失神经骨骼肌萎缩模型大鼠肌肉组织中microRNA表达谱的差异分析

doi:10.12307/2023.123

中国组织工程研究 ›› 2023, Vol. 27 ›› Issue (5): 732-737.doi: 10.12307/2023.123

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失神经骨骼肌萎缩模型大鼠肌肉组织中microRNA表达谱的差异分析

刘洪文1，2，李皎3，徐文豪3，聂华1，刘绍江1，徐杰2，尹立1，3

攀枝花市中心医院，1骨科，3学科建设办公室，四川省攀枝花市 617000；2福建医科大学省立临床医学院，福建省立医院骨科，福建省福州市 350001

收稿日期:2022-03-01 接受日期:2022-05-14 出版日期:2023-02-18 发布日期:2022-07-22
通讯作者: 尹立，博士，副教授，硕士生导师，攀枝花市中心医院骨科，学科建设办公室，四川省攀枝花市 617000
作者简介:刘洪文，四川省攀枝花市人，汉族，南方医科大学在读博士，主要从事周围神经损伤后肢体功能重建研究。李皎，重庆市人，汉族，硕士，主要从事流行病统计学方向的研究。徐文豪，云南省华坪县人，汉族，主任医师，硕士生导师，主要从事中西医结合基础与临床研究。
基金资助:
四川省中管局中医药科研专项课题(2020JC0087)，项目负责人：尹立；成都中医药大学学科人才科研专项课题(YYZX20211097)，项目负责人：刘洪文；福建省自然科学基金面上项目(2019J01173)，项目负责人：徐杰

Differential expression profiles of microRNAs in muscle tissue of denervated skeletal muscle atrophy rats

Liu Hongwen1, 2, Li Jiao3, Xu Wenhao3, Nie Hua1, Liu Shaojiang1, Xu Jie2, Yin Li1, 3

1Department of Orthopedics, 3Discipline Construction Office, Panzhihua Central Hospital, Panzhihua 617000, Sichuan Province, China; 2Department of Orthopedics, Fujian Provincial Hospital, School of Clinical Medicine, Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, China

Received:2022-03-01 Accepted:2022-05-14 Online:2023-02-18 Published:2022-07-22
Contact: Yin Li, MD, Associate professor, Master’s supervisor, Department of Orthopedics, Panzhihua Central Hospital, Panzhihua 617000, Sichuan Province, China; Discipline Construction Office, Panzhihua Central Hospital, Panzhihua 617000, Sichuan Province, China
About author:Liu Hongwen, MD candidate, Department of Orthopedics, Panzhihua Central Hospital, Panzhihua 617000, Sichuan Province, China; Department of Orthopedics, Fujian Provincial Hospital, School of Clinical Medicine, Fujian Medical University, Fuzhou 350001, Fujian Province, China Li Jiao, Master, Discipline Construction Office, Panzhihua Central Hospital, Panzhihua 617000, Sichuan Province, China Xu Wenhao, Chief physician, Master’s supervisor, Discipline Construction Office, Panzhihua Central Hospital, Panzhihua 617000, Sichuan Province, China Liu Hongwen, Li Jiao, and Xu Wenhao contributed equally to this work.
Supported by:
Sichuan Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine Special Project, No. 2020JC0087 (to YL); Chengdu University of Traditional Chinese Medicine Special Project for Discipline Talents Research, No. YYZX20211097 (to LHW); Natural Science Foundation of Fujian Province (General Project), No. 2019J01173 (to XJ)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
失神经骨骼肌萎缩：指周围神经损伤导致相应支配区域的感觉和功能障碍，同时伴有骨骼肌体积进行性减少的症状，骨骼肌萎缩的同时常伴随肌肉纤维化的发生，肌肉萎缩较明显或纤维化程度较重的骨骼肌常不能完全恢复其形态和功能。
microRNA表达谱：microRNA 是长约22个核苷酸的非编码单链小RNA分子，被誉为21世纪最具希望进行靶向诊断和治疗的小分子RNA，在哺乳动物中已发现上千个microRNA，microRNA有大量的靶基因，人体约 60%的基因受到其调控，在体内通过抑制或提高靶基因、靶蛋白表达发挥作用，对骨骼肌的代谢平衡具有关键的调控作用。

