灵芝孢子保护糖尿病模型大鼠附睾及对自噬的影响

doi:10.12307/2022.851

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
自噬：是一种进化上保守的、依赖于溶酶体的分解代谢过程，其中包括受损细胞器、蛋白质聚集体和脂滴在内的细胞质成分被降解并回收它们的成分。自噬在维持细胞稳态以应对细胞内压力方面具有重要作用；然而，自噬的效率随着年龄的增长而下降，营养过剩会干扰自噬过程。因此，以代谢紊乱和细胞内应激(包括氧化应激、炎症和内质网应激)为特征的肌肉减少性肥胖、胰岛素抵抗和 2 型糖尿病等疾病也涉及受损细胞成分的积累。
灵芝孢子：是灵芝成熟的生殖细胞，它们具有灵芝所有的遗传物质和相似的活性成分。与灵芝子实体相似，灵芝孢子具有调节免疫、抗肿瘤、抗氧化、保护细胞等作用。

背景：糖尿病引起的高血糖与男性生殖不育密切相关，灵芝孢子长期以来被认为具有抗衰老、改善血糖水平的功能。然而灵芝孢子对糖尿病附睾的保护作用机制未见详细报道。
目的：探讨灵芝孢子对糖尿病附睾的保护作用机制。
方法：雄性SD大鼠随机分为正常组(n=10)、高脂高糖组(n=10)和模型组(n=20)。正常组正常喂养，高脂高糖组和模型组大鼠饲以高脂高糖饮食。模型组大鼠在高脂高糖饮食基础上腹腔注射链脲佐菌素30 mg/kg诱导糖尿病大鼠模型，将造模成功的大鼠随机分为糖尿病组和灵芝孢子组(n=10)；其中灵芝孢子组大鼠灌胃灵芝孢子300 mg/(kg·d)；高脂高糖组与糖尿病组大鼠灌胃等量生理盐水，持续饲以高脂高糖饮食，连续干预12周。称体质量，检测空腹血糖、超氧化物歧化酶活性及丙二醛水平，并检测精子畸形率；苏木精-伊红染色观察大鼠附睾结构变化，Western blot检测大鼠附睾组织裂解半胱氨酸蛋白酶3和beclin1、p62、LC3蛋白表达，免疫组织化学染色法检测大鼠附睾组织裂解半胱氨酸蛋白酶3和p62的蛋白表达。
结果与结论：①灵芝孢子可显著恢复附睾功能，明显改善附睾组织病理结构，提高细胞自噬和抗氧化能力；②免疫组织化学染色结果显示，灵芝孢子组大鼠附睾组织p62和裂解半胱氨酸蛋白酶3免疫强度显著下降；③Western blot分析结果显示，与糖尿病组大鼠相比，灵芝孢子可显著上调大鼠附睾组织beclin1和LC3蛋白表达，降低p62和裂解半胱氨酸蛋白酶3的蛋白表达；④提示灵芝孢子可能通过诱导自噬，提高抗氧化能力和抑制细胞凋亡，对糖尿病大鼠附睾产生保护作用。
缩略语：裂解半胱氨酸蛋白酶3：cleaved caspase-3

https://orcid.org/0000-0002-2396-9549 (张欣)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 糖尿病, 附睾, 灵芝孢子, 高脂高糖, 自噬, 凋亡

Abstract: BACKGROUND: Hyperglycemia caused by diabetes are closely related to male infertility, and Ganoderma lucidum spores are considered to be anti-aging and improve blood glucose levels. However, the protective effect of Ganoderma lucidum spores on diabetic epididymis remains unclear.
OBJECTIVE: To investigate the protective effects of Ganoderma lucidum spores on diabetic epididymis.
METHODS: Male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal group (n=10), high fat/high glucose group (n=10), and model group (n=20). Rats in the normal group were fed with normal diet, while those in the high fat/high glucose group and model group were fed with high fat and high glucose diet. The rats in the model group were then intraperitoneally injected with streptozotocin (30 mg/kg) to induce diabetes mellitus. Model rats were randomly divided into diabetes mellitus group (n=10) and Ganoderma lucidum spores group (GLS, n=10). The rats in the GLS group were treated with Ganoderma lucidum spores
(300 mg/kg per day) by gavage, and the rats in the high fat/high glucose group and diabetes mellitus group were gavaged with the equal volume of normal saline and fed with high fat and high glucose diet for 12 weeks. Body mass, fasting blood glucose, superoxide dismutase activity, malondialdehyde level and sperm deformity rate were measured in each group. Structural changes in the epididymis in diabetic rats were observed by hematoxylin-eosin staining. The protein expression levels of cleaved caspase-3, beclin1, p62, and LC3 in the rat epididymal tissue were detected by western blot and immunohistochemical staining.
RESULTS AND CONCLUSION: Ganoderma lucidum spores could significantly recovery epididymal function, improve the epididymal histopathology, and promote cell autophagy and antioxidant capacity. Immunohistochemical staining results showed that the immune intensity of p62 and cleaved caspase-3 decreased significantly. Western blot analysis showed that Ganoderma lucidum spores obviously upregulated beclin1 and LC3 protein expression levels and decreased p62 and Cleaved caspase-3 protein expression levels when compared with the diabetes mellitus group. To conclude, Ganoderma lucidum spores may induce autophagy, increase antioxidant capacity and inhibit apoptosis to protect against epididymal injury in diabetic rats.

