2.1   大鼠骨髓间充质干细胞形态   原代培养3 d后可见骨髓间充质干细胞呈放射状分布，细胞形态大小不一，长至六七天时，待细胞融合度为80%-90%时消化传代。传至第3代可见细胞呈漩涡生长，细胞形态呈长梭形，见图1。



2.2   大鼠骨髓间充质干细胞表型鉴定结果   流式细胞术检测第3代大鼠骨髓间充质干细胞表面抗原CD29，CD44，CD90阳性率分别为95.24%，98.55%，99.73%，CD45阳性率为2.79%，见图2。



2.3   大鼠骨髓间充质干细胞的成骨、成脂诱导分化能力    经成骨诱导21 d后，镜下观察可见钙结节，茜素红染色可见红色颗粒物，经成脂诱导21 d后，镜下观察可见圆形脂肪颗粒，油红O染色可见大量红色脂滴，结果表明大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后可向成脂、成骨细胞分化，见图3。



2.4   环磷酰胺诱导的大鼠化疗型卵巢功能不全   正常组大鼠体质量增加，进食正常，毛发光泽。经过15 d的环磷酰胺腹腔注射造模，卵巢功能不全组大鼠可见体质量下降，进食量减少，活动量减少，出现掉毛现象。取大鼠阴道涂片可见动情周期出现延迟或者紊乱，大鼠动情周期变化，见图4。



2.5   大鼠血清雌二醇、卵泡刺激素水平   正常组、卵巢功能不全组、干细胞组、联合组大鼠雌二醇水平分别为(34.60±2.62)，(18.34±2.50)，(29.43±2.88)，(38.18±5.37) ng/L；卵泡刺激素水平分别为(92.63±14.58)，(219.7±30.42)，(139.3±11.74)，(116.3±16.23) μg/L，表明经环磷酰胺诱导的大鼠化疗型卵巢功能不全模型出现雌二醇水平下降、卵泡刺激素水平升高的现象。与卵巢功能不全组相比，干细胞组及联合组治疗后雌二醇水平回升，差异有显著性意义(P < 0.05)，干细胞组及联合组治疗后卵泡刺激素水平明显降低，差异有显著意义(P < 0.05)。然而，联合组与干细胞组的雌二醇及卵泡刺激素表达水平差异无显著性意义(P=0.201，P=0.293)，见图5。




2.6   卵巢组织形态   苏木精-伊红染色结果显示正常组卵巢结构完整，卵泡以生长卵泡和成熟卵泡为主，颗粒细胞结构致密，黄体结构完整，血运丰富，无明显结构纤维化。卵巢功能不全组大鼠卵巢结构出现异常，卵泡数量减少且大量卵泡细胞停滞在生长发育的幼稚期。颗粒细胞出现大量凋亡，结构疏松。黄体结构紊乱，纤维化严重。经干细胞治疗或联合治疗后大鼠卵巢组织卵泡数量增加，颗粒细胞明显致密，黄体结构有部分恢复，血运增加，纤维化明显减少。卵泡计数显示卵巢功能不全组卵泡数量明显减少，且主要以原始卵泡和初级卵泡为主，成熟卵泡较少，且闭锁卵泡数量多。干细胞组及联合组治疗后生长卵泡数量(初级+次级卵泡)明显增加(P < 0.05)，然而干细胞组与联合组的生长卵泡数量并无明显差异。与卵巢功能不全组相比，干细胞组及联合组治疗后闭锁卵泡数量明显减少(P < 0.01)，干细胞组与联合组闭锁卵泡数量无明显差异，见图6。



2.7   骨髓间充质干细胞归巢情况   干细胞组和联合组的每个视野中荧光阳性细胞数分别为22.28±1.82，35.20±2.26(n=4)，结果表明电针治疗可以促进骨髓间充质干细胞向卵巢组织归巢(P=0.004 3，P < 0.01)。为进一步探究电针刺激骨髓间充质干细胞的机制，检测了卵巢组织趋化因子受体CXCR4的蛋白表达水平，结果显示，联合组CXCR4表达水平高于干细胞组(P=0.036，P < 0.05)，证明电针可以通过促进骨髓间充质干细胞表面的CXCR4表达进而促进骨髓间充质干细胞向卵巢归巢，见图7。



