病早期入手，对生物信息学所预测到的rno-miR-147-脑源性神经营养因子、rno-miR-362-5p-Scn9a进行RT-PCR验证,以初步鉴定脊髓损伤后神经源性膀胱的miRNA-mRNA调控网络。

2.5 差异基因功能富集分析结果将58个差异基因进行GO富集分析，经P < 0.05筛选后，共富集到23项生物过程、8项分子功能和9项细胞组分，见图7、表5(生物过程只列出前10项)。在分子功能方面，差异基因主要与炎症反应、钠离子的跨膜转运、中性粒细胞趋化性、细胞对白细胞介素1的反应等相关功能相关；在细胞功能方面，主要参与趋化因子活动，结合低聚糖、肝素、钠离子、碳水化合物以及与CXCR趋化因子受体结合相关；在细胞组分方面，差异基因主要参与构成细胞外空间、轴突、神经元胞体等重要细胞成分。

2.6 差异基因KEGG通路富集分析结果经David数据库富集分析，结果显示58个差异基因共富集到16条信号通路，主要参与病毒蛋白与细胞因子及细胞因子受体的相互作用、Cytokine-cytokine受体相互作用、趋化因子信号通路、疟疾、类风湿性关节炎、白细胞介素17信号通路、脂质和动脉粥样硬化、TLR信号通路、恰加斯氏病、肿瘤坏死因子信号通路等相关通路。将P < 0.05的通路通过气泡图及表格展示，详见图8、表6。

2.7 两组大鼠膀胱RT-PCR检测结果相较于对照组，脊髓损伤组大鼠膀胱组织中的miR-147、脑源性神经营养因子及miR-362-5p mRNA表达量上调(P < 0.05，P < 0.01)，Scn9a mRNA表达量显著下调(P < 0.01)，详见图9。

