利用生物发光成像示踪大鼠颅骨缺损中移植的骨髓间充质干细胞

doi:10.12307/2022.400

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (25): 3968-3973.doi: 10.12307/2022.400

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利用生物发光成像示踪大鼠颅骨缺损中移植的骨髓间充质干细胞

曾裕威，黄闯，魏建国，段东明，王簕

广州医科大学附属第三医院骨科，广东省广州市 510150

收稿日期:2021-03-11 接受日期:2021-05-07 出版日期:2022-09-08 发布日期:2022-01-25
通讯作者: 王簕，博士，副主任医师，副教授，广州医科大学附属第三医院骨科，广东省广州市 510150
作者简介:曾裕威，男，1993年生，汉族，广州医科大学在读硕士，主要从事骨组织修复再生基础研究。
基金资助:
国家自然科学基金(82072409)，项目负责人：王簕；广东省自然科学基金(2019A1515012020)，项目负责人：王簕

Tracing transplanted bone marrow mesenchymal stem cells in rat calvarial defect by bioluminescence imaging

Zeng Yuwei, Huang Chuang, Wei Jianguo, Duan Dongming, Wang Le

Department of Orthopedics, Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China

Received:2021-03-11 Accepted:2021-05-07 Online:2022-09-08 Published:2022-01-25
Contact: Wang Le, MD, Associate chief physician, Associate professor, Department of Orthopedics, Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China
About author:Zeng Yuwei, Master candidate, Department of Orthopedics, Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510150, Guangdong Province, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China (General Program), No. 82072409 (to WL); Natural Science Foundation of Guangdong Province, No. 2019A1515012020 (to WL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
Luciferase慢病毒：慢病毒载体是一种以人类免疫缺陷型病毒为基础衍生的减毒基因载体，使用含有目的基因的慢病毒侵染细胞，可获得稳定表达目的基因/蛋白的细胞株。Luciferase即荧光素酶，可在三磷酸腺苷和氧气存在的条件下与底物荧光素反应生成氧化荧光素并能被生物光学成像系统识别、定量。该研究采用含Firefly Luciferase报告基因的慢病毒侵染骨髓间充质干细胞，以获得稳定表达荧光素酶的骨髓间充质干细胞。
生物发光成像：是一种基于表达荧光素酶基因的活细胞与底物荧光素反应发出光子的原理，利用带有高敏感相机的生物光学成像系统(IVIS系统)获取目的细胞在活体动物中的示踪图像。利用该技术可在活体动物中无创、实时监测目标细胞活动或目标基因的行为。

背景：生物发光成像是一种新兴的活体成像技术，目前尚未有运用该技术对移植干细胞在颅骨缺损活体示踪的研究。
目的：探究Luciferase慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞的最佳转染复数，进一步研究表达荧光素酶骨髓间充质干细胞在体外的有效性和稳定性以及在大鼠颅骨缺损内的示踪作用。
方法：以不同感染复数转染对数生长期的大鼠骨髓间充质干细胞，并在活体成像系统中定量分析荧光值以确定最佳感染复数；在最佳感染复数下构建表达荧光素酶的骨髓间充质干细胞，分析不同数量细胞和不同代数细胞对应的荧光值变化，以评估转染干细胞的有效性和稳定性；最后在颅骨缺损中示踪表达荧光素酶的骨髓间充质干细胞。
结果与结论：①感染复数在10-50区间递增时，荧光定量随感染复数同比例增加，而感染复数增加至100时，荧光定量增幅不明显，证明Luciferase慢病毒转染大鼠骨髓间充质干细胞的最佳感染复数为50；②表达荧光素酶的骨髓间充质干细胞在体外具有良好的细胞-生物荧光量效关系和增殖稳定性，证明荧光定量能指示细胞的相对数量；③表达荧光素酶的骨髓间充质干细胞在颅骨缺损区局限分布，其生物荧光强度逐渐减弱，最终在术后35 d全部消失；④结果说明，生物发光成像是一种高效灵敏的活体示踪技术，有利于表征移植干细胞在体内的分布和数量变化，并为解释干细胞功能和机制研究提供有力证据。
缩略语：骨髓间充质干细胞：bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs；表达荧光素酶的骨髓间充质干细胞：luciferase positive BMSCs，Luc+BMSCs；感染复数：multiplicity of infection，MOI

https://orcid.org/0000-0002-6465-8579(王簕)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