2.8   卵巢颗粒细胞凋亡水平   免疫荧光染色结果显示正常组、卵巢功能不全组、干细胞组、联合组凋亡阳性细胞数分别为18.44±1.27，57.06±2.10，35.75±2.31，27.44±2.04(n=4)。与卵巢功能不全组相比，干细胞组和联合组颗粒细胞凋亡水平均显著降低(P=0.000 5，P < 0.000 1)。与干细胞组相比，联合组的凋亡水平显著减少(P=0.035 5，P < 0.05)，差异有显著性意义，证明电针治疗可以通过促进骨髓间充质干细胞在卵巢组织中的抗凋亡作用来增强骨髓间充质干细胞的疗效，见图8。

为进一步探究电针影响骨髓间充质干细胞抗凋亡效应的机制，该研究对抗凋亡基因Bcl-2和促凋亡基因Bax蛋白表达水平进行了测定。与卵巢功能不全组相比，干细胞组和联合组的Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P=0.012 4，P=0.000 5)。与干细胞组相比，联合组Bcl-2蛋白表达水平升高(P=0.036 4，P < 0.05)，差异有显著性意义。与卵巢功能不全组相比，干细胞组和联合组的Bax蛋白表达水平明显降低(P=0.023 0，P=0.002 3)。与干细胞组相比，联合组Bax蛋白表达水平降低(P=0.028 4，P < 0.05)，证明电针可以通过增强抑凋亡基因Bcl-2的蛋白表达水平以及降低促凋亡基因Bax的蛋白表达水平来增强骨髓间充质干细胞在卵巢功能不全治疗中的抗凋亡作用，见图8。
2.9   生物相容性   大鼠骨髓间充质干细胞治疗期间，大鼠活动量及进食量明显增多，体质量有所增加，毛发光泽增加。解剖见心、肺、肝、胃、肠等重要器官颜色、质地正常，未见明显病变，证明同种异体大鼠骨髓间充质干细胞移植并未产生较大的不良反应。

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卵巢功能不全是指女性由于卵巢功能下降在40岁之前出现闭经的疾病，并伴有性激素水平下降以及促性腺激素水平升高。血清雌二醇水平< 73.2 pmol/L，同时2次检测卵泡刺激素> 40 U/L可用于确诊卵巢功能不全[1]。卵巢功能不全同时还伴有月经紊乱、不孕、多汗、潮热、性欲减退等症状，甚至会增加心血管疾病与骨质疏松疾病的发病风险，严重危害女性的身体和心理健康[2]。卵巢功能不全在40岁、30岁女性人群中的发病率分别为1%，0.1%[3]。卵巢功能不全的病因复杂，主要包括遗传因素、染色体异常、自身免疫因素、代谢、医源性因素等[1，4-5]。近年来，随着肿瘤发病率的增高，化疗和放疗成为损伤年轻女性卵泡质量与卵巢功能储备的重要因素[6]。当前临床治疗卵巢功能不全的主要方式为激素替代治疗以及中医治疗，然而激素替代治疗并不能从根本上解决卵巢功能下降，且长期使用激素会增加心血管疾病及骨质疏松的患病风险[7]，另外对于患有肿瘤的患者，激素治疗会导致肿瘤复发概率增加[8]。因此，需要更加有效的治疗方式治疗卵巢功能不全。

