基因芯片筛选骨性关节炎差异表达基因及实时荧光定量PCR验证

doi:10.12307/2022.515

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (12): 1907-1914.doi: 10.12307/2022.515

• 骨科植入物相关临床实践 Clinical practice of orthopedic implant • 上一篇下一篇

基因芯片筛选骨性关节炎差异表达基因及实时荧光定量PCR验证

陈财1，曾平2，刘金富1，钱晓芬1，陆冠宇1，熊波1，陈莉华1，黄悦1

1 广西中医药大学研究生院，广西壮族自治区南宁市 530299；2 广西中医药大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530023

收稿日期:2021-04-26 修回日期:2021-04-27 接受日期:2021-06-15 出版日期:2022-04-28 发布日期:2021-12-14
通讯作者: 曾平，博士，汉族，教授，主任，广西中医药大学第一附属医院，广西壮族自治区南宁市 530023
作者简介:陈财，男，1994年生，湖北省黄冈市人，汉族，广西中医药大学在读硕士，主要从事四肢骨病与创伤的防治研究。
基金资助:
国家自然科学基金项目(81960876)，项目负责人：曾平；广西中医药大学第一附属医院院级项目(2017ZD002)，项目负责人：曾平；广西中医药适宜技术开发与推广项目(GZSY21-14)，项目负责人：曾平

Screening of differentially expressed genes in osteoarthritis by gene chip technique and verification using quantitative real-time PCR

Chen Cai1, Zeng Ping2, Liu Jinfu1, Qian Xiaofen1, Lu Guanyu1, Xiong Bo1, Chen Lihua1, Huang Yue1

1Graduate School of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530299, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China; 2the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China

Received:2021-04-26 Revised:2021-04-27 Accepted:2021-06-15 Online:2022-04-28 Published:2021-12-14
Contact: Zeng Ping, MD, Professor, the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530023, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
About author:Chen Cai, Master candidate, Graduate School of Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530299, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China, No. 81960876 (to ZP); College-level Project of the First Affiliated Hospital of Guangxi University of Chinese Medicine, No. 2017ZD002 (to ZP); Guangxi Traditional Chinese Medicine Appropriate Technology Development and Promotion Project, No. GZSY21-14 (to ZP)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
生物信息学：是一个跨学科领域，开发用于理解生物数据的方法和软件工具。作为一门跨学科的科学领域，生物信息学将计算机科学、统计学、数学和工程学结合起来，用来分析和解释生物学数据。
加权基因共表达网络分析：是一种系统生物学方法，用来描述基因间的相关模式，可用于寻找高度相关的基因集；加权基因共表达网络分析促进了基于网络的基因筛选方法，可用于寻找疾病的生物标志物或治疗靶点。

背景：随着人口老龄化的进程，骨性关节炎发病率越来越高，目前仍缺乏有效的治疗方法，基因芯片技术已经广泛用于疾病的诊断和治疗。
目的：采用整合生物信息学和加权基因共表达网络分析法鉴定骨性关节炎中的关键基因，并探讨其作用机制。
方法：从基因表达综合数据库中下载骨性关节炎患者滑膜组织芯片原始数据集4组，利用CIBERSORT算法进行免疫浸润分析；通过R语言软件筛选差异表达基因，并对其进行基因本体论、京都基因与基因组百科全书分析。将筛选出的差异表达基因通过STRING(http://string-db.org/)在线工具得到的相关差异表达基因文本文件，将其导入Cytoscape软件编辑可视化蛋白质相互作用网络；利用R语言软件构建差异表达基因条形图获取degree值前10的差异表达基因。整合4组芯片数据集运用加权基因共表达网络分析算法筛选出相关性最高的基因共表达模块的基因，采用Venn分析法筛选出交集基因。收集4例骨性关节炎患者和4例关节创伤患者滑膜组织，采用实时荧光定量PCR进行验证分析。
结果与结论：①共筛选出107个差异表达基因；包含上调基因46个，下调基因61个；②基因本体论富集结果表明，差异表达基因主要涉及骨化和细胞黏附的正调控等生物学过程；京都基因与基因组百科全书通路主要富集在类风湿性关节炎通路、核因子κB信号通路和受体酪氨酸激酶-蛋白激酶B信号通路；免疫浸润结果表明在骨性关节炎患者滑膜组织中M0巨噬细胞和M2巨噬细胞含量较高；③基质金属蛋白酶1、金属蛋白酶组织抑制剂4、层粘连蛋白亚基α3和卵泡抑素3是获得的交集基因；荧光定量PCR验证结果表明金属蛋白酶组织抑制剂4、层粘连蛋白亚基α3和卵泡抑素3在骨性关节炎患者与关节创伤患者滑膜组织中的表达量具有明显差异性；④筛选出的金属蛋白酶组织抑制剂4、层粘连蛋白亚基α3和卵泡抑素3可能是骨性关节炎的治疗靶点。
缩略语：加权基因共表达网络分析：weighted gene co-expression network analysis，WGCNA；京都基因与基因组百科全书：Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG

https://orcid.org/0000-0001-7279-0281(陈财)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

