真皮细胞外基质水凝胶促进大鼠急性皮肤创面修复

doi:10.12307/2022.203

中国组织工程研究 ›› 2022, Vol. 26 ›› Issue (10): 1555-1560.doi: 10.12307/2022.203

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真皮细胞外基质水凝胶促进大鼠急性皮肤创面修复

董鸿斐 1，2，黄启林 2，杨熊 2，李帅 2，古瑞 2，孙红玉 2，汤礼军 1，2

1西南医科大学临床医学院，四川省泸州市 646000；2西部战区总医院全军普通外科中心，四川省胰腺损伤与修复重点实验室，四川省成都市 610083

收稿日期:2020-10-10 修回日期:2020-10-13 接受日期:2020-11-21 出版日期:2022-04-08 发布日期:2021-10-25
通讯作者: 汤礼军，博士，主任医师，西南医科大学临床医学院，四川省泸州市 646000；西部战区总医院全军普通外科中心，四川省胰腺损伤与修复重点实验室，四川省成都市 610083
作者简介:董鸿斐，男，1989年生，甘肃省天水市人，汉族，硕士，主要从事腹部外伤相关疾病的治疗与发病机制研究
基金资助:
国家临床重点专科军队建设项目(41732113)，项目负责人：汤礼军；腹部创伤分级救治及器官功能修复系列研究(2019LH04)，项目负责人：孙红玉

Dermal extracellular matrix hydrogel in promoting acute skin wound healing in rats

Dong Hongfei1, 2, Huang Qilin2, Yang Xiong2, Li Shuai2, Gu Rui2, Sun Hongyu2, Tang Lijun1, 2

1Department of School of Clinical Medicine, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; 2Department of General Surgery & Pancreatic Injury and Repair Key Laboratory of Sichuan Province, General Hospital of Western Theater Command, Chengdu 610083, Sichuan Province, China

Received:2020-10-10 Revised:2020-10-13 Accepted:2020-11-21 Online:2022-04-08 Published:2021-10-25
Contact: Tang Lijun, MD, Chief physician, Department of School of Clinical Medicine, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Department of General Surgery & Pancreatic Injury and Repair Key Laboratory of Sichuan Province, General Hospital of Western Theater Command, Chengdu 610083, Sichuan Province, China
About author:Dong Hongfei, Master, Department of School of Clinical Medicine, Southwest Medical University, Luzhou 646000, Sichuan Province, China; Department of General Surgery & Pancreatic Injury and Repair Key Laboratory of Sichuan Province, General Hospital of Western Theater Command, Chengdu 610083, Sichuan Province, China
Supported by:
the Military Construction Project for National Clinical Key Speciality, No. 41732113 (to TLJ); the Series Study on Graded Treatment of Abdominal Trauma and Organ Function Repair, No. 2019LH04 (to SHY)

摘要/Abstract

摘要： 文题释义：
真皮细胞外基质：是动物皮肤组织通过物理和化学方法方法处理去除其表皮及真皮层内细胞成分后，所保留下来的完整的细胞外基质成分，主要成分包括胶原蛋白、透明质酸、糖胺聚糖和弹性蛋白等。
温敏性可注射水凝胶：通过冻干、酶消化的方法将细胞外基质制成温度敏感性可注射水凝胶，即在室温下为液体状态，在37 ℃时可凝固为胶冻样，可用于局部组织内注射并持续发挥作用。

背景：真皮细胞外基质(dermal extracellular matrix，d-ECM)已在临床创面修复中广泛使用，但真皮细胞外基质水凝胶(dermal extracellular matrix hydrogel，d-ECMH)是否可改善急性皮肤创面愈合目前尚缺乏相关研究。
目的：探讨d-ECMH对大鼠急性皮肤创面的促愈合作用及机制。
方法：将24只SD大鼠采用随机数字表法分为模型组、d-ECM组及d-ECMH组，每组8只。所有大鼠先建立全层皮肤缺损模型，模型组与d-ECMH组在创面与创缘分别注射PBS、d-ECMH，d-ECM组创面覆盖真皮细胞外基质，观察并评估创面愈合情况。14 d时处死所有大鼠，取其创面处皮肤组织进行苏木精-伊红染色、Masson 染色、免疫组织化学染色及免疫荧光染色。实验获得西部战区总医院动物伦理委员会批准。