背景：失神经骨骼肌萎缩尚缺乏较有效的治疗方法，预后差，microRNA在体内的表达谱不清楚。
目的：采用高通量测序技术分析失神经支配骨骼肌萎缩大鼠microRNA表达谱及转化生长因子β1/Smad3信号通路的变化，探讨microRNA在骨骼肌萎缩中的作用及其机制。
方法：12只SD大鼠随机分为2组，实验组采用坐骨神经截断的方法建立失神经肌萎缩模型，对照组仅暴露坐骨神经后缝合伤口。完整取下大鼠双侧腓肠肌计算肌湿质量比，苏木精-伊红染色观察肌萎缩和纤维化情况并测定肌纤维横截面积；应用 Illumina HiSeq 2500 测序技术筛查骨骼肌组织中的microRNA表达谱；结合火山图、层次聚类图、基因本体论、京都基因与基因组百科全书通路分析差异表达基因参与骨骼肌代谢的生物过程；采用实时荧光定量PCR验证候选基因在肌肉组织中的差异表达；Western blot 检测转化生长因子β1、p-Smad3蛋白表达。
结果与结论： ①与对照组相比，实验组腓肠肌湿质量比和横截面积明显降低(P < 0.001)，造模结果符合预期；②两组共筛查到1 249个差异表达的microRNA (P < 0.05；| log2 Fold Change |> 0.0) ，筛选出显著差异表达的microRNA共14个，其中2个表达上调，12个表达下调；③生物学功能和通路分析结果提示，miR-1247-3p、miR-132-5p、miR-21-3p、miR-363-3p、miR-451-5p等具有显著差异表达的microRNAs显著富集于细胞增殖、分化、凋亡等生物过程及转化生长因子β信号通路；④实时荧光定量PCR结果显示，miR-21-3p在实验组腓肠肌组织中呈显著低表达(P < 0.001)，与测序结果趋势一致；⑤Western blot 结果显示，转化生长因子β1、p-Smad3蛋白表达水平较对照组明显升高(P < 0.05)；⑥提示microRNA在骨骼肌萎缩生理病理过程中扮演关键角色，miR-21-3p可能通过激活转化生长因子β1/Smad3信号通路的生物活性，进而在骨骼肌细胞代谢中发挥作用。
缩略语：转化生长因子β1：transforming growth factor-β1，TGF-β1；京都基因与基因组百科全书通路：Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG

https://orcid.org/0000-0002-7200-4823(刘洪文)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 失神经, 骨骼肌萎缩, 高通量测序, microRNA, 转化生长因子β1, Smad3