关键词: 干细胞, 骨髓间充质干细胞, Luciferase慢病毒, 生物发光成像, 活体成像系统, 活体示踪, 大鼠, 颅骨缺损, 组织工程

Abstract: BACKGROUND: Bioluminescence imaging is an emerging in vivo imaging technology, but there are few studies on the tracing of stem cells after transplantation into living animals in existing reports.
OBJECTIVE: To explore the multiplicity of infection of rat derived bone marrow mesenchymal stem cells transfected with Luciferase lentivirus, and further study the effectiveness and stability of Luciferase + bone marrow mesenchymal stem cells in vitro and the tracing effect in rat calvarial defects.
METHODS: The logarithmic growth phase of rat bone marrow mesenchymal stem cells was transfected with different multiplicities of infection, and the fluorescence value was quantitatively analyzed in the in vivo imaging system to determine the optimal multiplicity of infection. Luciferase + bone marrow mesenchymal stem cells were transfected under optimal conditions, and fluorescence values corresponding to different numbers of cells and different passages were analyzed to assess the effectiveness and stability of Luciferase + bone marrow mesenchymal stem cells. Finally, Luciferase + bone marrow mesenchymal stem cells were traced in the rat calvarial defect model.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) When the multiplicity of infection increased in the interval of 10-50, the fluorescence quantification increased with the same proportion of multiplicity of infection. The fluorescence quantification did not increase significantly when the multiplicity of infection increased to 100, demonstrating that the optimal multiplicity of infection of Luciferase lentivirus transfected bone marrow mesenchymal stem cells was 50. (2) Luciferase + bone marrow mesenchymal stem cells had a good cell-bioluminescence dose-response relationship and proliferation stability in vitro, demonstrating that fluorescence quantification can indicate the relative number of cells. (3) The transplanted Luciferase + bone marrow mesenchymal stem cells were locally distributed in the skull defect, and the biofluorescence intensity decreased over time and finally disappeared after 35 days. (4) Bioluminescence imaging is an efficient and sensitive technique for tracing stem cells in vivo, which is helpful to characterize the distribution and quantity changes of transplanted stem cells, and provides strong evidence for explaining stem cell function and mechanism research.

Key words: stem cells, bone marrow mesenchymal stem cells, Luciferase lentivirus, bioluminescence imaging, in vivo imaging system, in vivo tracing, rat, calvarial defect, tissue engineering

中图分类号:

曾裕威, 黄闯, 魏建国, 段东明, 王簕. 利用生物发光成像示踪大鼠颅骨缺损中移植的骨髓间充质干细胞[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(25): 3968-3973.

Zeng Yuwei, Huang Chuang, Wei Jianguo, Duan Dongming, Wang Le. Tracing transplanted bone marrow mesenchymal stem cells in rat calvarial defect by bioluminescence imaging[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(25): 3968-3973.

图/表（结果） 5

2.1 大鼠BMSCs的生长形态和鉴定结果光学显微镜下观察原代BMSCs，第3天时可见少量细胞贴壁，细胞呈集落样生长，单个细胞呈卵圆形居多，部分伸出触角，见图1A；培养至第7天时细胞明显扩增。干细胞多数呈长梭形，形态均一，达到80%融合度，见图1B。BMSCs在成骨诱导14 d后，镜下可见颗粒状钙结节，茜素红染色明显，证明所分离细胞为BMSCs，见图1C。流式细胞仪检测结果显示，所分离细胞表达典型BMSCs标志物CD29和CD106，但不表达造血祖细胞表面标志CD34和CD45，符合BMSCs特征，见图1D。

2.2 大鼠BMSCs最佳感染复数的确定在96孔板中加入底物反应后，与对照组(未转染luciferas的BMSCs，感染复数为0)相比，所有转染慢病毒的细胞均发光，且感染复数值越高，生物荧光亮度越高，见图2A。使用活体生物光学成像系统软件对荧光进行定量，见图2B，发现荧光表达量随感染复数值的增加而增加。当感染复数在10-50区间时，荧光表达显示良好的同比例增加，而感染复数值从50增加至100时，荧光定量增幅不明显，未显示与慢病毒载体数量成比例的增长，由于感染复数值过大可能影响细胞活性[19]，因此，认为感染复数为50是大鼠BMSCs最佳的感染复数。

2.3 Luc+BMSCs在体外的有效性及稳定性评估为了检验Luc+BMSCs作为示踪细胞的有效性，根据上述最佳感染复数获得大量稳转Luc+BMSCs，然后进行梯度细胞数量和生物荧光定量的相关性分析。从细胞生物荧光中可观察到生物荧光强度随细胞的数量增加而增加，见图3A。定量分析显示，在体外细胞水平，Luc+BMSCs荧光强度定量与细胞数量显示出同比例递增关系，呈现高度的线性相关(R2=0.993)，见图3B，说明干细胞移植到动物体内后通过生物荧光定量值估计存活的细胞数量是有充分依据的。同时，为检验Luc+BMSCs在分裂增殖过程中生物荧光基因表达的稳定性，选取慢病毒转染后不同代数的细胞，观察Luc+BMSCs的荧光表达是否变化。不同代数的Luc+BMSCs均能稳定表达生物荧光，未表现出荧光强度随代数增加而衰减的现象，见图3C，荧光定量显示荧光值无明显差异，见图3D。