结果与结论：①各组大鼠创面均随治疗时间延长而缩小，d-ECMH组术后14 d的创面愈合率与创面上皮化率高于d-ECM组、模型组(P < 0.05)，创面挛缩比率低于d-ECM组、模型组(P < 0.05)；②苏木精-伊红染色显示，相比模型组与d-ECM组，d-ECMH组皮肤创面修复更好，创面再上皮化程度更高，形成了新的皮肤附属器(如毛囊)，真皮部分的基质更加整齐；③Masson染色显示，相比模型组与d-ECM组，d-ECMH组皮肤创面组织中胶原纤维明显增多且粗大；④免疫组化染色显示，d-ECMH组新生毛细血管数量多于模型组、d-ECM组(P < 0.05)，肿瘤坏死因子α与白细胞介素6含量低于模型组、d-ECM组(P < 0.05)；⑤免疫荧光染色显示，d-ECMH组新生创面内的M2型巨噬细胞数多于模型组及d-ECM组(P < 0.05)，M1型巨噬细胞数少于模型组、d-ECM组(P < 0.05)；⑥结果表明，d-ECMH可加速皮肤创面愈合，促进创面再上皮化，减轻创面挛缩，可能与促进创面内毛细血管新生与胶原纤维生成、减轻炎症、调控巨噬细胞向M2极化有关。

https://orcid.org/0000-0002-4315-8145 (董鸿斐)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 材料, 细胞外基质, 水凝胶, 创面修复, 巨噬细胞极化, 皮肤, 血管新生

Abstract: BACKGROUND: Dermal extracellular matrix (d-ECM) has been widely used in clinical wound repair, but whether dermal extracellular matrix hydrogel (d-ECMH) can improve acute skin wound healing is still a lack of relevant research.
OBJECTIVE: To explore the healing effect and mechanism of d-ECMH on acute skin wounds in rats.
METHODS: Twenty-four SD rats were divided into model group, d-ECM group and d-ECMH group by random number table method, with 8 rats in each group. Firstly, all rats established a full-thickness skin defect model, and then the model group and d-ECMH group were immediately injected with equal volumes of PBS buffer and d-ECMH on the wound respectively after the operation, and the wound surface of the d-ECM group was covered with d-ECM to observe and evaluate wound healing. All rats were sacrificed on day 14, and the skin tissues of the wounds were subjected to hematoxylin-eosin staining, Masson staining, histoimmunochemistry and fluorescence staining. The experiment was approved by Animal Ethics Committee of General Hospital of Western Theater Command.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The wound of rats in each group shrank with the prolongation of treatment time. Compared with the model group and the d-ECM group, the d-ECMH group had higher wound healing rate and wound surface skinization rate (P < 0.05), and reduced wound contracture rate (P < 0.05). (2) Hematoxylin-eosin staining showed that compared with the model group and the d-ECM group, the d-ECMH group had better skin wound repair and a higher degree of re-epithelialization of the wound, forming new skin appendages (such as hair follicles), and the matrix of dermis was more uniform. (3) Masson staining results showed that compared with the model and the d-ECM groups, the collagen fibers in the skin wound tissue were significantly increased and thicker in the d-ECMH group. (4) Immunohistochemical staining showed that the number of new capillaries in the skin wound tissue of the d-ECMH group was significantly more than that of the model group and d-ECM group (P < 0.05). The contents of tumor necrosis factor-α and interleukin-6 in wound tissues of the d-ECMH group were significantly lower than those in the model group and d-ECM group (P < 0.05). (5) Immunofluorescence staining showed that the number of M2 macrophages in the new wounds of the d-ECMH group was significantly higher than that of the model group and d-ECM group (P < 0.05), while the number of M1 macrophages was significantly lower than that of the model group and d-ECM group (P < 0.05). (6) The results show that d-ECMH can accelerate skin wound healing, promote wound re-epithelialization, and reduce wound contracture, which may be related to promote capillary angiogenesis and collagen fiber production, reduce inflammation and regulate the polarization of macrophages to M2 in the wound.