参考文献

[1] SHANG Z, JIA C, YAN H, et al. Injecting RNA interference lentiviruses targeting the muscarinic 3 receptor gene into the bladder wall inhibits neurogenic detrusor overactivity in rats with spinal cord injury. Neurourol Urodyn. 2019;38(2): 615-624.
[2] STOVER SL, DEVIVO MJ, GO BK. History, implementation, and current status of the National Spinal Cord Injury Database. Arch Phys Med Rehabil. 1999;80(11): 1365-1371.
[3] 孟祥志,崔慎红,侯晓倩,等.国际国内神经源性膀胱相关研究的可视化分析[J].中国康复理论与实践,2022,28(4): 439-446.
[4] LIM V, MAC-THIONG J M, DIONNE A, et al. Clinical Protocol for Identifying and Managing Bladder Dysfunction during Acute Care after Traumatic Spinal Cord Injury. J Neurotrauma. 2021;38(6): 718-724.
[5] GUO W, SHAPIRO K, WANG Z, et al. Restoring both continence and micturition after chronic spinal cord injury by pudendal neuromodulation. Exp Neurol. 2021;340: 113658.
[6] LIN L, HU K. MiR-147: Functions and Implications in Inflammation and Diseases. Microrna. 2021;10(2): 91-96.
[7] SHANG Z, OU T, XU J, et al. MicroRNA expression profile in the spinal cord injured rat neurogenic bladder by next-generation sequencing. Transl Androl Urol. 2020;9(4): 1585-1602.
[8] CRUZ C D, COELHO A, ANTUNES-LOPES T, et al. Biomarkers of spinal cord injury and ensuing bladder dysfunction. Adv Drug Deliv Rev. 2015;82-83: 153-159.
[9] KAMBOONLERT K, PANYASRIWANIT S, TANTISIRIWAT N, et al. Effects of Bilateral Transcutaneous Tibial Nerve Stimulation on Neurogenic Detrusor Overactivity in Spinal Cord Injury: A Urodynamic Study. Arch Phys Med Rehabil. 2021;102(6): 1165-1169.
[10] GROSS O, LEITNER L, RASENACK M, et al. Detrusor sphincter dyssynergia: can a more specific definition distinguish between patients with and without an underlying neurological disorder? Spinal Cord. 2021;59(9): 1026-1033.
[11] BIRKHÄUSER V, LIECHTI MD, ANDERSON CE, et al. TASCI-transcutaneous tibial nerve stimulation in patients with acute spinal cord injury to prevent neurogenic detrusor overactivity: protocol for a nationwide, randomised, sham-controlled, double-blind clinical trial. BMJ Open. 2020;10(8): e039164.
[12] WU SY, JIANG YH, JHANG JF, et al. Inflammation and Barrier Function Deficits in the Bladder Urothelium of Patients with Chronic Spinal Cord Injury and Recurrent Urinary Tract Infections. Biomedicines. 2022;10(2):220.
[13] TOGAN T, AZAP OK, DURUKAN E, et al. The prevalence, etiologic agents and risk factors for urinary tract infection among spinal cord injury patients. Jundishapur J Microbiol. 2014;7(1): e8905.
[14] GONG L, LV Y, LI S, et al. Changes in transcriptome profiling during the acute/subacute phases of contusional spinal cord injury in rats. Ann Transl Med. 2020;8(24): 1682.
[15] BAEK A, CHO SR, KIM SH. Elucidation of Gene Expression Patterns in the Brain after Spinal Cord Injury. Cell Transplant. 2017;26(7): 1286-1300.
[16] CAO S, YUAN J, ZHANG D, et al. Transcriptome Changes In Dorsal Spinal Cord Of Rats With Neuropathic Pain. J Pain Res. 2019;12: 3013-3023.
[17] BELADI RN, VARKOLY KS, SCHUTZ L, et al. Serine Proteases and Chemokines in Neurotrauma: New Targets for Immune Modulating Therapeutics in Spinal Cord Injury. Curr Neuropharmacol. 2021; 19(11): 1835-1854.
[18] RUTKOWSKI MD, DELEO JA. The Role of Cytokines in the Initiation and Maintenance of Chronic Pain. Drug News Perspect. 2002;15(10): 626-632.
[19] KIGERL KA, LAI W, WALLACE LM, et al. High mobility group box-1 (HMGB1) is increased in injured mouse spinal cord and can elicit neurotoxic inflammation. Brain Behav Immun. 2018;72: 22-33.
[20] NIE H, JIANG Z. Bone mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles deliver microRNA-23b to alleviate spinal cord injury by targeting toll-like receptor TLR4 and inhibiting NF-κB pathway activation. Bioengineered. 2021;12(1): 8157-8172.