2.4 Luc+BMSCs在胶原支架上的Live/Dead染色为检验Luc+BMSCs在胶原支架中的生物相容性，将Luc+BMSCs与胶原支架在培养皿中培养7 d后进行细胞Live/Dead染色，见图4。图4A中显示支架中的活细胞，可见Luc+BMSCs在支架中弥漫性分布，部分细胞呈聚集性成团生长，部分细胞呈梭形生长，与胶原支架结合良好；图4B中显示少量红色的死细胞，证明Luc+BMSCs与胶原支架有良好的组织相容性。

2.5 Luc+BMSCs在大鼠颅骨缺损中的活体示踪 5×105个Luc+BMSCs在颅骨缺损中随时间变化的分布、存活情况，见图5A。术后第1天时，移植细胞的生物发光信号集中在颅骨缺损中心，并呈同心圆状分布，提示缺损中心区细胞密度较高，而分布范围明显超出颅骨缺损大小，提示移植细胞向邻近的肌肉或皮肤迁移和扩散。
随时间进展，生物荧光信号仍然固定在缺损区，但分布范围逐渐缩小，荧光强度随之进一步减弱，说明移植的干细胞在局部逐渐消失，至术后第35天时荧光降至无法检测。以术后第1天的荧光定量值为基准，细胞移植后第1，2，3，4，5周的存活率分别为25.67%，5.22%，3.94%，0.47%，0.00%。细胞生物荧光消失速度显示出“先快后慢”的规律，见图5B。