Key words: diabetes mellitus, epididymis, Ganoderma lucidum spores, high fat and high glucose, autophagy, apoptosis

中图分类号:

张欣, 马小茹, 薛晶文, 王芳芳, 吴岚, 李岳. 灵芝孢子保护糖尿病模型大鼠附睾及对自噬的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(29): 4632-4637.

Zhang Xin, Ma Xiaoru, Xue Jingwen, Wang Fangfang, Wu Lan, Li Yue. Protective effect of Ganoderma lucidum spores on epididymis and authophage in diabetic rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(29): 4632-4637.

图/表（结果） 8

2.1 实验动物数量分析实验选用大鼠40只，分为4组，在糖尿病组造模期间有1只大鼠在注射链脲佐菌素后1 h后死亡。
2.2 各组大鼠末次空腹血糖、体质量和附睾质量的比较见表1及图1。

与正常组相比，高脂高糖组大鼠血糖无明显变化，体质量和附睾质量明显增加。糖尿病组血糖明显增加，体质量和附睾质量明显降低。灵芝孢子组较于糖尿病组血糖降低，体质量和附睾质量明显增高，差异有显著性意义。
2.3 各组大鼠畸形率的比较与正常组相比，高脂高糖组无明显差异；糖尿病组的精子畸形率明显增高；经灵芝孢子干预后，糖尿病组精子畸形率降低，见图2。

2.4 各组大鼠附睾组织的超氧化物歧化酶活性和丙二醛水平比较见表2及图3。

结果表明，与正常组相比，糖尿病组和高脂高糖组的超氧化物歧化酶活性显著降低(P < 0.01)，且丙二醛水平显著增加(P < 0.01)；而经过灵芝孢子干预后，灵芝孢子组的超氧化物歧化酶活性显著增高(P < 0.01)，丙二醛水平显著减少(P < 0.01)。
2.5 各组大鼠附睾组织形态结构的比较正常组可见形态规整的附睾管，管腔内有丰富的丝状精子，管内饱满，间质无水肿；高脂高糖组附睾结构受损，但不显著；糖尿病组的附睾组织出现较为明显的形态学异常，尤以之为典型；附睾管上皮多处可见空泡，且管腔内精子数目极少，甚至没有；经灵芝孢子干预后，附睾管内精子数目增多，且上皮细胞形态有所好转，见图4。

2.6 灵芝孢子对各组大鼠p62、beclin1、LC3蛋白表达的影响在自噬相关蛋白方面，高脂高糖组和糖尿病组大鼠附睾组织的beclin1、LC3蛋白表达较正常组大鼠减少，p62蛋白表达水平增高，而高脂高糖组与糖尿病组仍有明显差异，见图5。

2.7 灵芝孢子对各组大鼠cleaved caspase-3蛋白表达的影响糖尿病组和高脂高糖组的cleaved caspase-3表达水平较正常组增高；经过灵芝孢子干预后，上述指标表达水平趋于正常，见图6。