[21] STIRLING DP, CUMMINS K, MISHRA M, et al. Toll-like receptor 2-mediated alternative activation of microglia is protective after spinal cord injury. Brain. 2014,137(Pt 3): 707-723.
[22] STIVERS NS, PELISCH N, OREM BC, et al. The toll-like receptor 2 agonist Pam3CSK4 is neuroprotective after spinal cord injury. Exp Neurol. 2017;294: 1-11.
[23] HERMAN P, STEIN A, GIBBS K, et al. Persons with Chronic Spinal Cord Injury Have Decreased Natural Killer Cell and Increased Toll-Like Receptor/Inflammatory Gene Expression. J Neurotrauma. 2018;35(15): 1819-2189.
[24] BUTENSCHöN J, ZIMMERMANN T, SCHMAROWSKI N, et al. PSA-NCAM positive neural progenitors stably expressing BDNF promote functional recovery in a mouse model of spinal cord injury. Stem Cell Res Ther. 2016;7: 11.
[25] YOO JM, LEE BD, SOK DE, et al. Neuroprotective action of N-acetyl serotonin in oxidative stress-induced apoptosis through the activation of both TrkB/CREB/BDNF pathway and Akt/Nrf2/Antioxidant enzyme in neuronal cells. Redox Biol. 2017;11: 592-529.
[26] CAI H, WANG Y, HE J, et al. Neuroprotective effects of bajijiasu against cognitive impairment induced by amyloid-β in APP/PS1 mice. Oncotarget. 2017;8(54): 92621-92634.
[27] TIAN WJ, JEON SH, ZHU GQ, et al. Effect of high-BDNF microenvironment stem cells therapy on neurogenic bladder model in rats. Transl Androl Urol. 2021;10(1): 345-355.
[28] VIZZARD MA. Changes in urinary bladder neurotrophic factor mRNA and NGF protein following urinary bladder dysfunction. Exp Neurol. 2000;161(1): 273-284.
[29] LI F, WANG X, YANG L. MicroRNA-147 targets BDNF to inhibit cell proliferation, migration and invasion in non-small cell lung cancer. Oncol Lett. 2020;20(2): 1931-1937.
[30] LIU G, FRIGGERI A, YANG Y, et al. miR-147, a microRNA that is induced upon Toll-like receptor stimulation, regulates murine macrophage inflammatory responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106(37): 15819-15824.
[31] JIANG C, WU X, LI X, et al. Loss of microRNA-147 function alleviates synovial inflammation through ZNF148 in rheumatoid and experimental arthritis. Eur J Immunol. 2021;51(8): 2062-2073.
[32] WU CG, HUANG C. MicroRNA-147 inhibits myocardial inflammation and apoptosis following myocardial infarction via targeting HIPK. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2020; 24(11): 6279-6287.
[33] DU Y, YANG F, LV D, et al. MiR-147 inhibits cyclic mechanical stretch-induced apoptosis in L6 myoblasts via ameliorating endoplasmic reticulum stress by targeting BRMS1. Cell Stress Chaperones. 2019;24(6): 1151-1161.
[34] COX JJ, REIMANN F, NICHOLAS AK, et al. An SCN9A channelopathy causes congenital inability to experience pain. Nature. 2006;444(7121): 894-598.
[35] DIB-HAJJ SD, RUSH AM, CUMMINS TR, et al. Gain-of-function mutation in Nav1.7 in familial erythromelalgia induces bursting of sensory neurons. Brain. 2005;128(Pt 8): 1847-1854.
[36] NASSAR MA, STIRLING LC, FORLANI G, et al. Nociceptor-specific gene deletion reveals a major role for Nav1.7 (PN1) in acute and inflammatory pain. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004; 101(34): 12706-12711.
[37] WEI X, WANG B, WANG Q, et al. MiR-362-5p, Which Is Regulated by Long Non-Coding RNA MBNL1-AS1, Promotes the Cell Proliferation and Tumor Growth of Bladder Cancer by Targeting QKI. Front Pharmacol. 2020;11: 164.
[38] CHEN Y, LIN L, HU X, et al. Silencing of circular RNA circPDE5A suppresses neuroblastoma progression by targeting the miR-362-5p/NOL4L axis. Int J Neurosci. 2021: 1-11.doi: 10.1080/00207454.2021.1896505.
[39] LIU B, LUO C, LIN H, et al. Long Noncoding RNA XIST Acts as a ceRNA of miR-362-5p to Suppress Breast Cancer Progression . Cancer Biother Radiopharm. 2021;36(6): 456-466.