参考文献

[1] PITTENGER MF, DISCHER DE, PÉAULT BM, et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. NPJ Regen Med. 2019;4:22.
[2] WANG X, ZHAO Z, ZHANG H, et al. Simultaneous isolation of mesenchymal stem cells and endothelial progenitor cells derived from murine bone marrow. Exp Ther Med. 2018;16(6):5171-5177.
[3] CHEN L, LIU G, LI W, et al. Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells following transfection with Indian hedgehog and sonic hedgehog using a rotary cell culture system. Cell Mol Biol Lett. 2019;24:16.
[4] ARTHUR A, GRONTHOS S. Clinical Application of Bone Marrow Mesenchymal Stem/Stromal Cells to Repair Skeletal Tissue. Int J Mol Sci. 2020;21(24):9759.
[5] 刘志燕,龙瀛,何晓晓,等.干细胞移植后示踪技术的研究进展[J].组织工程与重建外科杂志,2019,15(2):111-114.
[6] ZHOU B, ZHAO Z, ZHANG X, et al. Effect of Allogenic Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell Transplantation on T Cells of Old Mice. Cell Reprogram. 2020;22(1):30-35.
[7] XIANG Y, WANG W, GAO Y, et al. Production and Characterization of an Integrated Multi-Layer 3D Printed PLGA/GelMA Scaffold Aimed for Bile Duct Restoration and Detection. Front Bioeng Biotechnol. 2020;8:971.
[8] JIANG Z, YU K, FENG Y, et al. An effective light activated TiO2 nanodot platform for gene delivery within cell sheets to enhance osseointegration. Chem Eng J. 2020;402(5):126170.
[9] LI Y, LIU L, YU Z, et al. Effects of Edaravone on Functional Recovery of a Rat Model with Spinal Cord Injury Through Induced Differentiation of Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Neuron-Like Cells. Cell Reprogram. 2021; 23(1):47-56.
[10] PIÑERO G, USACH V, SOTO PA, et al. EGFP transgene: a useful tool to track transplanted bone marrow mononuclear cell contribution to peripheral remyelination. Transgenic Res. 2018;27(2):135-153.
[11] OZAWA T, YOSHIMURA H, KIM SB. Advances in fluorescence and bioluminescence imaging. Anal Chem. 2013;85(2):590-609.
[12] 韩杰,王敬梓,周锐,等.尾静脉注射荧光素酶标记的膀胱癌T24细胞动物转移模型的构建[J].中华实验外科杂志,2019,36(2):361-363.
[13] ASWENDT M, VOGEL S, SCHÄFER C, et al. Quantitative in vivo dual-color bioluminescence imaging in the mouse brain. Neurophotonics. 2019;6(2):025006.
[14] CONWAY M, XU T, KIRKPATRICK A, et al. Real-time tracking of stem cell viability, proliferation, and differentiation with autonomous bioluminescence imaging. BMC Biol. 2020;18(1):79.
[15] MEZZANOTTE L, VAN ‘T ROOT M, KARATAS H, et al. In Vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications. Trends Biotechnol. 2017;35(7):640-652.
[16] 赵年欢,崔邦平,王朋,等.生物发光成像示踪干细胞移植的应用进展[J].巴楚医学,2018,1(1):125-128.
[17] WU H, KANG N, WANG Q, et al. The Dose-Effect Relationship Between the Seeding Quantity of Human Marrow Mesenchymal Stem Cells and In Vivo Tissue-Engineered Bone Yield. Cell Transplant. 2015;24(10):1957-1968.
[18] 张雅雯,朱光旭,李雅喆,等.一种改良大鼠颅骨缺损动物模型的构建及应用[J].实验动物与比较医学,2020,40(3):227-231.
[19] 肖渝,王坤,李彦林,等.三种携带GFP慢病毒转染免骨髓间充质干细胞的效果[J].中国组织工程研究,2017,29(21):4642-4647.
[20] 李燕,陆伟,竺丽梅,等.慢病毒介导的GFP转染对小鼠骨髓间充质干细胞表型、增殖和分化能力的影响[J].南京大学学报(自然科学),2014,50(6): 883-889.
[21] Lukashev AN, Zamyatnin AA Jr. Viral Vectors for Gene Therapy: Current State and Clinical Perspectives. Biochemistry (Mosc). 2016;81(7):700-708.
[22] 闫锦玉,邢万红.慢病毒介导Notch1基因shRNA沉默大鼠骨髓间充质干细胞Notch信号通路的表达[J].中国组织工程研究,2019,23(17):2659-2664.
[23] 徐宠俊,何荷蕃,林群,等.人肝细胞生长因子基因慢病毒载体的构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达[J].吉林大学学报(医学版),2021,47(1):16-24.
[24] 李琦,邹志余,杨瑞泽,等.慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白筛选稳定转染的兔骨髓间充质干细胞[J].西安交通大学学报(医学版),2019,40(4): 619-623.
[25] LU L, LIU Y, ZHANG X, et al. The therapeutic role of bone marrow stem cell local injection in rat experimental periodontitis. J Oral Rehabil. 2020;47 Suppl 1:73-82.
[26] WANG WH, SHEN CY, CHIEN YC, et al. Validation of Enhancing Effects of Curcumin on Radiotherapy with F98/FGT Glioblastoma-Bearing Rat Model. Int J Mol Sci. 2020;21(12):4385.
[27] ANSARI AM, AHMED AK, MATSANGOS AE, et al. Cellular GFP Toxicity and Immunogenicity: Potential Confounders in in Vivo Cell Tracking Experiments. Stem Cell Rev Rep. 2016;12(5):553-559.
[28] BRESSER K, DIJKGRAAF FE, PRITCHARD CEJ, et al. A mouse model that is immunologically tolerant to reporter and modifier proteins. Commun Biol. 2020;3(1):273.
[29] WU Y, CHEN L, SCOTT PG, et al. Mesenchymal stem cells enhance wound healing through differentiation and angiogenesis. Stem Cells. 2007;25(10):2648-2659.
[30] VILALTA M, DÉGANO IR, BAGÓ J, et al. Biodistribution, long-term survival, and safety of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells transplanted in nude mice by high sensitivity non-invasive bioluminescence imaging. Stem Cells Dev. 2008;17(5):993-1003.
[31] KALLMEYER K, ANDRÉ-LÉVIGNE D, BAQUIÉ M, et al. Fate of systemically and locally administered adipose-derived mesenchymal stromal cells and their effect on wound healing. Stem Cells Transl Med. 2020;9(1):131-144.
[32] LIU J, SHI Y, HAN J, et al. Quantitative Tracking Tumor Suppression Efficiency of Human Umbilical Cord-Derived Mesenchymal Stem Cells by Bioluminescence Imaging in Mice Hepatoma Model. Int J Stem Cells. 2020;13(1):104-115.
[33] LEE J, LEE S, AHMAD T, et al. Human adipose-derived stem cell spheroids incorporating platelet-derived growth factor (PDGF) and bio-minerals for vascularized bone tissue engineering. Biomaterials. 2020; 255:120192.
[34] ROUX BM, VAICIK MK, SHRESTHA B, et al. Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Endothelial Networks Accelerate Vascularization But Not Bone Regeneration. Tissue Eng Part A. 2020 Oct 19. doi: 10.1089/ten.TEA.2020.0200.
[35] TEE BC, SUN Z. Xenogeneic mesenchymal stem cell transplantation for mandibular defect regeneration. Xenotransplantation. 2020;27(5):e12625.
[36] ALVARADO-VELEZ M, ENAM SF, MEHTA N, et al. Immuno-suppressive hydrogels enhance allogeneic MSC survival after transplantation in the injured brain. Biomaterials. 2021;266:120419.
[37] CHIARUGI P, GIANNONI E. Anoikis: a necessary death program for anchorage-dependent cells. Biochem Pharmacol. 2008;76(11):1352-1364.
[38] GARCÍA-SÁNCHEZ D, FERNÁNDEZ D, RODRÍGUEZ-REY JC, et al. Enhancing survival, engraftment, and osteogenic potential of mesenchymal stem cells. World J Stem Cells. 2019;11(10):748-763.
[39] MEHRBANI AZAR Y, NIESLER CU, VAN DE VYVER M. Ex vivo antioxidant preconditioning improves the survival rate of bone marrow stem cells in the presence of wound fluid. Wound Repair Regen. 2020;28(4):506-516.
[40] GOODMAN SB, LIN T. Modifying MSC Phenotype to Facilitate Bone Healing: Biological Approaches. Front Bioeng Biotechnol. 2020;8:641.