间充质干细胞是一种具有多向分化潜能与较强增殖能力的多能干细胞。近年来，干细胞疗法越来越受到研究者的关注。间充质干细胞可以从骨髓、脐带、胎盘、羊膜、子宫内膜以及脂肪组织中分离获得，并可在体外大量增殖培养[4，7-11]。间充质干细胞作为一种多能干细胞有易于分离培养、低免疫反应、无伦理问题、病毒污染少等优势[7，12]。研究表明，间充质干细胞通过分化为颗粒细胞、抗凋亡、抗炎症、免疫调节、抗纤维化、旁分泌再生因子等方式治疗卵巢功能不全[8，10，13-14]。相较于其他从脐带、胎盘、羊膜、子宫内膜分离获取的间充质干细胞，骨髓间充质干细胞更适合治疗女性生殖系统疾病，存在更少的伦理问题；同时相较于脂肪间充质干细胞更易于分离、培养周期更短。然而，骨髓间充质干细胞治疗存在低归巢率、低存活率等问题，治疗效果同样不够理想[15]，需要有其他方案辅助以达到更好的疗效。

电针属于中医的针刺疗法，是传统中医的现代疗法，通过为传统的穴位针灸增加电刺激脉冲以达到治疗效果[16]，产生的动作电位传导至大脑并释放相关神经递质影响相关靶器官[17]。电针疗法在生殖医学领域已得到广泛的研究与应用。研究表明，电针可促进生殖相关内分泌轴的调节，还可通过调节细胞因子的释放发挥免疫调节作用[18]。电针疗法不仅可以治疗生殖系统疾病，还可以通过影响干细胞促进其发挥功效。王秀珍等[19]实验研究发现电针可以增加骨髓间充质干细胞相关生长因子的分泌水平。电针疗法还可以通过辅助增加雌激素受体和孕激素受体的表达来提高骨髓间充质干细胞治疗薄性子宫内膜的疗效[20]。另有研究表明，电针可促进薄性子宫内膜中间充质干细胞的归巢[21]。此次实验将骨髓间充质干细胞通过外周静脉注射至卵巢功能不全大鼠模型，联合电针治疗观察其对骨髓间充质干细胞归巢以及疗效是否有改善作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

1.1   设计   动物模型的组织学及分子生物学对比，采用t检验进行两两组间比较。
1.2   时间及地点   实验于2019年10月至2021年9月在山西医科大学生物化学与分子生物学教研室完成。
1.3   材料
1.3.1   实验动物   雄性SD大鼠4只，4周龄，体质量100-120 g，用于大鼠骨髓间充质干细胞的培养。雌性SD大鼠32只，6-8周龄，体质量180-220 g，用于卵巢功能不全动物模型的制备。所有大鼠由山西医科大学实验动物中心提供。实验方案经山西医科大学实验动物伦理学委员会批准，批准号为SCXK(晋)2019-004。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。实验动物在麻醉下进行所有的手术，并尽一切努力最大限度地减少其疼痛、痛苦和死亡。
1.3.2   实验仪器   倒置显微镜(Nikon，日本)；超净工作台(沪净，中国)；恒温培养箱(松下，日本)；电泳仪(BioRad，美国)；石蜡切片机(Thermo Scientific，美国)；光学显微镜(Nikon，日本)；荧光显微镜(Nikon，日本)；韩氏穴位神经刺激仪(济生医疗，南京)。
1.3.3   实验试剂   DMEM/F12基础培养基(Gibco，美国)；胎牛血清(Gibco，美国)；0.25%胰蛋白酶消化液(博士德，中国)；青链霉素混合液(索莱宝，中国)；大鼠骨髓间充质干细胞成骨、成脂诱导分化培养基试剂盒(Cyagen，美国)；CD29-APC、CD44-PE、CD45-PE、CD90-FITC(EB，美国)；注射用环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司，中国)；大鼠血清雌二醇、卵泡刺激素酶联免疫吸附测定试剂盒(Elabscience，中国)；TUNEL凋亡检测试剂盒(全式金，中国)；CM-Dil活细胞染色剂(Thermo Scientific，美国)；小鼠抗Bax单克隆抗体(Bioss，中国)；小鼠抗Bcl-2单克隆抗体(Bioss，中国)；兔抗鼠CXCR4多克隆抗体(Bioss，中国)；兔抗鼠GAPDH多克隆抗体(博士德，中国)；兔抗小鼠辣根过氧化物酶-交联抗体(Bioss，中国)；羊抗兔辣根过氧化物酶-交联抗体(博士德，中国)；SDS-PAGE凝胶制备盒(索莱宝，中国)。
1.4   实验方法   
1.4.1   大鼠骨髓间充质干细胞原代分离与培养   取4周龄SD大鼠的胫骨与腓骨于超净工作台中，剥离肌肉组织，用无菌剪刀剪开两端，1 mL注射器吸取配置好的DMEM/F12完全培养基冲洗骨髓腔3-5次直至骨髓腔发白[22]，1 000 r/min离心5 min后重悬于25 cm2培养瓶中，3 d后换液，细胞融合至80%-90%时胰蛋白酶消化，以1∶3比例传代培养。