引言

材料方法

1.1 设计生物信息学分析+体内实验验证。
1.2 时间及地点实验于2022-05-01/06-30在广西医科大学完成。
1.3 材料健康成年雌性SD大鼠6只，体质量(200±20) g，SPF级，六七周龄，购买于广西医科大学实验动物中心，许可证编号SYXK(桂)2020-0004，单笼饲养，环境温度25 ℃，12 h交替明暗光照。按照随机数字法分为对照组和脊髓损伤组，每组3只。实验方案已得到广西医科大学动物实验伦理委员会批准(编号：202205001)。
1.4 实验方法
1.4.1 资料来源从GEO(gene expression omnibus，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)数据库下载脊髓损伤后神经源性膀胱大鼠的基因表达芯片数据集GSE197544，其基因芯片测序平台为GPL23945，该数据集共包括12例样本，其中对照组膀胱样本3例，脊髓损伤后第7，14，28天的神经源性膀胱各3例。
1.4.2 差异基因筛选利用R软件(R.4.2.0)和BiocManager
(1.30.18)下的DESeq2(1.36.0)包对4组大鼠膀胱样本的mRNA表达情况进行整理与分析，并根据|logFC|>2，P < 0.05分别筛选脊髓损伤后7，14，21 d的差异基因，并将脊髓损伤后3组差异基因进行交集，得到3个时间点均差异明显且有统计学意义的差异基因。
1.4.3 miRNA-mRNA网络构建将得到的差异基因导入miRwalk数据库，物种选择大鼠，设置相关性绝对值大于0.95，预测可能与mRNA结合的miRNA，并进一步筛选在miRDB数据库也可预测到的miRNA，将最终预测结果导出并整理去除无法预测到对应miRNA的mRNA，将文件导入cytoscape 3.8.0构建miRNA-mRNA网络。
1.4.4 PPI网络构建及Hub基因筛选将差异基因导入STRING(https://cn.string-db.org/)数据库进行蛋白间的互作分析，设置置信度为0.15，其余选择默认设置，将结果导出到cytoscape3.8.0进行可视化，并利用cytoHubba插件根据靶点的Degree值筛选排名前10的关键基因。
1.4.5 ROC曲线绘制利用R软件(R.4.2.0)提取GSE197544数据集中10个关键基因的表达量数据，采用pROC函数绘制ROC曲线，评价10个关键基因在脊髓损伤后7，14，28 d预测疾病的灵敏度和特异度，并根据结果进一步筛选在脊髓损伤后神经源性膀胱中具有诊断意义的关键mRNA。
1.4.6 GO及KEGG分析利用David数据库对差异基因进行基因本体论(GO)分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路分析，寻找差异基因发挥作用的相关机制。
1.4.7 关键miRNA-mRNA实验验证
确定关键miRNA-mRNA：根据基因在PPI网络中的Degree值和ROC 曲线结果确定关键的 mRNA，通过构建的 miRNA-mRNA 网络寻找关键mRNA 所对应的 miRNA，并进一步通过查询文献对 miRNA 进行筛选，得到最终进行实验验证的 miRNA-mRNA。

脊髓损伤神经源性膀胱模型制备：3%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉6只实验大鼠。备皮后将大鼠俯卧位固定，用碘伏消毒手术区域。根据肋骨定位至T10棘突，常规行椎板切除术，暴露脊髓。将10 g金属棒从50 mm处自由下落，造成脊髓损伤。对照组大鼠只剥离椎板和暴露脊髓但不损伤脊髓。术后逐层缝合伤口，腹腔注射青霉素8万U抗感染，每天1次，持续3 d。术后每天手动辅助大鼠排尿排便3次。大鼠正常进食、饮水，独笼饲养。

造模成功标准：①下肢运动功能评判：大鼠依靠前肢拖行，双后肢无任何活动，BBB评分为0分；②膀胱功能评价：脊髓损伤组大鼠体表可触及明显鼓胀的膀胱，可见下腹部及垫料潮湿。

取材及实时荧光定量PCR检测：术后第7天，麻醉两组大鼠，在冰上取大鼠膀胱，使用4 ℃无菌生理盐水下漂洗，并用滤纸吸取多余水分。用NucleoZol RNA试剂(Macherey-Nagel，Germany)从对照组和脊髓损伤组大鼠膀胱中提取总RNA：将膀胱组织尽量剪碎后置于研磨管，于冰上研磨膀胱组织，按照说明书添加NucleoZol RNA试剂，经均质化、沉淀污染物、沉淀RNA、洗涤RNA及溶解RNA，最终得到膀胱组织的总RNA。用Takara的反转录试剂(RR047A和RR036A，Japan)对RNA进行反转录；使用TB Green Premix Ex Taq II(RR820A，Japan)在7500荧光定量PCR仪(Applied Biosystems，USA)上对cDNA进行扩增。mRNA和miRNA内参基因分别为GAPDH和U6。所有基因对应的引物见表1。两组样本cDNA的相对表达量用2-ΔΔCt法计算。

1.5 主要观察指标基于生物信息学挖掘神经源性膀胱的相关靶点，并构建miRNA-mRNA调控网络。
1.6 统计学分析两组间的差异显著性采用独立样本T检验，P < 0.05为差异有显著性意义。所采用的统计学软件为SPSS Statistics 17。统计学方法已由广西医科大学统计学专家盛依米审核。