Key words: material, extracellular matrix, hydrogel, wound repair, macrophage polarization, skin, angiogenesis

中图分类号:

董鸿斐, 黄启林, 杨熊, 李帅, 古瑞, 孙红玉, 汤礼军. 真皮细胞外基质水凝胶促进大鼠急性皮肤创面修复[J]. 中国组织工程研究, 2022, 26(10): 1555-1560.

Dong Hongfei, Huang Qilin, Yang Xiong, Li Shuai, Gu Rui, Sun Hongyu, Tang Lijun. Dermal extracellular matrix hydrogel in promoting acute skin wound healing in rats[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2022, 26(10): 1555-1560.

图/表（结果） 7

2.1 实验动物数量分析 24只SD大鼠全部进入结果分析。
2.2 各组创面愈合情况各组大鼠创面均随治疗时间延长而缩小，6 d可见d-ECM组与d-ECMH组创面肉芽组织生长红润、柔软、触之易出血，无明显渗出液，而模型组肉芽组织生长较差，创面表面深浅不一，可见少量渗出液；8 d可见d-ECM组与d-ECMH组创面边缘出现明显的新生上皮，模型组创缘仅可见少量新生上皮；14 d时可见相比模型组，d-ECM组与d-ECMH组未愈合创面面积较小，上皮化范围更大，且d-ECMH组创面愈合情况及上皮化范围均优于d-ECM组，见图1。

d-ECMH组与d-ECM组治疗14 d后的创面愈合率均高于模型组[模型组(91.00±2.75)%，d-ECM组(94.41±2.76)%，
d-ECMH组(97.84±1.39)%，P < 0.05]，且d-ECMH组高于d-ECM组(P < 0.05)，见图2A。d-ECMH组与d-ECM组治疗14 d后的创面挛缩比率均低于模型组[模型组(74.87±4.18)%，d-ECM组(68.2±3.54)%，d-ECMH组(62.56±5.06)%，P < 0.05]，且
d-ECMH组低于d-ECM组(P < 0.05)，见图2B。此外发现，d-ECMH组与d-ECM组治疗14 d后的创面上皮化率显著高于模型组[模型组(16.31±5.66)%，d-ECM组(26.31±2.11)%，d-ECMH组(35.39± 5.15)%，P < 0.001]，且d-ECMH组高于d-ECM组
(P < 0.01)，见图2C。创面区域分类图见图2D。

2.3 各组大鼠皮肤组织苏木精-伊红染色相比模型组与d-ECM组，d-ECMH组皮肤创面修复更好，创面再上皮化程度更高，形成了新的皮肤附属器(如毛囊)，真皮部分的基质更加整齐，见图3。

2.4 各组大鼠皮肤组织Masson染色模型组大鼠皮肤内胶原纤维排列紊乱且较细小稀疏，而d-ECM组与d-ECMH组大鼠创面皮肤组织内胶原纤维较模型组明显增多，并且d-ECMH组创面皮肤组织内胶原纤维较d-ECM组明显增多，见图4A。
对创面组织中胶原纤维进行定量分析结果表明，d-ECM组与d-ECMH组新生组织内胶原纤维的含量均明显高于模型组[正常皮肤(59.40±4.95)%，模型组(34.35±5.12)%，d-ECM组(41.53±2.90)%，d-ECMH组(48.05±5.34)%，P < 0.05]，且d-ECMH组高于d-ECM组(P < 0.05)，见图4B。

2.5 各组大鼠皮肤组织中新生血管数量分析采用CD34标记创面皮肤组织中新生血管内皮细胞。相比正常皮肤，各组创面内新生毛细血管数均升高[正常皮肤(6.00±1.63)支/视野，模型组(18.75±3.49)支/视野，d-ECM组(33.75±5.68)支/视野，d-ECMH组(48.50±6.00)支/视野)，P < 0.01]。相比模型组，d-ECM组与d-ECMH组新生创面内均可见较多新生毛细血管(P < 0.001)，且d-ECMH组比d-ECM组有更丰富的新生毛细血管(P < 0.001)，见图5。