1.4.2   大鼠骨髓间充质干细胞的表型鉴定   取生长良好的第3代大鼠骨髓间充质干细胞，胰蛋白酶消化并制备细胞悬液，1 000 r/min离心5 min，弃去上清，加入CD29，CD44，CD45，CD90抗体避光孵育30 min，洗去多余抗体，加入200 μL PBS上流式细胞仪检测。
1.4.3   大鼠骨髓间充质干细胞成骨、成脂诱导分化鉴定   按照大鼠骨髓间充质干细胞成骨、成脂诱导分化试剂盒说明书严格进行操作。成骨、成脂诱导21 d后，多聚甲醛固定30 min，分别用茜素红及油红O染色30 min，显微镜下观察并拍照。
1.4.4   动物模型的分组及制备   将32只6-8周龄的雌性SD大鼠适应性喂养1周，随机分为正常组、卵巢功能不全组、干细胞组、联合组，每组8只。正常组不做处理，其余3组腹腔注射环磷酰胺溶液制备卵巢功能不全模型，首次剂量为50 mg/kg，维持剂量为8 mg/kg持续14 d[23]。造模完毕后于次日早9点取大鼠阴道涂片观察其动情周期变化，持续观察5 d，确认造模情况。
1.4.5   骨髓间充质干细胞及电针治疗   取生长良好的第3代骨髓间充质干细胞用胰蛋白酶消化并制备成细胞浓度为2×109 L-1的细胞悬液[24]。动物造模验证成功后次日，各组随机选取4只大鼠进行治疗，干细胞组和联合组大鼠尾静脉注射1 mL骨髓间充质干细胞悬液，卵巢功能不全组大鼠尾静脉注射1 mL生理盐水。细胞治疗完毕后，10%水合氯醛溶液催眠联合组大鼠，选取关元、中极、两侧子宫穴进行电针治疗[25-27]。电针模式选择2/15 Hz疏密波，电流大小为1 mA，每天治疗30 min，持续治疗7 d。治疗结束后次日心脏取血检测血清激素水平；取左侧卵巢制作组织石蜡切片，进行苏木精-伊红染色；取右侧卵巢用于蛋白提取，  Western blot检测Bcl-2、Bax蛋白表达水平。
1.5   主要观察指标   
1.5.1   大鼠血清激素水平   取大鼠心脏血液3-5 mL，室温静置2 h，1 000×g离心20 min获取血清，严格按照大鼠血清雌二醇、卵泡刺激素酶联免疫吸附测定试剂盒说明书进行操作。
1.5.2   苏木精-伊红染色观察卵巢组织形态   取各组4只大鼠左侧卵巢置40 g/L多聚甲醛中固定48 h，然后制备4 μm石蜡组织切片，二甲苯脱蜡，梯度乙醇脱水，苏木精-伊红染色，中性树胶封固，光学显微镜下观察卵巢组织形态并对各阶段卵泡计数。
1.5.3   骨髓间充质干细胞的归巢情况   按照活细胞染料试剂说明书配置成1 g/L的CM-Dil储存液。取生长良好的第3代大鼠骨髓间充质干细胞用D-PBS制备成细胞浓度为2×109 L-1的细胞悬液，向细胞悬液中加入5 μL CM-Dil储存液[28]，37 ℃孵育5 min，4 ℃孵育15 min，再用D-PBS洗涤细胞3次。动物造模验证成功后次日，各组剩余4只大鼠进行治疗，干细胞组及联合组大鼠尾静脉注射CM-Dil标记的骨髓间充质干细胞悬液，卵巢功能不全组大鼠尾静脉注射1 mL生理盐水。细胞治疗完毕后，联合组进行电针治疗。治疗结束后取大鼠左侧卵巢组织制备冰冻切片，在10×20倍镜下随机取4个视野计数荧光细胞数并计算平均值，右侧卵巢用于蛋白提取，Western blot检测CXCR4蛋白表达水平。
1.5.4   卵巢细胞凋亡情况   严格按照TUNEL凋亡试剂说明书对各组大鼠卵巢石蜡切片进行染色，并用DAPI染细胞核，在10×10倍镜下随机选取4个视野对比计数凋亡细胞数量并计算平均值，每组4个样本。
1.5.5   Western blot检测Bcl-2、Bax、CXCR4蛋白表达水平   取各组大鼠右侧卵巢液氮速冻后研磨裂解，13 000 r/min离心10 min获取上清液，检测蛋白上清液浓度后以40 μg蛋白上样，恒压电泳后PVDF转膜，室温封闭1.5 h，加入Bcl-2、Bax、CXCR4一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜，TBST洗涤PVDF膜3次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶标记二抗(1∶5 000)室温孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min，最后滴加ECL显影液进行曝光显影。
1.6   统计学分析   实验数据采用Graphpad Prism 6统计软件进行分析。采用t检验进行两两组间比较，数据以x±s表示，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法经过山西医科大学生物统计学专家审核。