关键词: 基因芯片, 生物信息学, 加权基因共表达网络分析, 骨性关节炎, 滑膜, 差异表达基因, 免疫细胞, 信号通路

Abstract: BACKGROUND: The incidence of osteoarthritis is increasing as the population ages, and there is still no effective treatment. Gene chip technology has been widely used in the diagnosis and treatment of diseases.
OBJECTIVE: To identify the key genes in osteoarthritis by using integrative bioinformatics and weighted gene co-expression network analysis (WGCNA) and to investigate its mechanism.
METHODS: Four original data sets of synovial tissue chips in osteoarthritis patients were downloaded from Gene Expression Omnibus database, and the immune infiltration was analyzed by CIBERSORT algorithm. Differentially expressed genes were screened by R-language software. Gene ontology and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) were used to analyze the selected differentially expressed genes. The text files of these differentially expressed genes were obtained through the online tool STRING (http://string-db.org/) and were imported into the Cytoscape software to edit the visual protein-protein interaction network. R-language software was used to build a bar chart of differentially expressed genes to obtain the top 10 differentially expressed genes in degree values. The four chip data sets were integrated to screen out the genes with the highest correlation of gene co-expression module by WGCNA algorithm, and the intersection genes were screened by Venn analysis method. The synovial tissues of four patients with osteoarthritis and four patients with joint trauma were collected for quantitative real-time PCR verification.
RESULTS AND CONCLUSION: (1)A total of 107 differentially expressed genes were screened out, including 46 up-regulated genes and 61 down-regulated genes. (2)The gene ontology enrichment results showed that differentially expressed genes were mainly involved in biological processes such as positive regulation of ossification and cell adhesion. KEGG pathways were mainly enriched in rheumatoid arthritis pathways, nuclear factor-κB signaling pathways, and receptor protein tyrosine kinase B signaling pathways. Immune infiltration results indicated that the contents of M0 macrophages and M2 macrophages were relatively high in the synovial tissue of patients with osteoarthritis. (3)The obtained intersection genes included matrix metalloproteinase 1, tissue inhibitor of metalloproteinase 4, laminin subunit alpha 3, and follistatin 3. The results of quantitative real-time PCR confirmed that there were significant differences in the expression levels of tissue inhibitor of metalloproteinase 4, laminin subunit alpha 3, and follistatin 3 between the synovial tissue samples from patients with osteoarthritis and those with joint trauma. (4)Therefore, tissue inhibitor of metalloproteinase 4, laminin subunit alpha 3, and follistatin 3 may be therapeutic targets for osteoarthritis.

Key words: gene chip, bioinformatics, weighted gene co-expression network analysis, osteoarthritis, synovium, differentially expressed gene, immune cell, signaling pathway

中图分类号:

陈财, 曾平, 刘金富, 钱晓芬, 陆冠宇, 熊波, 陈莉华, 黄悦. 基因芯片筛选骨性关节炎差异表达基因及实时荧光定量PCR验证[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(12): 1907-1914.

Chen Cai, Zeng Ping, Liu Jinfu, Qian Xiaofen, Lu Guanyu, Xiong Bo, Chen Lihua, Huang Yue. Screening of differentially expressed genes in osteoarthritis by gene chip technique and verification using quantitative real-time PCR[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(12): 1907-1914.

图/表（结果） 11

2.1 筛选的差异基因根据校正后的P < 0.05和|log2FC|≥1作为标准，从所有数据集中总共获得107个差异表达基因；包括46个上调的差异表达基因和61个下调的差异表达基因；绘制可视化热图，见图1。

2.2 基因本体论和KEGG富集分析结果基因本体论富集分析结果表明，生物学过程中的差异表达基因生物学过程主要是骨化的形成、细胞黏附的正调控、对应激的反应、淋巴细胞活化的阳性调节和对皮质类固醇的反应等；细胞成分中差异表达基因成分主要是胶原蛋白；在分子功能中差异表达基因分子功能主要是受体配体活性、信号受体激活剂活性和细胞外基质结构成分，以下列举了差异表达最明显的前10个基因，见图2及表2。

KEGG通路主要富集在类风湿性关节炎通路、核因子κB信号通路和受体酪氨酸激酶-蛋白激酶B通路，以下列举了差异表达最明显前10的信号通路，见图3及表3。

2.3 免疫浸润分析结果通过CIBERSORT算法共得到22种免疫细胞，结果以小提琴图显示，见图4，P < 0.05被认为差异有显著性意义。小提琴图结果表明在骨性关节炎患者滑膜组织中M0巨噬细胞、M2巨噬细胞和滤泡辅助性T细胞含量较高。

2.4 蛋白质相互作用网络和筛选出的Degree值前10的差异表达基因为了进一步研究差异表达基因在蛋白质水平上的相互作用，根据 STRING 数据库中得到的文本文件，利用Cytoscape(https://cytoscape.org/，3.8.0版本)软件进行可视化编辑构建了一个蛋白质相互作用网络，见图5；通过R语言软件，根据Degree得分构建可视化条形图，见图6。

列出10 个Degree最高的差异表达基因：基质金属蛋白酶9、白细胞介素1β、基质金属蛋白酶3、血管内皮生长因子A、Ⅰ型胶原A1重组蛋白、基质金属蛋白酶1、金属蛋白酶组织抑制剂4、前胶原C-蛋白酶增强蛋白、层粘连蛋白亚基α3和卵泡抑素3。
2.5 WGCNA相关性最高基因模块筛选结果 WGCNA算法结果表明，MEpink模块是正负相关性最强的模块，其包含174 个基因，见图7。