2.6 各组大鼠皮肤组织中白细胞介素6与肿瘤坏死因子α的表达皮肤免疫组化染色结果显示，相比正常皮肤，模型组、d-ECM组及d-ECMH组皮肤组织中白细胞介素6与肿瘤坏死因子α均处于升高水平[白细胞介素6表达情况：正常皮肤(28.75±4.30) %，模型组(120.75±12.04)%，d-ECM组(89.50±11.39)%，d-ECMH组(53.04±13.14)%；肿瘤坏死因子α表达情况：正常皮肤(25.00±4.55)%，模型组(88.50±8.23)%，d-ECM组(74.25±3.59)%，d-ECMH组(60.51±6.61)%，P 均< 0.05]。相比模型组，d-ECM组与d-ECMH组皮肤创面内白细胞介素6与肿瘤坏死因子α表达降低(P < 0.05)。此外，相比d-ECM组，d-ECMH组肤创面内白细胞介素6与肿瘤坏死因子α表达更低(P < 0.05)，见图6。

2.7 各组大鼠皮肤组织中巨噬细胞极化表型分析正常皮肤组织中M1型巨噬细胞与M2型巨噬细胞均处于较低水平[M1型巨噬细胞(11.25±1.50)个/视野，M2型巨噬细胞(13.25±1.50)个/视野]。模型组、d-ECM组及d-ECMH组创面组织内M1型巨噬细胞均高于正常皮肤[模型组(45.00±8.08)个/视野，d-ECM组(36.50±3.87)个/视野，d-ECMH组(24.25±6.13)个/视野，P < 0.05]。模型组与d-ECM组创面组织中M1型巨噬细胞数比较差异无显著性意义(P > 0.05)，d-ECMH创面组织内M1型巨噬细胞数目少于模型组、d-ECM组(P < 0.05)。模型组、d-ECM组及d-ECMH组创面组织内M2型巨噬细胞均高于正常皮肤[模型组(26.75±6.34)个/视野，d-ECM组(43.25±5.79)个/视野，d-ECMH组(66.50± 8.89)个/视野，P < 0.05]。与模型组比较，d-ECM组及d-ECMH创面组织内M2型巨噬细胞数增多(P < 0.05)，且d-ECMH组创面组织内M2型巨噬细胞较d-ECM组多(P < 0.05)，见图7。
2.8 材料生物相容性由创面愈合与组织形态观察可知，d-ECM与d-ECMH具有良好的组织相容性。