引言

骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)是由FRIEDENSTEIN等在1974年首次从骨髓中分离鉴定的一种多能干细胞[1]。BMSCs具有自我更新、多向分化潜能、支持造血细胞、免疫调节等多种生物学特性[2]。同时，由于BMSCs具有分化为成骨相关细胞(包括成骨细胞、软骨细胞、破骨细胞等)和分泌促血管生成因子和成骨因子等能力[3- 4]，使其成为目前骨组织工程最主要的种子细胞来源之一。
随着干细胞在组织工程中运用领域的拓宽，其示踪技术也不断革新。目前干细胞的示踪技术主要可分为直接标记和间接标记[5]。直接标记即在移植前将特殊染料或标记物植入干细胞中，然后利用特殊仪器(如荧光显微镜或磁共振成像)对细胞进行追踪，如Dil荧光染料标记法和磁共振对比剂标记法[6-7]。间接标记是将报告基因通过载体整合到细胞中，利用细胞编码特定蛋白质或通过免疫反应追踪干细胞，如增强型绿色荧光蛋白标记法和溴脱氧尿嘧啶标记法等[8-9]。直接标记具有简单易操作的优点，但是标记物会随着细胞增殖分裂而减少或消失，或者细胞死亡后标记物被组织细胞吞噬造成假阳性，因此不利于准确定位和长期示踪。间接标记则相对稳定，插入的报告基因能与宿主细胞基因一起复制，随细胞增殖传递给子代，且表达强度与细胞数量相关，这有利于移植干细胞在空间和时间上的定位和计数[10]。
近10年来，基于插入报告基因的光学探针无创成像技术在细胞示踪方面取得了巨大进展[11]。相比于过去在离体组织层面检测示踪外源性移植干细胞，无创成像技术可以实现在活体动物内以更精确的方式监测移植干细胞的动态及生物学事件，不仅减少了实验动物的数量，缩减了时间成本、劳动力成本和经济成本，还提高了实验数据的真实性和有效性[12]。近年来生物发光成像已成为最常用的干细胞存活和功能示踪技术之一[13-14]。生物发光成像是利用表达荧光素酶基因的活细胞与底物荧光素在三磷酸腺苷和氧气存在的条件下反应生成氧化荧光素，然后利用带有高度敏感的活体生物光学成像系统检测生物荧光的一种技术[15]。由于实验动物本身无自发光，因此背景信号极低，同时生物荧光波长介于460-600 nm，具有较强的组织穿透力，配合高灵敏的探头可以检测体内最低100个标记细胞[16]，因此生物发光成像可以在活体动物中实现无创长期示踪和实时定量移植细胞。
该实验利用Luciferase慢病毒构建稳定表达荧光素酶的BMSCs(luciferase positive BMSCs，Luc+BMSCs)，探究了大鼠BMSCs的最佳转染复数，并且评估了Luc+BMSCs在体外作为活体示踪细胞的有效性和稳定性，最后利用生物发光成像技术进一步研究Luc+BMSCs在大鼠颅骨缺损的示踪作用。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

材料方法

1.1 设计干细胞体内实验，采用单因素方差分析来比较各实验组间的差异。
1.2 时间及地点实验于2020年3-12月在广州医科大学附属第三医院再生医学与3D打印技术转化中心和广州医科大学实验动物中心完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 4周龄SPF级雄性SD大鼠20只，体质量约100 g，购自南方医科大学实验动物中心，实验动物许可证号：SYXK(粤)2016-0167。实验方案经广州医科大学动物实验伦理委员会批准(批准号：GY2019-118)。
1.3.2 实验仪器和试剂标记Luciferase和嘌呤霉素基因的慢病毒载体及助染剂聚凝胺由上海吉凯基因医学科技股份有限公司提供；DMEM/F12培养基、胎牛血清、双抗、胰蛋白酶、培养皿(美国Gibco公司)；细胞表面标记抗体CD29、CD90、CD34、CD45(BioLegend，美国)；嘌呤霉素(Sigma，美国)；荧光倒置显微镜(Olympus，日本)；细胞培养箱(Thermo Fisher，美国)；D-荧光素底物(Gold Biotechnology，美国)；荧光素酶报告基因检测试剂盒(Promega，美国)；猪皮来源Ⅰ型胶原支架(四川铭让科技有限公司，中国)；LIVE/DEAD细胞成像试剂盒(Thermo Fisher，美国)；小动物骨钻(南京卡尔文生物科技有限公司，中国)；活体成像仪(PerkinElmer，美国)；共聚焦显微镜(Nikon，日本)。
1.4 实验方法