2.6 交集基因的获取将WGCNA算法获取的174个基因与蛋白质相互作用网络中Degree前10的差异表达基因利用R语言软件中Venn分析法取交集，见图8；其中基质金属蛋白酶1、金属蛋白酶组织抑制剂4、层粘连蛋白亚基α3和卵泡抑素3是获得的交集基因。

2.7 PCR检测验证结果 PCR结果表明，基质金属蛋白酶1在骨性关节炎患者滑膜和关节创伤患者滑膜中无明显差异；金属蛋白酶组织抑制剂4、层粘连蛋白亚基α3和卵泡抑素3在骨性关节炎患者滑膜组织中表达量下调，并且差异有显著性意义(P < 0.05)，见图9。

参考文献

[1] KATZ JN, ARANT KR, LOESER RF. Diagnosis and Treatment of Hip and Knee Osteoarthritis: A Review. JAMA. 2021;325(6):568-578.
[2] FRANK M, BWEMERO J, KALUNGA D, et al. OA60 Public health and palliative care mix; a ccpmedicine approach to reverse the overgrowing burden of non-communicable diseases in tanzania. BMJ Support Palliat Care. 2015;5 Suppl 1:A19.
[3] CHANG MC, CHIANG PF, KUO YJ, et al. Hyaluronan-Loaded Liposomal Dexamethasone-Diclofenac Nanoparticles for Local Osteoarthritis Treatment. Int J Mol Sci. 2021;22(2):665.
[4] WANG X, HUNTER DJ, JIN X, et al. The importance of synovial inflammation in osteoarthritis: current evidence from imaging assessments and clinical trials. Osteoarthritis Cartilage. 2018;26(2): 165-174.
[5] RIM YA, JU JH. The Role of Fibrosis in Osteoarthritis Progression. Life (Basel). 2020;11(1):3.
[6] LIU W, JIAO Y, TIAN C, et al. Gene Expression Profiling Studies Using Microarray in Osteoarthritis: Genes in Common and Different Conditions. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2020;68(5):28.
[7] TANG J, LIU T, WEN X, et al. Estrogen-related receptors: novel potential regulators of osteoarthritis pathogenesis. Mol Med. 2021;27(1):5.
[8] 罗磊, 龚宝成, 刘福囝. GSE74602芯片数据中直肠癌关键基因与治疗药物的生物信息学筛选[J] .中国普通外科杂志,2018,27(4):457-467.
[9] MARTEL-PELLETIER J. Pathophysiology of osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 1998;6(6):374-376.
[10] ARTHUR A, GRONTHOS S. Eph-Ephrin Signaling Mediates Cross-Talk Within the Bone Microenvironment. Front Cell Dev Biol. 2021;9: 598612.
[11] NISHIMURA R, MORIYAMA K, YASUKAWA K, et al. Combination of interleukin-6 and soluble interleukin-6 receptors induces differentiation and activation of JAK-STAT and MAP kinase pathways in MG-63 human osteoblastic cells. J Bone Miner Res. 1998;13(5):777-785.
[12] GARCIA JP, UTOMO L, RUDNIK-JANSEN I, et al. Association between Oncostatin M Expression and Inflammatory Phenotype in Experimental Arthritis Models and Osteoarthritis Patients. Cells. 2021;10(3):508.
[13] 刘金富, 曾平, 农焦, 等. 整合多组微阵列芯片分析骨关节炎患者滑膜中生物标志物和治疗靶点[J] . 中国组织工程研究,2021,25(23): 3690-3696.
[14] MYNGBAY A, MANARBEK L, LUDBROOK S, et al. The Role of Collagen Triple Helix Repeat-Containing 1 Protein (CTHRC1) in Rheumatoid Arthritis. Int J Mol Sci. 2021;22(5):2426.
[15] HU Q, ECKER M. Overview of MMP-13 as a Promising Target for the Treatment of Osteoarthritis. Int J Mol Sci. 2021;22(4):1742.
[16] 卢文豪, 周雪灵, 任义昆, 等. 电针上调Cezanne表达抑制NF-κB信号通路介导的大鼠脑缺血/再灌注炎性损伤[J] . 第三军医大学学报,2021,43(4):283-294.
[17] HAN S, LI Z, HAN F, et al. ROR alpha protects against LPS-induced inflammation by down-regulating SIRT1/NF-kappa B pathway. Arch Biochem Biophys. 2019;668:1-8.
[18] NEES TA, ROSSHIRT N, REINER T, et al. Die Rolle der Inflammation bei Arthroseschmerzen [Inflammation and osteoarthritis-related pain]. Schmerz. 2019;33(1):4-12.
[19] SUN K, LUO J, GUO J, et al. The PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in osteoarthritis: a narrative review. Osteoarthritis Cartilage. 2020;28(4): 400-409.
[20] SHI Y, HU X, CHENG J, et al. A small molecule promotes cartilage extracellular matrix generation and inhibits osteoarthritis development. Nat Commun. 2019;10(1):1914.
[21] VAN DER KRAAN PM, VAN DEN BERG WB. Chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis: role in initiation and progression of cartilage degeneration? Osteoarthritis Cartilage. 2012;20(3):223-232.
[22] WU J, ZOU M, PING A, et al. MicroRNA-449a upregulation promotes chondrocyte extracellular matrix degradation in osteoarthritis. Biomed Pharmacother. 2018;105:940-946.
[23] SRIVASTAVA RK, DAR HY, MISHRA PK. Immunoporosis: Immunology of Osteoporosis- Role of T Cells. Front Immunol. 2018;9:657.
[24] SUN Y, ZUO Z, KUANG Y. An Emerging Target in the Battle against Osteoarthritis: Macrophage Polarization. Int J Mol Sci. 2020;21(22): 8513.
[25] NAKAJIMA H, WATANABE S, HONJOH K, et al. Expression Analysis of Susceptibility Genes for Ossification of the Posterior Longitudinal Ligament of the Cervical Spine in Human OPLL-related Tissues and a Spinal Hyperostotic Mouse (ttw/ttw). Spine (Phila Pa 1976). 2020; 45(22):E1460-E1468.