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引言

急性皮肤创伤在外科中十分常见，具有发病率高、并发症多等特点，其预后因致伤位置、深度、面积等多种因素表现不一，如今患者对创面愈合速度和质量的要求越来越高，因此亟需寻求可促进急性皮肤创面快速优质愈合的治疗策略。
细胞外基质是组织再生领域中十分具有前景的一种新型材料，是机体组织经过脱细胞化处理后残留的结构与功能性蛋白复合体，是构成细胞外微环境的基础，对细胞迁移、增殖、凋亡等生物学行为具有重要调控作用 [1-3]。真皮细胞外基质(dermal extracellular matrix，d-ECM)保留了皮肤细胞外基质的基本结构和相关功能蛋白，如胶原蛋白、糖胺聚糖、生物反应性分子和生长因子等，同时去除了可引起免疫排斥或炎症反应的常驻细胞。研究证实，真皮细胞外基质水凝胶(dermal extracellular matrix hydrogel，d-ECMH)用于多种细胞培养时均无细胞毒性[4]。此外，一项研究将d-ECM制成生物墨水与人类皮肤成纤维细胞共同培养后，发现成纤维细胞中与皮肤形态和发育有关的基因表达得到了增强[5]。目前，d-ECM作为皮肤替代物已被广泛用于临床创面修复[6-7]。
近年来，细胞外基质的应用有了新的尝试，研究表明可通过冻干、酶消化法将细胞外基质制成温敏性可注射水凝胶，用于局部组织内注射并持续发挥治疗作用[8-9]。作为具有高含水量和可控流动性的功能性聚合物材料，水凝胶在临床实践中对于某些微创手术非常有前景。已有研究表明，将细胞外基质制成温敏性可注射水凝胶后具有促进组织修复的作用[10-11]，而关于d-ECMH在急性皮肤创面治疗中的研究报道较少。
因此，实验通过在大鼠急性皮肤创面中局部注射d-ECMH以观察其疗效并初步探讨其治疗机制，以期为临床急性创面修复提供新的治疗策略。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计动物体内观察实验。
1.2 时间及地点实验于2019年10月至2020年8月在西部战区总医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 8周龄健康SPF级雄性SD大鼠24只，体质量200-220 g，购自成都达硕实验动物有限公司。动物购进后在西部战区总医院动物实验中心常规适应性饲养1周，温度为(22±2) ℃、湿度为40%-60%，12 h光/暗循环，自由进食水。动物实验获得西部战区总医院动物伦理委员会批准。
1.3.2 主要仪器与材料 d-ECM(江苏优创生物医学科技有限公司)；苏木精及伊红染液、Masson染液试剂盒、白细胞介素6抗体、肿瘤坏死因子α抗体、CD34抗体、CD68抗体、CD163抗体、诱导型一氧化氮合酶抗体(武汉赛维尔生物科技有限公司)；冷冻干燥机(北京盛超科创生物科技有限公司)；冷冻研磨机(美国SPEX SamplePrep公司)；倒置相差荧光显微镜(日本Olympus公司)；病理切片机(赛默飞世尔科技有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 d-ECMH的制备 d-ECMH的制备方法参照WOLF等[12]及吴鹏飞等[13]制备水凝胶的方法。具体方法如下：首先将d-ECM剪碎，经过冷冻干燥后，采用冷冻研磨机研成粉末；然后，将d-ECM粉末混入盐酸-胃蛋白酶原混合溶液中(盐酸浓度0.01 mol/L，胃蛋白酶原质量浓度1 g/L，d-ECM质量浓度10 g/L)，室温搅拌消化72 h，滤网过滤消化后的混悬液，得到d-ECMH前体溶液；最后，在d-ECMH前体溶液中加入NaOH(0.1 mol/L)溶液，调整pH值至7.4，使胃蛋白酶失活，再加入10×PBS溶液将渗透压调整至同1×PBS溶液。经验证得到的d-ECMH在常温下为液态，在37 ℃环境中约30 min可变成凝胶状。