1.4.1 大鼠BMSCs的分离、培养和鉴定采用全骨髓贴壁法分离和培养大鼠BMSCs。选取4周龄雄性SD大鼠6只，过量戊巴比妥处死大鼠，体积分数为75%乙醇消毒5 min，无菌条件下分离大鼠后肢皮肤及肌肉，取双侧股骨、胫骨，使用无菌PBS反复冲洗多次，剪除长骨两端骨骺，使用DMEM/F12基础培养基反复冲洗骨髓腔至变白，1 000 r/min离心5 min后收集骨髓细胞，弃上清液，使用DMEM/F12完全培养基(含体积分数为10%胎牛血清+1%双抗)重悬细胞并接种在35 mm培养皿中，置于37 ℃、体积分数为5%CO2培养箱中静置培养，3 d后全量更换培养基，去除未贴壁细胞，待细胞生长至80%-90%融合时(7-10 d)，按1∶2的比例传代培养，细胞培养至第3代备用。采用成骨诱导和茜素红S染色以及流式细胞术检测干细胞表面分子标记物CD29，CD106，CD34，CD45进行鉴定。

1.4.2 慢病毒载体介导Luciferase基因转染大鼠BMSCs 选用对数生长期的第3代BMSCs进行转染，在96孔板上按照1×104个/孔接种BMSCs，静止培养4 h，使细胞贴壁。为确定BMSCs的最佳感染复数，即病毒颗粒数和细胞数目的比值，将感染复数分为5组(0，10，25，50和100)，分别在每个孔中加入1×108 TU/mL的慢病毒0，1，2.5，5，10 μL，同时每孔中加入终质量浓度为25 mg/L的助染剂聚凝胺。感染12 h后更换常规生长培养基继续培养，同时使用嘌呤霉素(1 mg/L)筛除转染失败的细胞，72 h后使用Promega快速反应试剂盒在活体成像系统下检测生物荧光表达，根据荧光定量结果确认最佳感染复数。
1.4.3 Luc+BMSCs的有效性及稳定性评估根据上述实验确认最佳感染复数，在相同条件下构建大量稳转Luc+BMSCs。为进一步评估该细胞在体外的细胞数量-生物荧光量效关系，在96孔板上按细胞数量梯度依次接种0，2 500，5 000，10 000，20 000，40 000个Luc+BMSCs，静止培养4 h，待细胞贴壁后进行荧光值定量检测。每孔中加入100 μL细胞裂解液(Passive Lysis Buffer)摇晃15 min充分裂解细胞，随后在每孔中加入底物荧光素(终质量浓度为150 mg/L)，立即将96孔板放入活体生物光学成像系统的暗箱内并在Auto模式下连续拍照，应用活体成像软件进行生物荧光定量。同时，为检验Luc+BMSCs在分裂增殖过程中生物荧光基因表达的稳定性，选取慢病毒转染后第1-5代细胞，以20 000个/孔接种在96孔板上，静止培养4 h，待细胞贴壁后按照上述方法进行荧光值定量检测。
1.4.4 Luc+BMSCs与胶原支架的组织相容性检测为检验Luc+BMSCs与胶原支架的生物相容性，将BMSCs与胶原支架在培养皿中培养7 d后进行细胞Live/Dead染色。预先将胶原支架置于24孔板中，制备浓度为4×1010 L-1的细胞悬液，取12.5 μL以静态接种方式接种在胶原支架上(相当于每个支架5×105个细胞)[17]，静置4 h，待细胞自然吸附在胶原纤维上，每孔中加入DMEM/F12完全培养基1 mL，7 d后进行快速细胞Live/Dead染色，将试剂盒中A液加入B液中以制备2×染色工作液，向培养基中加入等比例2×染色工作液，25 ℃下孵育15 min，最后在共聚焦显微镜下扫描成像。
1.4.5 大鼠颅骨缺损模型构建为评估Luc+BMSCs在活体动物中的示踪作用，参考张雅雯等[18]改良的方法，对14只健康SD大鼠建立颅骨临界缺损模型。术前常规备皮消毒，沿头部正中线纵向切开皮肤约2.0 cm，仔细分离皮下组织和骨膜，暴露右侧顶骨、枕骨。在预冷的无菌生理盐水滴注降温配合下，使用空心环钻在大鼠右侧顶骨小心制备5 mm临界骨缺损，充分止血后在圆形缺损中放置预负载Luc+BMSCs的胶原支架，最后逐层缝合，碘伏消毒伤口，术后大鼠均存活。
1.4.6 Luc+BMSCs在颅骨缺损中的示踪检测Luc+BMSCs在颅骨缺损中的存活率时，首先将大鼠置于气体麻醉盒中，异氟烷气体(氧流量2 L/min)诱导麻醉，3 min后转为维持麻醉(氧流量1 L/min)，麻醉后取出大鼠，腹腔注射D-荧光素钾盐(150 mg/kg)，然后放入暗箱中并供应异氟烷维持麻醉，活体生物光学成像系统选择Auto模式连续拍照，生物荧光在5 min内出现，30-50 min达到峰值，随后生物荧光逐渐消失。拍照结束后关闭异氟烷麻醉罐并供低流量氧气，待大鼠清醒。选择生物荧光表达峰值的图像作为代表图像，并做荧光定量统计。自术后第1天开始，每周检测1次，直至生物荧光无法检出。
1.5 主要观察指标 ①大鼠BMSCs的生长情况和鉴定结果；②活体生物光学成像系统观察不同感染复数值Luc+BMSCs的生物荧光表达并定量；③活体生物光学成像系统观察不同数量Luc+BMSCs的生物荧光表达并定量；④活体生物光学成像系统观察不同生长代数Luc+BMSCs的生物荧光表达并定量；⑤活体生物光学成像系统观察Luc+BMSCs在颅骨缺损的分布和存活率。
1.6 统计学分析使用SPSS 19.0软件进行数据分析。统计结果均以x±s表示，采用单因素方差分析来比较各实验组间的差异，P < 0.05为差异有显著性意义，P < 0.01为差异有非常显著性意义。