[26] CAO J, HAN X, QI X, et al. miR‑204‑5p inhibits the occurrence and development of osteoarthritis by targeting Runx2. Int J Mol Med. 2018; 42(5):2560-2568.
[27] CHEN CL, ZHANG L, JIAO YR, et al. miR-134 inhibits osteosarcoma cell invasion and metastasis through targeting MMP1 and MMP3 in vitro and in vivo. FEBS Lett. 2019;593(10):1089-1101.
[28] GUO Y, JIA X, CUI Y, et al. Sirt3-mediated mitophagy regulates AGEs-induced BMSCs senescence and senile osteoporosis. Redox Biol. 2021; 41:101915.
[29] WYATT LA, NWOSU LN, WILSON D, et al. Molecular expression patterns in the synovium and their association with advanced symptomatic knee osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 2019;27(4):667-675.
[30] GENG R, XU Y, HU W, et al. The association between MMP-1 gene rs1799750 polymorphism and knee osteoarthritis risk. Biosci Rep. 2018;38(5):BSR20181257.
[31] STACK J, MCCARTHY GM. Cartilage calcification and osteoarthritis: a pathological association? Osteoarthritis Cartilage. 2020;28(10):1301-1302.
[32] SAKAMURI SSVP, WATTS R, TAKAWALE A, et al. Absence of Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-4 (TIMP4) ameliorates high fat diet-induced obesity in mice due to defective lipid absorption. Sci Rep. 2017;7(1):6210.
[33] OZEN G, BOUMIZA S, DESCHILDRE C, et al. Inflammation increases MMP levels via PGE₂ in human vascular wall and plasma of obese women. Int J Obes (Lond). 2019;43(9):1724-1734.
[34] ZHAO H, LIU S, MA C, et al. Estrogen-Related Receptor γ Induces Angiogenesis and Extracellular Matrix Degradation of Temporomandibular Joint Osteoarthritis in Rats. Front Pharmacol. 2019;10:1290.
[35] WANG F, LIU J, CHEN X, et al. IL-1β receptor antagonist (IL-1Ra) combined with autophagy inducer (TAT-Beclin1) is an effective alternative for attenuating extracellular matrix degradation in rat and human osteoarthritis chondrocytes. Arthritis Res Ther. 2019;21(1):171.
[36] WANG J, AN F, CAO Y, et al. Association of TIMP4 gene variants with steroid-induced osteonecrosis of the femoral head in the population of northern China. Peer J. 2019;7:e6270.
[37] 蒋锐, 於子卫.细胞外基质在周围神经修复组织工程学中应用的研究进展[J] .听力学及言语疾病杂志,2018,26(5):556-560.
[38] ABERKANE A, ESSAHIB W, SPITS C, et al. Expression of adhesion and extracellular matrix genes in human blastocysts upon attachment in a 2D co-culture system. Mol Hum Reprod. 2018;24(7):375-387.
[39] LI Z, MENG D, LI G, et al. Overexpression of microRNA-210 promotes chondrocyte proliferation and extracellular matrix deposition by targeting HIF-3α in osteoarthritis. Mol Med Rep. 2016;13(3):2769-2776.
[40] GANG X, SUN Y, LI F, et al. Identification of key genes associated with rheumatoid arthritis with bioinformatics approach. Medicine (Baltimore). 2017;96(31):e7673.
[41] MACDONALD IJ, LIU SC, SU CM, et al. Implications of Angiogenesis Involvement in Arthritis. Int J Mol Sci. 2018;19(7):2012.
[42] VADALÀ G, RUSSO F, MUSUMECI M, et al. Targeting VEGF-A in cartilage repair and regeneration: state of the art and perspectives. J Biol Regul Homeost Agents. 2018;32(6 Suppl. 1):217-224.
[43] TAKANO S, UCHIDA K, INOUE G, et al. Vascular endothelial growth factor expression and their action in the synovial membranes of patients with painful knee osteoarthritis. BMC Musculoskelet Disord. 2018;19(1):204.
[44] WANG YH, KUO SJ, LIU SC, et al. Apelin Affects the Progression of Osteoarthritis by Regulating VEGF-Dependent Angiogenesis and miR-150-5p Expression in Human Synovial Fibroblasts. Cells. 2020;9(3):594.
[45] OLDKNOW KJ, SEEBACHER J, GOSWAMI T, et al. Follistatin-like 3 (FSTL3) mediated silencing of transforming growth factor β (TGFβ) signaling is essential for testicular aging and regulating testis size. Endocrinology. 2013;154(3):1310-1320.
[46] CHRUŚCIK A, GOPALAN V, LAM AK. The clinical and biological roles of transforming growth factor beta in colon cancer stem cells: A systematic review. Eur J Cell Biol. 2018;97(1):15-22.
[47] WANG Q, ZHOU C, LI X, et al. TGF-β1 promotes gap junctions formation in chondrocytes via Smad3/Smad4 signalling. Cell Prolif. 2019;52(2): e12544.
[48] SUN PF, KONG WK, LIU L, et al. Osteopontin accelerates chondrocyte proliferation in osteoarthritis rats through the NF-κb signaling pathway. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2020;24(6):2836-2842.
[49] ZHU H, DAI L, LI X, et al. Role of the long noncoding RNA H19 in TGF-β1-induced Tenon’s capsule fibroblast proliferation and extracellular matrix deposition. Exp Cell Res. 2020;387(2):111802.