Abstract: BACKGROUND: There is no effective treatment for denervated skeletal muscle atrophy with poor prognosis, and moreover, the expression profiles of microRNA in vivo are unclear.
OBJECTIVE: To analyze the microRNA expression profiles and the changes of transforming growth factor-β1/Smad3 signaling pathway in denervated skeletal muscle atrophy rats using high-throughput sequencing technology and to explore the role and mechanism of microRNA in skeletal muscle atrophy.
METHODS: Twelve Sprague-Dawley rats were randomized into two groups: experimental group and control group. Animal models of denervated muscle atrophy were established using truncation of the sciatic nerve in the experimental group. In the control group, only the sciatic nerve was exposed followed by suturing. The bilateral gastrocnemius muscles were completely removed to calculate the muscle wet weight ratio. Atrophy and fibrosis were observed by hematoxylin-eosin staining and the cross-sectional area of the muscle was determined. Illumina HiSeq 2500 sequencing technology was used to identify the microRNA expression profiles in skeletal muscle tissue. In combination with volcano plot, hierarchical clustering map, Gene Ontology, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway, differentially expressed genes involved in skeletal muscle metabolism were analyzed. Real-time fluorescent quantitative PCR was used to verify the differential expression of candidate genes in muscle tissue and western blot was used to detect the expression of transforming growth factor-β1 and p-Smad3 proteins.
RESULTS AND CONCLUSION: Compared with the control group, the muscle wet weight ratio and cross-sectional area were significantly lower in the experimental group (P < 0.05), and the modeling results were in line with expectations. A total of 1 249 differentially expressed microRNAs were identified in the two groups (P < 0.05; | log2 Fold Change | > 0.0). There were 14 microRNAs with significant differential expression, of which 2 were up-regulated and 12 were down-regulated. The results of biological function and pathway analysis indicated that miR-1247-3p, miR-132-5p, miR-21-3p, miR-363-3p, and
miR-451-5p with significant differential expression were significantly enriched in cell proliferation, differentiation, apoptosis and other biological processes as well as transforming growth factor-β signaling pathway. The results of real-time fluorescent quantitative PCR showed that the expression of miR-21-3p in the gastrocnemius muscle tissue of the experimental group was significantly lower (P < 0.001), which was consistent with the trend of the high-throughput sequencing results. Western blot results showed that the protein expression levels of transforming growth factor-β1 and p-Smad3 were significantly higher in the experimental group than the control group (P < 0.05). To conclude, microRNA plays a key role in the physiological and pathological processes of skeletal muscle atrophy. miR-21-3p may play a role in skeletal muscle cell metabolism by activating the biological activity of transforming growth factor-β1/Smad3 signaling pathway.

Key words: denervation, skeletal muscle atrophy, high-throughput sequencing technology, microRNA, transforming growth factor-β1, Smad3

中图分类号:

刘洪文, 李皎, 徐文豪, 聂华, 刘绍江, 徐杰, 尹立. 失神经骨骼肌萎缩模型大鼠肌肉组织中microRNA表达谱的差异分析[J]. 中国组织工程研究, 2023, 27(5): 732-737.

Liu Hongwen, Li Jiao, Xu Wenhao, Nie Hua, Liu Shaojiang, Xu Jie, Yin Li. Differential expression profiles of microRNAs in muscle tissue of denervated skeletal muscle atrophy rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2023, 27(5): 732-737.

图/表（结果） 8

2.1 实验动物数量分析两组SD大鼠共12只术后均存活良好，无脱失，术后7 d全部大鼠均完整取下双侧腓肠肌标本。
2.2 腓肠肌湿质量比和苏木精-伊红染色实验组患侧腓肠肌可见明显萎缩，腓肠肌湿质量比明显低于对照组，差异有显著性意义(P < 0.001)。苏木精-伊红染色见实验组肌纤维束萎缩、紊乱明显，大量纤维组织增生填充于肌纤维束间隙，而对照组骨骼肌纤维束饱满，未见明显萎缩，纤维组织无明显增生，骨骼肌纤维横截面积明显高于实验组(P < 0.001)，见图1。

2.3 microRNA差异表达分析实验组与对照组腓肠肌组织中共筛查到1 249个差异表达的microRNA(P < 0.05；| log2 Fold Change |> 0. 0)，差异表达基因火山图、层次聚类图见图2，3。设置log2 Fold Change |> 2.0，得到组间2倍以上差异表达的microRNA有14个，其中2个显著上调，12个显著下调，见表1。为进一步分析探讨失神经骨骼肌纤维化萎缩后的差异表达microRNA的生物学功能，对差异表达microRNA进行基因本体论分析结果显示，差异表达microRNA功能主要富集在细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程；通过KEGG分析结果显示，差异microRNA主要富集于肌酶代谢、神经元凋亡、TGF-β信号通路等，见图4，5。

2.4 实时荧光定量PCR验证microRNA-21-3p的差异表达 micro RNA-21-3p在调控组织器官纤维化水平过程中发挥着重要作用，选择测序结果中具有显著差异表达的microRNA-21-3p进行PCR验证，结果显示，与对照组比较，实验组microRNA-21-3p在肌肉组织中表达显著降低，差异有显著性意义(P < 0.001)，结果与高通量测序保持一致，见图6。