讨论

近年来随着干细胞研究的深入，干细胞在移植后的转归、迁移、存活和功能表达也受到广泛关注。该实验利用带Luciferase标记的慢病毒转染大鼠BMSCs，成功构建了稳定的Luc+BMSCs并验证了该细胞作为示踪细胞的稳定性和有效性，最后在大鼠颅骨缺损内观察了移植干细胞的动态变化过程。研究发现使用慢病毒转染大鼠BMSCs的技术是简单高效的，而且多项研究已经证明，合适滴度的慢病毒载体本身不会影响干细胞的增殖、分化功能[20-21]。该研究也观察到Luc+BMSCs生长状态良好，未出现细胞活力低下或异常死亡的现象。
感染复数通常代表病毒对细胞的感染能力，感染复数越高，细胞越难被感染。目前使用慢病毒作为载体向BMSCs中插入目的基因的研究中，感染复数值的范围在30-150之间[22-24]。该研究中大鼠BMSCs的感染复数值为50，是一个较合适的低值，说明BMSCs较易感染。既往研究中，最佳感染复数是通过在荧光显微镜下计数慢病毒中携带的绿色荧光蛋白基因表达效率决定的[25-26]，这种方法需要在慢病毒中同时插入Luciferase和绿色荧光蛋白双基因，而此前有研究报道，绿色荧光蛋白本身具有免疫原性和细胞毒性[27-28]，因此额外插入绿色荧光蛋白基因可能会影响干细胞的治疗功能以及实验结果的判断。另一方面，在荧光显微镜下统计绿色荧光蛋白阳性细胞增加了操作复杂性。为避免引入过多外源性基因，简化步骤和提高效率，作者尝试直接使用活体生物光学成像系统定量分析Luc+BMSCs的生物荧光值筛选最佳感染复数值，结果证明，以该方法确定的感染复数值转染BMSCs可以获得稳定表达Luciferase的细胞，Luc+BMSCs在体外的细胞-荧光量效关系和连续传代的稳定性证明了这一点。但是需要注意的是，以绿色荧光蛋白确定最佳感染复数值具有量化的标准(通常是感染效率达到80%左右的最小病毒数)，使用Luciferase生物荧光定量确定最佳感染复数值仍需根据更多研究制定一个统一标准。
该研究利用生物发光成像技术观察移植BMSCs在大鼠颅骨缺损中的存活率。数据显示，移植的干细胞在颅骨缺损中局限分布，生物荧光在移植后35 d内以“先快后慢”的方式逐渐消失。其他研究也曾报道，干细胞移植后的存活率和植入率较低。WU等[29]通过组织切片计数绿色荧光蛋白标记的BMSCs植入率，发现干细胞在植入后第7，14，28天的植入率分别为27%，7.6%，2.5%。VILALTA等[30]将表达荧光素酶的人源脂肪干细胞直接注射到裸鼠大腿肌肉组织中，发现在注射后的第1周内，生物发光信号减弱了至少75%。在理论上，Luciferase基因仅能在慢病毒转染的活细胞上表达，并能在增殖及分化的情况下保持稳定，因此移植干细胞荧光消失的原因可能如下：①细胞向邻近组织迁移扩散：干细胞表达多种黏附分子、趋化因子和生长因子受体，具有向受伤组织定向趋化和归巢的能力[31-32]，活体成像中生物荧光分布范围大于颅骨缺损范围证明了这一点；②骨组织损伤后，局部缺血缺氧状态造成营养物质来源不足以及氧化应激产物等代谢废物堆积，从而导致细胞状态差甚至死亡[33-34]；③组织损伤后产生急性炎症，局部炎症因子的释放或炎症细胞(中性粒细胞或者巨噬细胞)浸润导致移植干细胞损伤或被吞噬[35-36]；④移植干细胞与细胞外基质的黏附下降导致“失巢凋亡”[37-38]。因此作者猜测，细胞在移植到颅骨缺损后1周内，荧光定量值锐减74.32%，这可能是受到上述多种因素共同造成的，而在后期荧光信号消失速度变慢，则可能是细胞存活环境逐渐改善，细胞受局部慢性炎症或代谢产物影响导致的，最终荧光信号低于活体成像仪的检测精度而无法检测。基于以上数据，下一步将从多个角度探究局部骨损伤环境对移植干细胞存活的影响，并进一步探讨移植干细胞存活率对骨缺损的修复作用。
综上所述，生物发光成像是一种高效灵敏的活体示踪技术，有利于实时、无创地表征移植干细胞在体内的分布和数量变化。近年来，干细胞移植后在局部的存活情况受到越来越多的重视，目前已报道多种移植环境中提高干细胞存活率的方法[39-40]，如干细胞预处理、基因工程修饰干细胞、改善移植局部免疫环境等。生物发光成像在相关研究中将发挥越来越重要的作用，并为进一步解释干细胞功能和机制提供有力的技术支持。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞；骨髓干细胞；造血干细胞；脂肪干细胞；肿瘤干细胞；胚胎干细胞；脐带脐血干细胞；干细胞诱导；干细胞分化；组织工程