引言

骨性关节炎的病理特征是软骨、骨骼、滑膜、韧带、肌肉和关节周围脂肪的变化，从而导致关节疼痛、僵硬和功能受限[1]。骨性关节炎的发病人数约占世界人口的13%，世界卫生组织将其称为“第一致残疾病”，对于患者的生活质量产生了极大的危害[2]。目前的医疗策略不能完全治愈该疾病的致病过程，而只能减缓症状或延缓疾病的进展[3]。因此，寻找骨性关节炎新的治疗手段刻不容缓。
在骨性关节炎发展的多个阶段均已观察到滑膜异常，越来越多的证据表明它可能在骨性关节炎病理中起重要作用[4]。研究表明骨性关节炎滑膜中2-氧戊二酸5-双加氧酶2的表达随着骨性关节炎的严重程度而增加[5]；还有研究发现在滑膜中检测到基因PPP2R5C、EXT1、HS6ST与GSTT1表达水平的升降与骨性关节炎的严重程度密切相关[6]。骨性关节炎的发病机制尚未完全明确，尽管目前有关骨性关节炎发病机制的基础研究已取得显著进展，但对这种疾病的认识仍需进一步提高[7]，因此，发现骨性关节炎新的治疗靶点及其参与的信号通路是目前医学领域所关注的热点。
此次研究将从美国国立生物技术信息中心(NCBI)基因表达综合数据库中搜索所有骨性关节炎滑膜组织基因芯片数据集并下载其中符合实验要求的基因芯片数据集4组，通过整合生物信息学法联合加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis，WGCNA)算法筛选出健康对照组和骨性关节炎患者滑膜组织之间的关键基因；通过分析目标基因的生物学功能和途径，可以在分子水平上进一步了解骨性关节炎，为骨性关节炎的诊断、治疗和实验研究提供理论依据。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