卵巢功能不全是一种较难治疗的妇科疾病，严重影响女性的身体及心理健康，表现为卵母细胞数量与质量下降，卵巢功能下降[29]。目前临床并无有效的治疗卵巢功能不全的方法，基本均为对症治疗。间充质干细胞疗法的出现为卵巢功能不全提供了新的有效措施，并且有大量的研究表明不同来源间充质干细胞可以有效缓解卵巢功能不全中存在的卵母细胞质量下降、激素水平异常、颗粒细胞凋亡等问题。南京鼓楼医院的临床试验已经利用间充质干细胞帮助卵巢功能不全患者实现受孕，表明间充质干细胞是卵巢功能不全治疗的有效手段。然而，间充质干细胞仍存在归巢效率低、生存率低、移植排斥反应、效果有限等问题，需要采取基因修饰、预处理、联合治疗等方式以提升间充质干细胞的归巢效率以及治疗效果[30]。

电针是传统中医的现代疗法，通过施加电磁脉冲增加神经递质的释放，并有抗炎、抗氧化应激、抗凋亡、促进血管再生的作用[31]。研究发现，电针联合间充质干细胞治疗可增强其在心血管疾病以及神经系统疾病中的疗效[29，32]。电针在与间充质干细胞联合治疗时可增强其归巢、抗凋亡、抗炎、血管再生等作用，更有利于间充质干细胞发挥疗效[21，33-34]。

该实验首先对大鼠血清雌激素以及卵巢组织学进行了检测观察，发现干细胞组和联合治疗组均有明显改善。然而，两个治疗组之间并未在雌激素和组织学水平发现明显差异，原因可能如下：间充质干细胞归巢到损伤的卵巢组织，并不直接分化为卵母细胞，而是分化为受损的颗粒细胞支持卵泡发生；激素水平和卵泡数量有一定的范围，并不会因为有更多的间充质干细胞归巢及发挥疗效而有更多卵泡细胞成熟。