讨论

在脊髓损伤后，膀胱因脊髓休克而经历一段无反射期，此时大脑皮质对膀胱失去控制，患者无法自主排尿出现尿潴留现象。但随着脊髓损伤的进展，6-12周后一些神经回路重组，脊髓低级中枢所介导反射排尿开始出现[8]。骶上脊髓损伤患者骶髓中的副交感神经和骶髓感觉中心不受损害，故膀胱充盈时膀胱壁感受器可正常兴奋并将兴奋经盆神经传至骶髓低级中枢，但上行信号在骶上脊髓损伤处中断，无法成功传至大脑皮质，因此大脑皮质无法对低级排尿中枢进行控制，导致膀胱充盈时患者出现不自主的膀胱收缩，被称为神经源性逼尿肌过度活动[9]。此外，由于脑桥对尿道外括约肌失去调控，患者可出现膀胱逼尿肌和膀胱括约肌同时收缩，阻碍膀胱排空并导致膀胱内压增高，称为逼尿肌-括约肌协同失调[10]，严重的逼尿肌-括约肌协同失调可导致严重的膀胱出口梗阻，最终导致肾功能严重恶化，危及患者的长期生存[11]。可见，脊髓损伤后神经源性膀胱的治疗是脊髓损伤患者康复的重要一部分。但目前神经源性膀胱的病理生理机制不清，缺乏有效的干预方法，所以，此次实验从分子机制上探究神经源性膀胱的病理机制，为进一步发掘更高效的治疗方法奠定基础。
实验基于GEO数据库得到大鼠神经源性膀胱的膀胱组织测序数据，通过生物信息学分析得到188个在脊髓损伤7，14，28 d 3个时间段都是明显差异表达的基因，综合分析后构建了神经源性膀胱相关的miRNA-mRNA网络，并筛选出潜在的生物标志物，并进一步通过RT-PCR技术进行实验验证，为后续治疗提供新的靶点。
通过对差异基因进行GO分析，发现差异基因主要参与构成细胞的外空间、轴突、神经元胞体、神经元投射等细胞成分，说明所筛选出的差异基因与脊髓损伤后的神经元重塑息息相关。在分子功能方面，差异基因能够参与炎症反应、细胞对白细胞介素1的反应、信号转导等。尿路感染是脊髓损伤后神经源性膀胱的最常见并发症之一[12]，研究表明，有22%的急性脊髓损伤患者在脊髓损伤后50 d内发生尿路感
染[13]，这些差异基因的表达变化可能与脊髓损伤后尿路感染的发生有关。
KEGG富集分析显示差异基因主要富集在Cytokine-
Cytokine受体相互作用、趋化因子信号通路、白细胞介素17信号通路、TLR信号通路等相关通路。细胞因子是可溶性细胞外蛋白或糖蛋白，能够参与先天性和适应性炎症宿主防御、细胞生长、分化、细胞死亡、血管生成以及恢复体内平衡，是机体修复损伤过程的重要细胞间调节剂和动员者。在既往研究中，对差异基因进行KEGG分析，结果显示相较于各自对照组，在挫伤性脊髓损伤的受损脊髓局部[14]、大鼠脊髓损伤后的脑组织及神经病理性疼痛大鼠的脊髓后角神经元中[15-16]，Cytokine-cytokine 受体相关作用通路是富集到的重要调控通路之一，提示该通路可能参与脊髓损伤后全身各个系统的调节和修复，在脊髓损伤相关疾病中有重要作用。趋化因子是一种结构和功能相关的蛋白质家族，是炎症过程的重要介质[17]。神经损伤后，白细胞上的趋化因子可以控制白细胞向损伤部位迁移的过程，从而导致局部炎症的发生[18]。TLR通过免疫细胞表达的模式识别受体，其激活触发核因子kB转录因子的激活，进而促进炎症细胞因子和趋化因子的产生；研究表明脊髓损伤后，内源性TLR4可以通过影响其配体HMGB1的表达进而调节炎症相关因子白细胞介素1的表达[19]；NIE等[20]在脊髓损伤大鼠模型中发现，过表达TLR4会加重脊髓组织的炎症反应；此外，研究表明，TLR2在脊髓损伤后可以保护轴突，促进髓鞘形成[21-22]。以上提示TLR信号通路可能是脊髓损伤慢性炎症持续的一个重要机制[23]，且与脊髓损伤后髓鞘再生紧密相关。因此，这些差异基因可能通过趋化因子信号通路和TLR信号通路参与神经源性膀胱炎症的发生，这也为探索控制神经源性膀胱患者炎症的治疗方案开辟了新的方向。