材料方法

1.1 设计基因学实验，采用t检验进行两组间均数差异的比较。
1.2 时间及地点实验于2020年9-11月在广西中医药大学第一附属医院分子实验室完成。
1.3 对象于2020年9-11月收集来自广西中医药大学第一附属医院4例骨性关节炎患者和4例关节创伤患者的手术废弃滑膜组织用于PCR验证，患者均为男性，年龄40-50岁，患者之间无亲缘关系。该研究方案已经广西中医药大学第一附属医院伦理委员会批准，所有患者均签署了知情同意书。
实验组纳入标准：①参考《骨关节炎诊疗指南(2018版)》属于原发性骨性关节炎，即无创伤、炎症、劳损等诱因；②符合骨性关节炎诊断标准，有关节疼痛、僵硬、活动障碍，影像学检查提示骨赘形成，关节间隙变窄，需要进行手术治疗者；③年龄40-50岁；④签署知情同意书。
实验组排除标准：①属于风湿性关节炎、痛风性关节炎者；②有乙肝、结核、梅毒等传染性疾病者；③合并有严重心脑血管疾病、恶性肿瘤等原发性疾病者；④不适宜手术治疗的患者。
对照组纳入标准：①有创伤史；②因外伤导致关节处骨折或韧带损伤，需要进行手术治疗的患者；③年龄40-50岁；④签署知情同意书。
对照组排除标准：①伴有骨性关节炎患者；②有乙肝、结核、梅毒等传染性疾病者；③合并有严重心脑血管疾病、恶性肿瘤等原发性疾病者；④不适宜手术治疗的患者。
1.4 资料从NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的基因表达综合数据库中搜索所有骨性关节炎滑膜组织相关的基因芯片数据，下载符合实验要求的基因芯片数据集4组，其系列号为GSE1919、GSE41038、GSE55235和GSE82107，这4个数据集均来源于人滑膜；GSE1919 包含5例骨性关节炎患者和5例健康对照；GSE41038包含3例骨性关节炎患者和4例健康对照；GSE55235包含10例骨性关节炎患者和10例健康对照；GSE82107包含10例骨性关节炎患者和7例健康对照。共使用4个数据集，包括28个骨性关节炎样本和26个健康对照样本。
1.5 实验方法
1.5.1 差异表达基因筛选使用Perl(https://www.perl.org/，5.32.0版本) 软件注释4个数据集系列矩阵文件的探针，将探针的名称转换为基因名；同一基因对应的所有探针的表达值取平均表达值。使用R软件中的Limma包，筛选整合的基因表达矩阵中骨性关节炎的差异表达基因；使用t检验后基因符号的相应 P值，并将调整后的 P < 0.05 和|log2FC|≥1用作选择标准。用R语言软件中的 Pheatmap软件包(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/heatmaps.html)用于绘制可视化的差异表达基因热图。
1.5.2 差异表达基因的京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)和基因本体论富集分析在此次实验中基于R语言软件工具将筛选出的差异表达基因进行了基因本体论富集分析和KEGG途径富集分析；P < 0.05 被认为差异有显著性意义。
1.5.3 免疫细胞浸润通过R软件中的limma包将基因矩阵转换为免疫细胞的矩阵；根据CIBERSORT官网(https://cibersort.stanford.edu)的免疫细胞中单细胞测序数据，使用R语言软件包比对计算出各样本中免疫细胞的浸润情况；根据P < 0.05筛选样品，并计算样品中每种免疫细胞的百分比。
1.5.4 蛋白质相互作用网络构建和Degree值前10 差异表达基因的获取 STRING数据库主要整合了来源不同的基因表达数据，如高通量测序数据、共表达数据以及实验相关数据等，构建一种特殊的根据基因之间的结合分数来评价蛋白间相关度的体系[8]。将通过R语言软件筛选出差异表达基因通过STRING(https://string-db.org/)在线工具得到的相关差异表达基因文本文件，将其导入Cytoscape(https://cytoscape.org/，3.8.0版本)软件编辑可视化蛋白质相互作用网络；通过R语言软件构建Degree得分前10差异基因的可视化条形图。
1.5.5 WGCNA数据来源及数据预处理将上述4组基因芯片数据集放入同一文件夹，用于后续基因共表达模块的构建。
1.5.6 共表达网络的构建和关键基因的获取使用R语言软件中的WGCNA软件包来构建所有差异表达基因的基因共表达模块；将正负相关性最高的基因模块，鉴定为通过WGCNA算法获取的关键基因模块。
1.5.7 目标基因将蛋白质相互作用网络中Degree值前10的差异表达基因与通过WGCNA算法所获得的相关性最高模块的基因运用R语言软件中的Venn图(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html；Venny)获取交集，来得到目标基因。
1.5.8 PCR实验验证于2020年9-11月收集来自广西中医药大学第一附属医院4例骨性关节炎患者和4例关节创伤患者的手术废弃滑膜组织用于PCR验证，患者均为男性，年龄40-50岁，患者之间无亲缘关系。使用TRIzol试剂(Takara，中国大连)从滑膜组织中提取总RNA，在37 ℃ 60 min、95 ℃ 5 min的反应条件下将来自总RNA的RNA样品反转录为cDNA，PCR分析使用2 × Universal SYBR Green Fast qPCR混合物(ABclonal，中国武汉)进行，条件如下：95 ℃ 2 min，然后95 ℃ 5 s 40个循环，60 ℃ 30 s。记录每个基因的循环阈值(Ct)，GAPDH作为内参，使用2-ΔΔCt方法计算相对mRNA表达量。引物序列见表1。

1.6 主要观察指标采用实时荧光定量PCR检测4例骨性关节炎患者和4例关节创伤患者滑膜组织中基质金属蛋白酶1、金属蛋白酶组织抑制剂4、层粘连蛋白亚基α3和卵泡抑素3的表达差异。
1.7 统计学分析所有分析均使用SPSS 20.0和https://secure.graphpad.com/，5.0版本进行。计量资料用x±s表示，采用t检验进行两组间均数差异的比较，P < 0.05表示差异有显著性意义。