间充质干细胞的归巢效应过程复杂，尚未完全明确，主要涉及滚动、阻滞、穿过内皮细胞间隙、迁移等过程[35]，其过程类似于白细胞的趋化过程。CXCR4/SDF-1是干细胞归巢中重要的趋化因子受体/趋化因子轴，表达于间充质干细胞表面的CXCR4可与趋化因子结合发挥趋化作用。研究表明，CXCR4低表达是导致间充质干细胞归巢效率低的重要原因之一[36]。该实验结果表明：电针治疗可以促进骨髓间充质干细胞向卵巢归巢，并且通过检测发现联合组卵巢的CXCR4表达水平更高，电针刺激可能通过增加间充质干细胞表面的趋化因子受体CXCR4的表达水平以激活干细胞的归巢效应。此外，电针也可能通过诱导新生血管，改善损伤部位的微循环来提高间充质干细胞的归巢率[37]。然而，间充质干细胞归巢涉及到的趋化因子受体还包括CXCR7、CCR1等，并且归巢效应涉及到多个环节，电针治疗促进间充质干细胞归巢的具体机制仍需继续探究。

卵巢功能不全的另一主要病理表现是大量颗粒细胞凋亡，凋亡的颗粒细胞导致卵母细胞的数量和质量均下降，影响正常排卵与激素水平[38]。研究发现，间充质干细胞归巢到卵巢后并不直接分化为卵母细胞，而是通过分化为颗粒细胞支持卵母细胞的形成，并且通过调节凋亡因子抑制凋亡[39]。该研究发现电针联合骨髓间充质干细胞治疗能发挥更好的抗凋亡疗效。该实验结果显示：联合组对促凋亡基因Bax的抑制作用以及对抑凋亡基因Bcl-2的表达作用均优于单独的骨髓间充质干细胞治疗，证明电针治疗可以促进骨髓间充质干细胞发挥其抗凋亡效应。电针对骨髓间充质干细胞的抗凋亡作用是否涉及其他影响机制仍需进一步实验研究。

综上所述，电针联合骨髓间充质干细胞治疗卵巢功能不全可以获得更好的疗效。电针可以刺激骨髓间充质干细胞归巢，并增强其在卵巢组织的抗凋亡作用。此外，研究表明电针还可以增强抗炎、抗氧化应激等功效[33]。这些影响效应是通过增强间充质干细胞在损伤组织的存活率还是通过改善微环境来促进其发挥疗效仍需进一步的研究明确。此外，该研究存在一定的局限性：首先，电针联合骨髓间充质干细胞治疗产生了更好的效果，然而这种效果是二者共同发挥疗效还是电针促进骨髓间充质干细胞使其产生更好的疗效并未完全明确，实验中应该设立单独电针组来比较疗效差异；其次，仅仅在治疗结束后进行归巢及凋亡水平的观察，并且选取的电针治疗时间未必是最适时长。今后的研究应选取更多的时间点进行疗效观察，并找到最适合电针及干细胞发挥协同作用的时间点。该研究中的电针穴位选择是否为治疗卵巢功能不全的最优穴位组合仍需要更多的实验证明。同时，在二者协同作用最大化的同时再次进行适当剂量的细胞给药将可能有更好的疗效。干细胞治疗卵巢功能不全的持续性以及电针提高干细胞疗效所能持续的时间也需要研究进一步明确。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

文题释义：
骨髓间充质干细胞：从骨髓腔获取的多能干细胞，具有多向分化潜能，可以通过多种效应促进损伤细胞和组织修复。
化疗型大鼠卵巢功能不全：化疗药物对性腺器官的毒性不可逆，卵母细胞质量与数量下降，影响正常排卵，导致卵巢功能不全。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

电针属于中医的针刺疗法，是传统中医的现代疗法，通过为传统的穴位针灸增加电刺激脉冲以达到治疗效果，产生的动作电位将传导至大脑并释放相关神经递质影响相关靶器官。电针疗法不仅可以治疗生殖系统疾病，还可以通过影响干细胞促进其发挥功效。此次实验将骨髓间充质干细胞通过外周静脉注射至卵巢功能不全大鼠模型，通过增加电针治疗观察其对干细胞归巢以及疗效是否有改善作用。

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

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