通过PPI分析，并运用cytohubba插件根据Degree法筛选核心基因，得到Degree前10位基因：脑源性神经营养因子、Sell、Mx1、Scn9a、Tubb3、Cntn4、Atp1a2、Slc6a1、Rnd1和Cxcl1，并构建ROC曲线判断这10个基因预测疾病的灵敏度和特异度，发现这些差异基因均具有良好的诊断价值。通过在线数据库查找这10个基因对应的miRNA，得到神经源性膀胱对应的关键miRNA-mRNA调控网络，进一步查阅文献对所构建的关键网络进行验证，最终得到2个目标miRNA-mRNA对：rno-miR-147和脑源性神经营养因子、
rno-miR-362-5p和Scn9a。构建神经源性膀胱大鼠模型对预测结果进行实验验证，发现相较于对照组，miR-147、miR-362-5p
和脑源性神经营养因子在脊髓损伤模型组大鼠中表达量上升，Scn9a表达量降低，与生物信息学预测结果相一致。脑源性神经营养因子是一种神经营养素，为神经组织损伤修复的关键调控因子，研究发现在祖细胞中稳定表达脑源性神经营养因子可以有效修复受损的神经组织[24]，具体机制可能与保护神经细胞免受氧化应激和抑制神经炎症有关[25-26]。在神经损伤大鼠神经源性膀胱模型中，增加脑源性神经营养因子表达可以有效修复局部微环境下的神经损伤，其机制可能与减少细胞凋亡相关[27]。在此次实验中，脊髓损伤模型组大鼠的脑源性神经营养因子mRNA表达量上升，与前人的研究相一致[28]。结合之前的研究结果，推测模型组膀胱组织中脑源性神经营养因子的mRNA 表达量上升，可能与损伤后机体自行启动修复机制相关。研究表明，miR-147是神经源性膀胱大鼠中表达上调的差异基因[7]，虽然miR-147与脑源性神经营养因子的关系尚未在神经源性膀胱领域中得到进一步证实，但在非小细胞肺癌的相关研究中，已通过双荧光素酶实验表明miR-147能够与脑源性神经营养因子靶向结合，miR-147的过表达抑制了脑源性神经营养因子的表达[29]。在既往研究中，miR-147主要参与在调节炎症反应[30-32]；此外，miR-147也被证明可通过降低细胞凋亡从而减轻内质网应激[33]。综上，通过miR-147靶向调控脑源性神经营养因子可能是神经源性膀胱后续研究值得关注的一个重点。
Scn9a是传导疼痛信号的重要因子，能够编码Nav1.7，这是河豚毒素敏感的电压门控钠通道的一个亚基，在外周感觉神经元中高水平表达，尤其是在背根神经节的神经元中[34]，被证明与人类的痛觉相关[35]。痛觉已经进化成一种保护机制，它允许生物体探测到组织损伤，然后在修复发生时调节其活动[34]。研究表明，痛觉神经元中缺乏Nav1.7的小鼠在炎症性疼痛症状的发展中出现显著缺陷[36]。此次实验中，脊髓损伤模型组大鼠Scn9a mRNA表达量下调，可能导致炎症出现时机体无法及时感知并对其进行修复，从而加重疾病的发展。miR-362-5p作为可能靶向调控Scn9a的miRNA，在诸多癌症相关疾病中被研究，包括膀胱癌[37]、神经母细胞瘤[38]、乳腺癌等[39]，但是在脊髓损伤和神经源性膀胱中尚未涉及，可作为进一步研究的靶点。
综上所述，通过生物信息学分析和动物实验验证，发现miR-147和脑源性神经营养因子、miR-362-5p和Scn9a在神经源性膀胱大鼠膀胱中存在显著差异性表达，可能是诊断和治疗神经源性膀胱的关键基因，这为今后神经源性膀胱的诊断和治疗提供一种新思路。但文章也存在一定的局限性：首先，由于神经源性膀胱相关数据集较少，因此所获得的样本数有限；其次，初步筛选出调控神经源性膀胱的miRNA-mRNA网络，但缺乏双荧光素酶报告实验等更多的研究来验证miRNA-mRNA调控网络模式的体内外生物学功能。但总的来说，此次实验为进一步深入探讨神经源性膀胱的作用机制与治疗提供靶点和参考方向。