讨论

骨性关节炎是骨科常见疾病之一，其发病率有逐年上升的趋势，这严重威胁着人们的生活质量；探索骨性关节炎的分子机制，找出潜在的诊断及预后的生物标志物，具有重要意义。基质金属蛋白酶9、白细胞介素1β、基质金属蛋白酶3、血管内皮生长因子A、Ⅰ型胶原A1重组蛋白、基质金属蛋白酶1、金属蛋白酶组织抑制剂4、前胶原C-蛋白酶增强蛋白、层粘连蛋白亚基α3和卵泡抑素3是此次实验所得到蛋白质相互作用网络中Degree值前10的差异表达基因，为了更好地了解差异表达基因的作用机制，作者对其进行了基因本体论、KEGG通路富集分析；此外，为了提高此次实验结果的准确性，通过联合WGCNA算法获取两者的交集基因，并对其进一步分析。
基因本体论分析表明，生物学过程中的差异表达基因生物学过程主要涉及骨化的形成。骨化广义是指骨组织的生成过程，而狭义指成骨细胞在骨基质中发生钙质沉着。临床和实验室证据均表明，骨性关节炎中软骨下骨代谢的改变可能是由于成骨细胞行为异常所致[9]；骨骼微环境中的成骨细胞、造血细胞、内皮细胞和神经细胞系统之间动态相互作用的破坏会导致骨骼不健康，并增加对骨性关节炎的易感性[10]。白细胞介素6可能通过激活Janus激酶-信号转导和转录蛋白激活子信号通路和丝裂原活化蛋白激酶信号通路来调节成骨细胞的分化和增殖[11]。白细胞介素6属于促炎细胞因子中的重要一员，促炎细胞因子被认为在骨性关节炎中起主要作用[12]；白细胞介素6与骨化的过程密切相关，抑制骨化的过程对骨性关节炎治疗具有重要的意义。
KEGG通路主要富集在类风湿性关节炎通路、核因子κB信号通路和受体酪氨酸激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT)信号通路。类风湿性关节炎和骨性关节炎是影响关节的常见慢性疾病，尽管发病机制不同，但在临床表现与细胞和分子基础之间存在一定的相似性[13]。类风湿性关节炎是一种慢性自身免疫性疾病，会引起关节发炎、软骨破坏和骨侵蚀[14]；骨性关节炎是一种常见的退行性疾病，其特征在于关节软骨的破坏和周围组织的慢性炎症[15]；两者都可见关节炎症和软骨破坏等表现。核因子κB转录因子家族是许多细胞信号通路的多效性调节因子，调控细胞对多种与炎症相关的刺激做出反应[16]；核因子κB 信号通路能够参与如白细胞介素1β、肿瘤坏死因子、白细胞介素6和单核细胞趋化蛋白1等炎症因子的介导[17]，炎症机制在骨性关节炎病理生理中起着关键作用，研究发现在骨性关节炎患者外周血和滑液样品中促炎细胞因子水平升高[18]。受体酪氨酸激酶/蛋白激酶B信号通路与骨性关节炎发病密切相关，在病理条件下，受体酪氨酸激酶/蛋白激酶B信号通路能够减少软骨细胞凋亡，从而来预防骨性关节炎的发生[19]。细胞外基质由软骨细胞合成，其合成和分解平衡维持软骨稳态[20-21]，关节软骨细胞外基质在骨性关节炎的发展中起着重要作用，若其合成与降解失衡将导致骨性关节的发生[22]。
通过免疫浸润分析发现骨性关节炎患者滑膜组织中M0巨噬细胞、M2巨噬细胞含量较高；而T细胞滤泡助手和T细胞CD4记忆激活含量较低。巨噬细胞集落刺激因子是破骨细胞增殖和存活所必需的因子[23]；成骨细胞、破骨细胞和间充质干细胞在内的关节细胞的代谢调节中也起着主要作用。M1巨噬细胞分泌的一种蛋白质Rspo2在骨性关节炎的发展中起着重要作用[24]；NAKAJIMA 等[25]研究表明Rspo2可能参与软骨内骨化；而软骨内骨化是骨性关节炎发生的标志之一[26]。
基质金属蛋白酶1、金属蛋白酶组织抑制剂4、层粘连蛋白亚基α3和卵泡抑素3为此次实验得到的4个目标基因。基质金属蛋白酶1 是一种间质胶原酶和成纤维细胞胶原酶，在正常的生理和病理过程中会促进细胞外基质的分解[27]。基质金属蛋白酶1可以通过c-Jun N末端激酶和细胞外调节蛋白激酶途径加速骨髓间充质干细胞的成骨分化，骨髓间充质干细胞的“成骨-成脂”分化平衡对于维持健康的骨稳态是必不可少的[28]。有学者在骨性关节炎中发现基质金属蛋白酶1表达量的增加[29]，基质金属蛋白酶1能够降解软骨[30]，在骨性关节炎的病理中存在软骨钙化，针对软骨钙化的治疗有机会成为骨性关节炎新型的治疗策略[31]。尽管很多研究发现基质金属蛋白酶1和骨性关节炎关系密切，但是通过PCR实验验证发现基质金属蛋白酶1在骨性关节炎患者和关节创伤患者滑膜组织中的表达量并未表现出明显差异性，基质金属蛋白酶1对于骨性关节炎的作用机制有待进一步研究。
金属蛋白酶组织抑制剂4是金属蛋白酶的组织抑制剂家族中的重要一员；研究表明，金属蛋白酶组织抑制剂是调节组织细胞外基质降解的基质金属蛋白酶的抑制剂[32]；基质金属蛋白酶通过降解细胞外基质参与许多生理和病理过程[33]。ZHAO等[34]研究发现颞下颌关节骨性关节炎期间软骨破坏的主要原因是细胞外基质降解；而WANG等[35]表明通过阻断白细胞介素1β 结合增强自噬减弱细胞外基质降解可能是骨性关节炎的潜在治疗策略。此外，金属蛋白酶组织抑制剂4 的表达显著降低，将导致金属蛋白酶增加，从而引起病理性软骨破坏[36]，软骨破坏是骨性关节炎重要的病理机制之一。PCR实验结果表明金属蛋白酶组织抑制剂4在骨性关节炎患者滑膜组织中表达量下调，推测上调金属蛋白酶组织抑制剂4的表达量将会抑制骨性关节炎的发病。
层粘连蛋白亚基α3是一种分泌蛋白，属于层粘连蛋白家族。细胞外基质主要由层粘连蛋白、纤连蛋白、Ⅰ，Ⅳ型胶原蛋白组成[37]；层粘连蛋白亚基α3是参与细胞外基质沉积和转换的重要基因之一[38]，细胞外基质的降解是导致骨性关节炎发病的主要原因之一[39]。层粘连蛋白亚基α3编码了一种由巨噬细胞缺氧诱导的蛋白，可有效调节血管生成[40]。血管生成是指新血管的生长，其在骨性关节炎的发病机制中至关重要[41]。血管内皮生长因子家族在血管生成中发挥关键作用[42]，膝关节骨性关节炎患者滑液中的血管内皮生长因子水平与膝骨关节炎严重程度呈正相关[43]；滑膜诱导的血管生成是骨性关节炎发病机制的核心[44]。作者认为层粘连蛋白亚基α3可能通过调控细胞外基质的功能和血管生成对骨性关节炎的发病产生重要影响。
卵泡抑素3是一种结合并抑制转化生长因子β配体作用的糖蛋白[45]。转化生长因子β是一种多用途细胞因子，在许多细胞功能中发挥作用，例如增殖、分化、迁移、凋亡、细胞黏附和上皮向间质转化的调控[46]。转化生长因子β1属于转化生长因子β家族重要成员之一，转化生长因子β1作为软骨细胞中最重要的因子之一，可促进软骨前体细胞分化以及软骨细胞的增殖、迁移和代谢[47]。有研究表明软骨细胞的增殖，能诱导大鼠骨性关节炎的发生[48-49]。此外，转化生长因子β1能够促进细胞外基质沉积，上文已经提到细胞外基质沉积是骨性关节炎发病的重要诱因之一。因此，作者考虑卵泡抑素3能够通过调控转化生长因子β的表达对骨性关节炎的发病产生抑制作用。
综上所述，推测类风湿性关节炎通路、核因子κB信号通路和受体酪氨酸激酶-蛋白激酶B信号通路都与骨性关节炎的发病相关；金属蛋白酶组织抑制剂4、层粘连蛋白亚基α3和卵泡抑素3是治疗骨性关节炎的重要靶基因，并且促进金属蛋白酶组织抑制剂4和卵泡抑素3的表达量对于骨性关节炎的发生发展具有防治作用。虽然此次研究存在一定局限性，例如：仅从滑膜样本中探讨，缺乏全面性；选取基因芯片数据样品量较少。但是，此次研究运用整合生物信息学法联合WGCNA算法并且通过PCR实验验证提高了实验结果的准确性和科学性，这对于寻找骨性关节炎的治疗靶点具有重要意义。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：人工关节；骨植入物；脊柱；骨折；内固定；数字化骨科；组织工程