1.4.2 大鼠急性皮肤创面模型的建立及分组大鼠急性皮肤创面模型参考赵京禹等[14]的建模方法。将24只SD大鼠采用随机数字表法分为模型组、d-ECM组、d-ECMH组，每组8只。各组分笼饲养，大鼠于造模前禁食12 h，自由饮水。大鼠经异氟烷麻醉后，背部剃毛，采用直径为16 mm圆形图章标记切除皮肤范围，消毒后用无菌手术刀沿圆形标记切除全层皮肤，创缘深至深筋膜。模型组于建模后在创面及创缘处裸露组织内注射0.4 mL 1×PBS缓冲液，d-ECM组使用d-ECM覆盖创面，d-ECMH组在创面及创缘处裸露组织内注射0.4 mL d-ECMH，然后均以无菌敷料覆盖创面并固定，每2 d更换创面敷料。
1.4.3 创面愈合的宏观评估创面形成即刻及治疗后 2，4，6，8，10，12，14 d，观察并记录各组大鼠创面愈合情况，采用Image J软件分析计算各时间节点创面愈合率，计算14 d时创面上皮化率及创面挛缩率。创面愈合率=(1-未愈合创面面积/原始创面面积)×100%，创面上皮化率=(上皮化创面面积/原始创面面积)×100%，创面挛缩率=(原始创面面积-上皮化创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积×100%。
1.4.4 创面组织形态观察治疗14 d后分别切取3组创面及创缘全层皮肤组织，并于大鼠背部创面相对应位置切取正常全层皮肤组织，40 g/L多聚甲醛固定24 h后，然后依次进行脱水、石蜡包埋及切片(4 μm)，最后采用苏木精-伊红染液进行染色。Masson染色观察创面组织中胶原纤维沉积情况。
1.4.5 免疫组化观察采用免疫组织化学方法检测新生创面组织内肿瘤坏死因子α、白细胞介素6及CD34的表达，CD34标记并观察大鼠创面内新生血管数量，肿瘤坏死因子α与白细胞介素6观察大鼠创面炎症情况。根据标准步骤对包埋的新生创面组织进行切片、脱蜡复水、抗原修复，加血清进行封闭，然后滴加兔抗大鼠肿瘤坏死因子α(1∶200)、白细胞介素6(1∶500)及CD34抗体(1∶2 000)一抗，4 ℃下孵育过夜；次日用PBS冲洗后滴加二抗，37 ℃下孵育30 min后复染封固。
1.4.6 免疫荧光染色采用免疫荧光染色方法检测新生创面组织内CD68抗体、CD163抗体、诱导型一氧化氮合酶抗体的表达，CD68+(红)诱导型一氧化氮合酶+(绿)标记M1型巨噬细胞，CD68+(红)CD163+(绿)标记M2型巨噬细胞。根据标准步骤对包埋的新生创面组织进行切片、脱蜡复水、抗原修复与封闭，然后滴加兔抗大鼠CD68抗体(1∶100)一抗，4 ℃下孵育过夜；PBS洗3次后，滴加相应二抗避光室温孵育60 min；PBS洗涤后在切片上滴加兔抗大鼠CD163(1∶100)或诱导型一氧化氮合酶(1∶200)一抗，4 ℃下孵育过夜，PBS洗3次后滴加二抗，避光室温孵育60 min；DAPI复染细胞核10 min，冲洗切片后加入自发荧光淬灭剂5 min，冲洗待切片稍干后用抗荧光淬灭封固剂封固。荧光显微镜下观察各组皮肤创面组织中巨噬细胞极化表型情况。
1.5 主要观察指标各组大鼠创面愈合与巨噬细胞极化情况。
1.6 统计学分析采用Graphpad prism8进行绘图与统计分析，实验结果用x±s表示，采用t检验进行两组间的比较，3个及以上组间比较采用单因素方差分析。率的比较使用卡方检验。P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