神经源性膀胱miRNA-mRNA调控网络的筛选与验证

Screening and validation of neurogenic bladder miRNA-mRNA regulatory network

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[1]	何宛俞, 程乐平. 干细胞移植修复脊髓损伤的策略与进展[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-7.
[2]	方兴艳, 田侦丽, 赵哲仪, 文平, 谢婷婷. 亚砷酸钠对人脐静脉内皮细胞损伤及鞘氨醇激酶1/1-磷酸鞘氨醇信号轴的影响[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(在线): 1-7.
[3]	党祎, 杜成砚, 姚红林, 袁能华, 曹金, 熊山, 张顶梅, 王信. 激素型骨坏死与氧化应激[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(9): 1469-1476.
[4]	阮凌, 王光华, 吴荣平, 晋战, 吕镇庆, 张楠, 李寿邦. 运动强度与高脂饮食模型大鼠脂代谢紊乱和氧化应激的相关性[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1149-1155.
[5]	杨九杰, 李治, 王树杰, 田野, 赵伟. 神经电生理监测硬脊膜切开减压治疗急性脊髓损伤过程中脊髓的功能变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1232-1236.
[6]	聂晨晨, 苏凯奇, 高静, 凡勇福, 阮晓迪, 袁洁, 段昭远, 冯晓东. 环状RNA调控脑缺血发病的作用与机制[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1286-1291.
[7]	梁家琪, 刘恒旭, 阳金鑫, 杨椅, 邓旭辉, 谭明健, 罗炯. 运动与肠道菌健康效益的关系[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1292-1299.
[8]	高煜, 韩佳慧, 葛新. 脊髓缺血再灌注损伤后的免疫炎性微环境[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(8): 1300-1305.
[9]	田沁玉, 田兴贵, 田壮, 眭翔, 刘舒云, 鲁晓波, 郭全义. 四氧化三锰纳米颗粒抗氧化损伤保护骨髓间充质干细胞的伸展功能[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 821-826.
[10]	王敏, 尹秀山, 王盈熹, 张妍, 赵龙, 夏书月. 吸入骨髓间充质干细胞来源外泌体减轻慢性阻塞性肺疾病的炎性损伤[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 827-834.
[11]	郝柳芳, 段红梅, 王子珏, 郝飞, 郝鹏, 赵文, 高钰丹, 杨朝阳, 李晓光. 转基因小鼠脊髓损伤后室管膜细胞的时空动态变化[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 883-889.
[12]	李晓寅, 杨晓青, 陈淑莲, 李正超, 王梓琪, 宋震, 朱达仁, 陈旭义. 胶原/丝素蛋白支架联合神经干细胞治疗创伤性脊髓损伤[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 890-896.
[13]	张岐剑, 徐希明. 外胚层间充质干细胞的获取及应用[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(6): 928-934.
[14]	袁长深, 官岩兵, 李哲, 容伟明, 廖书宁, 陈乐伟, 梅其杰, 段戡. 骨关节炎坏死性凋亡关键基因的筛选与验证[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 695-700.
[15]	李龙, 李光第, 石豪, 邓柯淇. 环状RNA作为内源性竞争RNA参与调控骨性关节炎的发生[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 751-757.