基因芯片筛选骨性关节炎差异表达基因及实时荧光定量PCR验证

Screening of differentially expressed genes in osteoarthritis by gene chip technique and verification using quantitative real-time PCR

PDF

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表（结果） 11

参考文献

相关文章 15

引言

材料方法

讨论

文章快阅

延伸阅读

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	王宝娟, 郑曙光, 张琪, 李田洋. 苗药熏蒸治疗膝骨关节炎模型兔可延缓细胞外基质的破坏[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(8): 1180-1186.
[2]	高俞锦, 彭双麟, 马治超, 陆诗, 曹花月, 王浪, 肖金刚. 糖尿病骨质疏松症模型小鼠脂肪干细胞的成骨能力[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 999-1004.
[3]	梁学振, 杨曦, 李嘉程, 骆帝, 许波, 李刚. 补肾活血胶囊介导Hedgehog信号通路调控大鼠骨髓间充质干细胞成骨成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1020-1026.
[4]	王继芳, 鲍祯, 乔亚红. miR-206调控小细胞肺癌干细胞EVI1基因表达及细胞生物学行为[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(7): 1027-1031.
[5]	周建国, 刘世伟, 袁长红, 毕声荣, 杨国平, 胡伟全, 刘辉, 钱锐. 后交叉韧带保留型假体全膝关节置换治疗膝骨性关节炎合并膝外翻畸形[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(6): 892-897.
[6]	何俊君, 黄泽灵, 洪振强. 阳和汤对早期膝骨关节炎模型兔滑膜炎症的影响[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 694-699.
[7]	刘进, 李振, 郝慧琴, 王泽, 赵彩虹, 芦文静. 二妙散水提物调控胶原诱导性关节炎大鼠成纤维样滑膜细胞增殖、迁移和炎性因子的表达[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 688-693.
[8]	李嘉骏, 夏天, 刘佳敏, 陈锋, 陈豪特, 卓映宏, 吴炜锋. 淫羊藿苷调控成骨信号相关通路治疗激素性股骨头缺血性坏死的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(5): 780-785.
[9]	张键, 林坚平, 周钢, 方业汉, 王本超, 吴永昌. MRI半定量评估早期膝骨关节炎软骨退变[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(3): 425-429.
[10]	王冲, 张梅莹, 周健, 劳克诚. 直接前方与后外侧入路进行全髋关节置换患者早期的步态变化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(3): 359-364.
[11]	李安安, 姜涛, 詹敏, 蔡宇宁, 宋敏, 李聪聪, 林文政, 张家媛, 刘文刚. 参苓白术散治疗膝骨关节炎作用机制的网络药理学和分子对接技术分析[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 197-204.
[12]	章晓云, 李华南, 陈锋, 柴源, 甘斌, 李松, 陈丁鹏. 网络药理学结合分子对接技术揭示桂枝芍药知母汤治疗痛风性关节炎的潜在分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 245-252.
[13]	冯冬菲, 何洪旭, 谢琪, 张立立, 周惠, 李威. 牙周重建生物功能与调节通路关键基因的筛选[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 253-259.
[14]	娜日松, 孙亮, 赵振群, 梁戎, 王鑫. miR-26b调控脂肪酸结合蛋白4介导脂肪细胞分化的分子机制[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 260-265.
[15]	曹炜, 冒符荣, 胡小华, 杨晓红. N-6甲基腺嘌呤RNA甲基化调控骨髓间充质干细胞的成骨及成脂分化[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(2): 266-270.