急性皮肤创伤修复是炎症细胞、修复细胞、细胞外基质及多重细胞因子共同参与并互相协同完成的复杂性生理过程，细胞外基质在皮肤创伤愈合过程中具有重要作用[15]。d-ECM支架材料已被大量应用于各种皮肤软组织损伤的临床治疗，并取得良好的治疗效果[16-17]。近年来，研究者将细胞外基质制备成可注射的水凝胶局部注射于受损组织，发现其可促进受损骨骼、心肌等的修复[12，18-19]。此次实验发现，d-ECMH通过加速皮肤创面愈合、促进创面再上皮化与减轻创面挛缩来提高创面愈合质量，其机制可能与促进创面内毛细血管新生与胶原纤维生成、减轻炎症、调控巨噬细胞向M2极化有关。
研究表明，细胞外基质可为创面愈合提供一个有利的微环境，促进创面再上皮化和血管新生[20]。创面苏木精-伊红染色与Masson染色结果表明，d-ECMH可促进创面愈合，并促进创面皮肤表皮层生长发育。d-ECMH对急性皮肤创面修复具有促进作用，但在创面愈合的不同阶段作用方式不同，在创面愈合早期(1-4 d )，d-ECMH具有促进创面收缩的作用；在创面愈合后期(10-14 d)，d-ECMH具有明显促进创面再上皮化的作用；而在创面愈合中期，可观察到d-ECMH组创面愈合速率略有所下降，引起创面愈合速率下降的原因可能为：愈合中期d-ECMH组创面内形成更多胶原纤维及毛细血管，导致创面闭合速率下降，但同时也有助于后期创面再上皮化与减轻创面挛缩。BONDIOLI等[21] 将d-ECM用于全厚皮肤伤口治疗，发现其可改善伤口愈合并减少源自挛缩和瘢痕组织形成的不良反应，这与此次实验观察结果一致。
研究表明，在皮肤附属器中唯有毛囊可循环再生修复，而皮脂腺、汗腺和神经等均不能再生 [22]。杜烨等[23]研究发现，真皮脱细胞基质在创面修复中可促进创面毛囊再生。研究表明，毛囊再生可作为皮肤创面再生修复质量的重要评估指标[24]。此次实验发现，d-ECMH组治疗14 d后的新生创面组织内可观察到新生毛囊，证明d-ECMH具有良好的促进皮肤创面再生修复作用。同时，皮肤创面中晚期严重炎症反应不利于创面愈合[20]。此次实验发现相比模型组与d-ECM组，d-ECMH组创面组织内肿瘤坏死因子α与白细胞介素6含量更低，证明d-ECMH相比d-ECM可显著减轻创面组织炎症反应，进而更有利于创面修复。
大量研究表明，细胞外基质水凝胶还具有一定的免疫调节作用。HONG等[25]在猪脑细胞外基质水凝胶治疗大鼠脊髓损伤中发现，损伤脊髓中M1与M2巨噬细胞的比例发生了显著变化，猪脑细胞外基质水凝胶可调控受损区域内巨噬细胞极化方向，促进巨噬细胞向M2极化，从而促进脊髓中神经元突起的生长发育。HE等[26]在真皮脱细胞支架用于全层皮肤创面的治疗中发现，真皮脱细胞支架可通过诱导巨噬细胞M2极化从而产生利于创面再生修复的微环境。此次实验观察到模型组皮肤创面组织内M1型巨噬细胞较多，而d-ECMH组皮肤创面组织内M1型巨噬细胞数显著减少、M2型巨噬细胞数显著增加，初步表明d-ECMH可通过促进皮肤创面内巨噬细胞由M1向M2极化，进而减轻创面炎症反应，促进创面愈合。
细胞外基质水凝胶具有温敏性液态-固态转化特性，使其在组织再生领域备受关注。固态细胞外基质水凝胶可用于组织细胞3D培养，JIANG等[27]在胰岛的3D培养中发现，细胞外基质水凝胶有助于胰岛细胞的增殖与分化。液态细胞外基质水凝胶具有良好的可注射性，可通过微创介入的方法将细胞外基质水凝胶递送至损伤部位，并在体内形成凝胶状态，从而发挥治疗作用[28]。目前的研究证实，细胞外基质水凝胶可作为细胞移植的良好运载体，通过局部注射的方法将“种子细胞”移植到损伤部位，并为“种子细胞”提供良好的微环境，促进“种子细胞”的增殖与分化。LEE等[29]将肝脏脱细胞外基质制备成水凝胶，并将携带肝细胞的细胞外基质水凝胶移植到裸鼠皮下，发现细胞外基质水凝胶可促进肝细胞成活与改善肝细胞功能。此次实验制备的d-ECMH具有良好的可注射性，新生创面组织内未观察到明显的免疫排异反应，d-ECMH良好的组织相容性为后续创面修复细胞移植治疗提供有效的移植策略。综上所述，d-ECMH在急性皮肤创面修复中具有促愈合作用，提示其有望成为皮肤创伤一种新的治疗策略。d-ECMH在促进创面愈合中减轻创面炎症反应与调控巨噬细胞极化的作用机制尚不清楚，还有待深入研究，一方面需要进一步阐明水凝胶促进创面愈合的机制，另一方面需要在d-ECMH基础上探索构建组织工程皮肤。中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

真皮细胞外基质水凝胶促进大鼠急性皮肤创面修复

Dermal extracellular matrix hydrogel in promoting acute skin wound healing in rats

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