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引言

糖尿病作为一种常见的慢性代谢性疾病，可导致多器官病变，包括男性生殖系统损伤[1]。目前，糖尿病引起生殖功能障碍的研究主要集中于睾丸组织，而对附睾结构和功能损害的研究较少。鉴于附睾是精子运输储存和成熟的关键场所，且影响精子最显著的变化已定位于附睾，因此有必要将附睾发生的病理变化视为男性生殖障碍的重要原因。高血糖会导致超氧化物的过量产生和积累，加速生殖细胞的死亡并干扰精子的发生，有学者认为，这与自噬异常高度相关。自噬是一种应激反应，参与清除长寿蛋白和消化受损细胞器，以维持细胞动态平衡和细胞完整性。中度的自噬可以维持机体内稳态，但自噬异常则导致代谢相关疾病的发生发展，如糖尿病及其并发症。自噬和凋亡是真核细胞中相互关联的两种程序性死亡，两者之间关系为制约或促进或转化，共同维持细胞稳态。

灵芝是一种具有悠久历史的传统中药，灵芝孢子是灵芝成熟期的生殖细胞，涵盖灵芝近乎全部的活性成分，其药用和保健价值都很高，近年来在生物医学领域引起广泛关注。现代药理研究表明灵芝孢子具有增强免疫调节作用，降低血糖和血脂，增加抗炎抗氧化能力，清除自由基[2]。灵芝孢子还被发现并应用于癌症的防治；通过降低患者体内细胞因子的水平，提高抗肿瘤活性。但灵芝孢子对糖尿病引起的附睾损伤的保护作用还未完全了解，因此通过此次实验证明了糖尿病能引起附睾组织自噬异常和细胞凋亡增加，灵芝孢子对糖尿病附睾有保护作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

材料方法

1.1 设计随机对照动物实验，多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用LSD法。
1.2 时间及地点实验于2020年11月至2021年7月在佳木斯大学实验动物中心和生命科学中心完成。
1.3 材料
1.3.1 动物 SPF级雄性SD大鼠，体质量179-221 g，由哈尔滨医科大学动物中心提供，动物许可证号：SYXK( 黑 )2016-014。在室温23 ℃，12 h昼夜节律的动物房中适应性喂养7 d，不限制饮食饮水。实验方案经佳木斯大学动物实验伦理委员会批准，批准号为JMSU-210。实验过程遵循了国际兽医学编辑协会《关于动物伦理与福利的作者指南共识》和本地及国家法规。
1.3.2 药物及试剂链脲佐菌素，购自Sigma公司；灵芝孢子，佳木斯地区孢子粉种植基地采集；beclin1单克隆抗体(ab207612)：购自Abcam公司；鼠抗大鼠LC3B多克隆抗体(#83506)，购自CST公司；p62抗体，购自于Abcam公司；裂解半胱氨酸蛋白酶3(cleaved Caspase-3)抗体，购自CST公司；超氧化物歧化酶及丙二醛试剂盒，均在中国南京建成生物工程研究所采购。
1.4 方法
1.4.1 大鼠糖尿病模型建立及分组雄性SD大鼠经适应性喂养后，按随机数字表法分为正常组(n=10)、高脂高糖组(n=10)和模型组(n=20)。正常组喂养普通饲料，高脂高糖组和模型组大鼠饲以高脂高糖饮食，配方：基础膳食60.6%，白砂糖15%，胆固醇4%，胆酸钠0.4%，猪油10%，蛋黄10%。模型组大鼠高脂高糖喂养4周，禁食12 h后，腹腔注射链脲佐菌素30 mg/kg，注射后3，7 d尾静脉取血测定血糖，以连续2次空腹血糖≥16.7 mmol/L为造模成功。将成功造模的SD大鼠随机分为糖尿病组和灵芝孢子组，每组10只；其中灵芝孢子组大鼠给予灵芝孢子300 mg/kg灌胃，1次/d；高脂高糖组与糖尿病组大鼠灌胃等量生理盐水，持续饲以高脂高糖饮食，连续干预12周。
1.4.2 大鼠空腹血糖、体质量和附睾质量测定每周测量体质量一次并进行记录。禁食12 h，尾静脉取血，测定空腹血糖。12周后3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉处死，经腹腔快速取出附睾，用冷生理盐水漂洗，滤纸拭干，称质量。
1.4.3 大鼠精子计数及畸形率检测麻醉大鼠后处死，快速取出附睾组织，沿着纵向将附睾剪3-5下放入37 ℃水浴内的4 mL生理盐水中，待7 min使精子游出，将精子悬液置 65 ℃水浴内8-10 min，用血球计数板作精子计数。取灭活精子悬液涂片，干燥、固定、染色60 min，高倍镜下作精子形态分析，每只大鼠计数1 000个精子。常见精子畸形为头部无定形、无钩形、双头、胖头、小头以及尾折叠、双尾等。