利用生物发光成像示踪大鼠颅骨缺损中移植的骨髓间充质干细胞

Tracing transplanted bone marrow mesenchymal stem cells in rat calvarial defect by bioluminescence imaging

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[1]	姚晓玲, 彭建城, 许岳荣, 杨志东, 张顺聪. 可变角度零切迹前路椎间融合内固定系统治疗脊髓型颈椎病：30个月随访[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(9): 1377-1382.
[2]	肖豪, 刘静, 周君. 脉冲电磁场治疗绝经后骨质疏松症的研究进展[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1266-1271.
[3]	项鑫健, 柳芳, 吴亮亮, 贾大平, 陶越, 赵政男, 赵宇. 高剂量维生素C促进大鼠自体脂肪移植成活[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1242-1246.
[4]	王景, 熊山, 曹金, 冯林伟, 王信. 白细胞介素3在骨代谢中的作用及机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1260-1265.
[5]	安维政, 何萧, 任帅, 刘建宇. 肌源干细胞在周围神经再生中的潜力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1130-1136.
[6]	范一鸣, 刘方煜, 张洪宇, 李帅, 王岩松. 脊髓损伤后室管膜区内源性神经干细胞反应的系列问题[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1137-1142.
[7]	闻丹丹, 李强, 沈才齐, 纪哲, 金培生. 外用红色诺卡氏菌细胞壁骨架提高脂肪间充质干细胞活性修复糖尿病创面[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1038-1044.
[8]	朱兵兵, 邓江华, 陈晶晶, 慕晓玲. 白细胞介素8受体可提高脐带间充质干细胞迁移和向损伤内皮的黏附[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1045-1050.
[9]	罗小玲, 张丽, 杨茂桦, 徐洁, 徐晓梅. 柚皮素干预人牙周膜干细胞的成骨分化能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1051-1056.
[10]	熊挺淋, 应梦慧, 张丽莎, 张晓刚, 杨燕. 诱导多能干细胞分化的心肌细胞电生理特点[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1063-1067.
[11]	王新民, 刘飞, 许杰, 白玉玺, 吕剑. 髓芯减压联合牙髓干细胞治疗兔早期激素性股骨头坏死[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1074-1079.
[12]	房晓磊, 冷军, 张晨, 刘会敏, 郭文. 间充质干细胞不同移植途径治疗缺血性脑卒中疗效差异的系统评价[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1085-1092.
[13]	郭嘉, 丁琼桦, 刘泽, 吕思懿, 周泉程, 高玉花, 白春雨. 间充质干细胞来源外泌体的生物学特性及免疫调控作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1093-1101.
[14]	张璟琳, 冷敏, 朱博恒, 汪虹. 干细胞源外泌体促进糖尿病创面愈合的机制及应用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1113-1118.
[15]	黄晨玮, 费彦亢, 朱梦梅, 李鹏昊, 于兵. 谷胱甘肽在干细胞“干性”及调控中的重要作用[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1119-1124.