2.5 TGF-β1、p-Smad3蛋白表达变化根据基因本体论分析结果，对调控机体纤维化水平发挥重要作用的信号通路TGF-β是差异microRNA的主要富集通路，通过Western blot分析TGF-β通路效应分子TGF-β1、p-Smad3蛋白表达，结果显示，TGF-β1蛋白表达在实验组中呈高表达，磷酸化Smad3蛋白生物效应显著提高，见图7。

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引言

材料方法

1.1 设计随机对照动物学体内实验，组间均数比较方差齐时采用成组t检验，方差不齐时采用校正t检验；不符合正态分布的计量资料采用Wilcoxon秩和检验。
1.2 时间及地点实验于2020年5月至2022年3月在福建中医药大学中西医结合研究院完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 SPF级2月龄雄性SD大鼠，体质量(200±20) g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，动物许可证号：SCXK(湘)2019-0004。实验方案经攀枝花市中心医院动物实验伦理委员会批准，批准号为20200010。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 主要试剂和仪器切片机(德国，Leica LEICA2135)，光学显微镜(德国，Leica DMIL)，水平电泳仪(美国，Bio-Rad 042BR12088)，高速冷冻离心机(德国，Eppendorf 5417R)，凝胶成像仪(美国，Bio-Rad GelDoc XR)，7500 Real-Time PCR仪(美国，Applied Biosystems)；TGF-β1、p-Smad3二抗均购于美国CST公司，BCA蛋白定量试剂盒(Elabscience)，Trizol试剂(Vazyme)，miRNA提取试剂盒(CWBIO)，miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (by stem-loop)(Vazyme)，miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)。
1.4 方法
1.4.1 动物造模 12只SD大鼠根据随机数字表法分为实验组与对照组，每组6只。实验组动物造模采用徐建广等[7]方法，大鼠称质量后应用戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，备皮、消毒，于股骨外侧坐骨结节下找出坐骨神经，切除1 cm造成坐骨神经缺损，两端翻转 180°后缝合在肌膜上以防止两端神经自然生长结合，逐层关闭切口。对照组仅暴露坐骨神经后缝合伤口。

1.4.2 取材计算肌湿质量比造模术后7 d以戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉处死大鼠后完整取下双侧腓肠肌，千分之一天平称质量记录后切取腓肠肌样本保存于40 g/L多聚甲醛和-80 ℃超低温冰箱中备用；肌湿质量比=术侧肌湿质量/健侧肌湿质量×100%。
1.4.3 苏木精-伊红染色测定肌纤维横截面积取下的腓肠肌样本置40 g/L多聚甲醛固定液中固定24 h后行常规苏木精-伊红染色，组织脱水、透明、浸蜡、包埋、修片、切片、摊片、分片、烤片、脱蜡、染色、中性树脂封固。采用Lecia图像分析系统在高倍视野下测定肌纤维横截面积。
1.4.4 Illumina HiSeq 2500 高通路量测序、建库使用TRIzol按说明书步骤提取样本RNA，使用琼脂糖凝胶电泳评估RNA完整性，超微量分光光度计测定各组Total RNA的A260 nm/A280 nm比值，当比值为1.8-2.2时，表示所提取腓肠肌组织的Total RNA纯度满足此次实验要求，使用 TruSeq Stranded Total RNA构建文库。microRNA 测序由上海生工生物技术有限公司应用Illumina HiSeq 2500 系统进行高通量双端测序。对得到的测序序列的进行生物信息学分析，从miRBase数据库获取已知 miRNA序列，使用miRDeep2软件进行已知miRNA鉴定并对新的microRNA进行预测，采用miRanda预测miRNA靶基因，R软件对得到的miRNA进行差异表达分析，对靶基因构建互作网络进行分析，采用火山图、层次聚类图、基因本体论、京都基因与基因组百科全书通路(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)分析对靶基因、信号通路和生物活性等进行多层次挖掘。
1.4.5 实时荧光定量PCR验证候选基因表达按照试剂盒说明书使用Trizol提取总RNA，紫外分光光度仪测量RNA浓度和吸光度(A)值，反转录按试剂说明书进行，反应条件为42 ℃×30 min，85 ℃×5 min，RT-PCR的反应体系为20 μL：2×rTaq PCR SuperMix 10 μL，10 mol/L上下游引物各0.8 μL，cDNA模板1 μL，不足体积使用无RNA酶的双蒸水补齐。PCR反应程序为：预变性94 ℃×5 min，变性94 ℃×30 s，退火60 ℃×30 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt法对显著差异表达的microRNA相对表达量进行统计分析。