1.4.4 大鼠附睾组织丙二醛水平和超氧化物歧化酶活性检测取附睾组织，剪碎后充分研磨，完全裂解后离心，取其上清液，稀释倍数以试剂盒使用说明书为准，分别进行超氧化物歧化酶及丙二醛水平检测相关的操作，分别记录吸光度值。
1.4.5 苏木精-伊红染色观察各组大鼠附睾组织形态学采用常规石蜡技术进行体积分数4%的甲醛固定、石蜡包埋，制备4 μm切片。将切片脱蜡至水，进行苏木精-伊红染色(其中苏木精染细胞核后返蓝，流水冲洗，再入伊红染细胞质)，后将切片进行脱水透明，用中性树胶封固。最后在光学显微镜下观察各组附睾组织结构的变化。
1.4.6 免疫组织化学染色法检测大鼠附睾组织p62和Cleaved caspase-3的蛋白表达取附睾组织头部用40 g/L的多聚甲醛溶液固定，常规制作石蜡切片，厚度约为4 μm。用浓度梯度的二甲苯和蒸馏水脱蜡至水，后将切片置于微波炉中进行抗原的热修复。再经以体积分数5%牛血清封闭后加入p62和Cleaved caspase-3单克隆抗体一抗(1 ∶ 200)，4 ℃过夜，磷酸盐缓冲液洗5 min×3次，之后加入相应的二抗(一张玻片滴两三滴)进行DAB染色、苏木精复染、脱水透明、封固，取图。
1.4.7 Western blot检测大鼠附睾组织p62、beclin1、LC3及Cleaved caspase-3的蛋白表达取附睾组织，用低温PBS反复冲洗，迅速放在-80 ℃冰箱冻存。取出冻存的附睾组织置于 10 mL 离心管中，充分剪碎后加入组织裂解液 5 mL(1 mL裂解液中加入10 μL的PMSF)，低温(4 ℃)高速(12 000 r/min)离心15 min后取上清液，用 BCA法测定蛋白浓度。30 μg/孔的蛋白上样量进行SDS-PAGE电泳，然后转到PDVF膜，使用5%脱脂奶粉于37 ℃封闭1.5 h，TBST缓冲液冲洗一两次，分别加p62 (1 ∶ 1 000)、beclin1(1 ∶ 1 000)、LC3 (1 ∶ 1 000)、Cleaved caspase-3 (1 ∶ 1 000) 抗体，4 ℃过夜。后用TBST缓和液冲洗10 min×3次后加入1 ∶ 7 000 稀释辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，37 ℃孵育1 h，后使用ECL强效化学发光剂。利用BIO-RAD凝胶成像系统曝光显影检测各组附睾组织中p62、beclin1、LC3Ⅱ/Ⅰ及Cleaved caspase-3的蛋白水平变化。
1.5 主要观察指标监测并记录大鼠血糖及体质量；苏木精-伊红染色检测附睾组织形态学变化；试剂盒检测大鼠附睾组织丙二醛水平和超氧化物歧化酶活性，Western blot检测大鼠附睾组织p62、beclin1、LC3及Cleaved caspase-3的蛋白表达；免疫组织化学染色法检测大鼠附睾组织p62和Cleaved caspase-3的蛋白表达。
1.6 统计学分析实验数据分析采用SPSS statistics 22.0数据编辑器软件，数据结果符合正态分布，用 x±s 表示。组间比较采用单因素分析，组内两两比较采用 LSD 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。文章统计学方法已经佳木斯大学生物统计学专家审核。

讨论

既往临床和动物实验数据证明，糖尿病可降低男性生殖功能，男性不育和性功能障碍被认为是常见的糖尿病并发症[3-5]。目前，关于糖尿病对附睾影响的研究很少[6-7]。此次实验旨在探讨灵芝孢子对链脲佐菌素诱导的糖尿病SD大鼠附睾功能障碍的保护作用，结果显示，灵芝孢子可明显降低精子畸形率，显著提高附睾精子数量；附睾管上皮细胞空泡化明显减少，附睾导管结构排列规整，管腔精子数目增多，证明灵芝孢子对糖尿病附睾有显著保护作用。