microRNA-21-3p引物序列，正向：CGC GTA GCA CCA TTT GAA ATC，反向：AGT GCA GGG TCC GAG GTA TT；GAPDH引物序列，正向：ATT GGA ACG ATA CAG AGA AGA TT，反向：GGA ACG CTT CAC GAA TTT G。
1.4.6 Western blot检测TGF-β1、p-Smad3蛋白表达取腓肠肌组织按试剂盒说明书提取总蛋白，在SDS-PAGE电泳液中分离总蛋白，转移蛋白到PVDF膜，室温封闭2 h，分别加入兔源单克隆一抗(稀释度1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBS洗涤(10 min×3次)，再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1∶2 000)，室温孵育2 h后TBS洗涤(10 min×3次)，用增强化学发光底物显影印迹，曝光。采用Image J 软件测定目标蛋白条带的灰度值。
1.5 主要观察指标 ①腓肠肌萎缩及纤维化情况；②差异microRNA及其下游纤维化相关因子的表达。
1.6 统计学分析文章统计学方法已经福建中医药大学生物统计学专家审核。所有实验数据采用 SPSS 27.0 软件进行统计分析，符合正态分布的计量资料以x±s表示，组间均数比较方差齐时采用成组t检验，方差不齐时采用校正t检验；不符合正态分布的计量资料采用Wilcoxon秩和检验。以P < 0.05 表示差异有显著性意义。

讨论

周围神经损伤后相应支配的骨骼肌不可避免的出现萎缩及纤维化，目前尚缺乏有效的治疗方法，且尚未引起大部分骨科医师的关注，周围神经损伤的肢体经常出现手术非常成功、但肢体功能恢复差的情况[1，8-9]。MicroRNA对机体大器官的纤维化水平进行调节，但尚未见在骨骼肌纤维化萎缩组织中的表达谱系，对骨骼肌组织是否发挥同样的作用未见相关报道和研究。此次研究发现miR-1247-3p、miR-132-5p、miR-21-3p、miR-363-3p、miR-451-5p等microRNAs在骨骼肌纤维化萎缩组织中呈显著差异表达，这些差异表达的microRNAs显著富集于细胞增殖、分化、凋亡等生物过程及TGF-β信号通路[4，10]。因此，microRNA同样在骨骼肌组织中发挥着调节纤维化程度的作用。

microRNA是目前最具潜力进行靶向诊断和治疗的小分子RNA，人体约60%基因受到microRNA调控，microRNA对骨骼肌的生长、发育和代谢平衡进行调控[11-13]。随着转录测序技术的快速发展和推广应用，特别是采用最新的Illumina测序系统对小RNA进行测序，对血液、组织、器官等样本中的小RNA可进行大批量、快速鉴定和分析，既能鉴定已知的小RNA，同时能发现新的未知小RNA，Illumina测序技术为研究小RNA在机体内的作用提供了一个强有力的手段[14-15]。目前的研究结果显示，microRNA-1、microRNA-206、microRNA-133等小RNA可对骨骼肌细胞的增殖和分化发挥非常明显的干预作用，这一类小RNA被称为肌肉特异性microRNA[16-18]。陈治等[19-20]研究发现，microRNA-222同样对骨骼肌细胞分化进行调节，通过外源性注射microRNA-222可使失神经骨骼肌萎缩大鼠肌萎缩程度继续加重，而通过注射anti-microRNA-222后，MyoD和Rbm24 mRNA和蛋白含量有显著升高，骨骼肌萎缩的程度有所缓解。在此次研究中，miR-1247-3p、miR-132-5p、miR-21-3p、miR-363-3p、miR-451-5p等在骨骼肌纤维化萎缩组织中呈显著差异表达，说明这些microRNA也参与了骨骼肌纤维化萎缩过程。