有研究发现，氧化应激可能在糖尿病及其诱发相关男性生殖功能障碍和异常的病理生理学中都起重要作用[8-10]。超氧化物歧化酶是一种参与缓解氧化应激的主要抗氧化酶，作为清除自由基的关键酶，其活性水平也是衡量体内细胞抗氧化剂能力的一个重要测定标准因素[11-13]。脂质过氧化物丙二醛水平的高低直接反映了机体细胞被自由基侵袭和脂质过氧化的严峻性[14]，标志着细胞受到氧化损伤的程度。此次研究结果显示，高脂高糖组和糖尿病组大鼠附睾的丙二醛水平均较空白对照组显著增加，而超氧化物歧化酶活性都显著降低，提示大鼠处于无代偿性氧化应激状态。

氧化应激与自噬密切相关，轻度氧化应激、低水平的活性氧已被确定为重要的细胞信号，可在生理和病理条件下诱导自噬。此外，自噬会通过吞噬和降解产生的过氧化物来减少氧化损伤，增加细胞存活率[15]。氧化应激和自噬之间密切相互作用的可能机制已被证明在调节代谢疾病的发展中很重要[16]。然而，在糖尿病及其并发症慢性发生发展过程中，功能失调的线粒体会产生过多的活性氧，导致氧化还原失衡。氧化应激的不断积累，会破坏细胞稳态，在高血糖环境下自噬则会受到抑制。而自噬过程的受损或失调还会导致线粒体功能障碍，又从而增加活性氧的产生[17]，加重糖尿病及其并发症的发展。

有研究表明正常大鼠附睾组织具有高水平的自噬，且在糖尿病个体中，附睾细胞自噬功能下降[18]。Beclin1、LC3和p62的表达常被用作自噬的分子标记[19-21]。众所周知，LC3Ⅱ向LC3Ⅰ的转化被认为是自噬启动的标志；p62也称为自噬体1，通常与其他蛋白质相互作用，促进蛋白质聚集，自噬体的溶酶体降解会降低p62蛋白质水平[22-32]。在自噬失调过程中，p62在细胞质中不断积累，就会导致p62水平增加。此次研究也证明高脂高糖组和糖尿病组的大鼠附睾组织自噬受到抑制。

线粒体破坏必然会引起细胞病变，造成细胞自噬、凋亡和坏死。正常生理情况下，细胞自噬会清除自身代谢产物，维持内环境稳态，是一种细胞保护过程；然而在病理状态下，细胞自噬功能受损，能力受到抑制，随着体内细胞自噬能力长期超出细胞负荷便会诱导凋亡，而过度的凋亡会导致精子发生异常，甚至导致不育。因此，自噬是一把双刃剑，对细胞的存活和功能可能会产生积极或者消极的影响，而这主要取决于细胞和环境的因素。此实验发现，糖尿病组凋亡蛋白表达显著增加，这提示糖尿病使附睾组织诱发了细胞凋亡，导致精子异常。

综上，糖尿病高血糖可引起附睾组织结构损伤和氧化应激，自噬调节障碍可能影响附睾功能，这是糖尿病精子质量下降的部分原因。灵芝孢子治疗可抑制自噬缺陷和氧化应激，减轻附睾损伤，预防糖尿病高血糖引起的生殖功能障碍。进一步研究自噬在糖尿病高血糖损伤机制中的作用，将有助于预防糖尿病并发症，包括糖尿病相关男性不育。

此外，设立高糖高脂组发现，该组大鼠的血糖并不升高，体质量和附睾质量都显著升高，但其附睾形态学稍有损伤，精子畸形率与正常组大鼠无明显差异。通过对抗氧化能力的指标检测发现，高脂高糖组大鼠的丙二醛水平较正常大鼠增加，超氧化物歧化酶活性降低，这可能是导致附睾形态结构损伤的原因之一。通过Western blot和免疫组织化学染色法检测结果表明，高脂高糖组的自噬水平调节紊乱，受到抑制；而与糖尿病组相比，自噬相关蛋白表达又有明显差异。推测其可能原因为高脂高糖饮食时间尚短，虽会造成附睾损伤，但不足以达到糖尿病的严重损伤程度，还需进一步探究讨论。

结论：此次实验结果证明，灵芝孢子可明显降低糖尿病大鼠血糖水平、精子畸形率，减少附睾上皮空泡化，增加精子数量，对糖尿病附睾组织有显著保护作用，其应用前景远大。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程