骨骼肌萎缩主要表现为肢体周径缩小、骨骼肌力量和体积下降，通过病理切片可以清晰观察到，萎缩的骨骼肌出现大量纤维组织增生，骨骼肌纤维束直径和横截面积均明显减少，肌细胞纤维性变，细胞间隙被结缔组织填充。其机制主要涉及运动终板退化、骨骼肌卫星细胞耗竭、相关蛋白代谢及酶活性的改变、血管床重塑、成肌因子的调控及细胞凋亡等方面，多条信号通路共同参与了骨骼肌细胞代谢的过程，其中TGF-β1/Smad3信号通路重点参与了骨骼肌纤维化进程[21-23]。TGF-β1/Smad3信号通路是调节机体的主要纤维化通路，p-Smad3蛋白是TGF-β1下游的主要结合点位[20，24]。TGF-β1/Smad3通路在心肌纤维化、肺组织及肾脏组织纤维化等大器官中已经被证实发挥调节组织纤维化水平的作用，但在骨骼肌纤维化的研究中涉及较少[25-29]。此次研究结果显示TGF-β1、p-Smad3蛋白在萎缩的骨骼肌组织中呈显著高表达，表明TGF-β1/Smad3信号通路被激活，使TGF-β1/Smad3通路下游信号分子Pax7、MyoD1等受到抑制，进而参与了骨骼肌细胞的代谢过程。骨骼肌细胞凋亡与TGF-β1/Smad3信号通路有直接联系，细胞凋亡是内源性相关基因诱导细胞自杀的过程，在失神经大鼠中，大量骨骼肌细胞会出现核固缩、细胞皱缩、染色质浓缩等具有明显凋亡的特征，这些细胞与正常细胞显著区别，但并不是所有骨骼肌细胞核都会发生凋亡，只有受到凋亡基因控制的细胞才会出现凋亡特征。当越来越多的细胞核发生凋亡，骨骼肌细胞不能维持其形态和数量，其代谢平衡就会被打破，随着时间的推移骨骼肌萎缩无法避免[30-31]。失神经后骨骼肌细胞凋亡主要涉及Fas信号通路，在萎缩的骨骼肌细胞中Fas主要效应分子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3常呈高表达，抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3表达后骨骼肌细胞核凋亡的比例明显降低，信号通路的活性也会受到抑制，骨骼肌纤维化水平可在一定程度上可得到缓解。成肌因子MyoD、MRF4、Myf-5、Myogenin等在骨骼肌增殖和分化过程中发挥关键作用，这些因子可激活骨骼肌细胞增殖程序，将前成肌细胞分化为成熟骨骼肌细胞，而这些成肌因子大多受到TGF-β信号通路的调控[32-33]。

此次研究初步分析了失神经支配骨骼肌纤维化萎缩大鼠组织中差异表达的microRNA及TGF-β1/Smad3信号通路的变化，实验结果有助于进一步了解骨骼肌纤维化萎缩的病理生理过程，为进一步明确microRNA调控骨骼肌细胞代谢的作用提供了一些实验基础；但实验结果尚需进一步深入，课题组将在后续的基础研究中通过基因敲除鼠继续深入挖掘差异microRNA在体内的作用及变化。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

失神经骨骼肌萎缩模型大鼠肌肉组织中microRNA表达谱的差异分析

Differential expression profiles of microRNAs in muscle tissue of denervated skeletal muscle atrophy rats

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