两种离心程序制备的富血小板纤维蛋白结构分析

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3189

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (22): 3534-3539.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3189

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两种离心程序制备的富血小板纤维蛋白结构分析

毕庆伟1，刘承璞1，李岩1，赵雯雯1，韩梅2

1黑龙江省口腔病防治院，黑龙江省哈尔滨市 150001；2黑龙江省护理高等专科学校，黑龙江省哈尔滨市 150002

收稿日期:2020-07-23 修回日期:2020-07-25 接受日期:2020-09-15 出版日期:2021-08-08 发布日期:2021-01-20
通讯作者: 李岩，主任医师，黑龙江省口腔病防治院，黑龙江省哈尔滨市 150001
作者简介:毕庆伟，男，1982年生，黑龙江省哈尔滨市人，汉族，硕士，副主任医师，主要从事口腔种植的临床及基础研究。
基金资助:
黑龙江省卫健委科研课题(2017552)，项目负责人：毕庆伟；黑龙江省卫健委科研课题(2018033)，项目负责人：赵雯雯

Structure analysis of platelet-rich fibrin derived from two centrifugation procedures

Bi Qingwei1, Liu Chengpu1, Li Yan1, Zhao Wenwen1, Han Mei2

1Heilongjiang Stomatological Disease Center, Harbin 150001, Heilongjiang Province, China; 2Heilongjiang Nursing College, Harbin 150002, Heilongjiang Province, China

Received:2020-07-23 Revised:2020-07-25 Accepted:2020-09-15 Online:2021-08-08 Published:2021-01-20
Contact: Li Yan, Chief Physician, Heilongjiang Stomatological Disease Center, Harbin 150001, Heilongjiang Province, China
About author:Bi Qingwei, Master, Associate chief physician, Heilongjiang Stomatological Disease Center, Harbin 150001, Heilongjiang Province, China
Supported by:
Scientific research project of Heilongjiang Health Commission, No. 2017552 (to BQW); the Scientific Research Project of Heilongjiang Health Commission, No. 2018033 (to ZWW)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
改良的富血小板纤维蛋白：富血小板纤维蛋白首先由法国CHOUKROUN教授等在2000年提出，其含有血液的主要成分，含有约97%的血小板和大于50%的白细胞，并集中在由纤维蛋白组成的一个特定的三维分布中。2014年GHANAATI等进行程序改良制造出新的富血小板纤维蛋白，在结构上有别于传统富血小板纤维蛋白。
富血小板纤维蛋白离心制造机：专门用于离心富血小板纤维蛋白的机器，离心力和离心速度的不同导致制备富血小板纤维蛋白的结构也不相同，专业的离心机是经过研究开发而出，研究结果可信度高。

背景：富血小板纤维蛋白因其特性已在临床中广泛应用，但不同离心程序制造出的纤维蛋白结构及成分会有不同，进而影响临床效果。
目的：比较两种特定离心程序制备的富血小板纤维蛋白的组织特点。
方法：采集40例自愿捐献者的静脉血，随机分2组，每组20例，一组通过低速离心(1 500 r/min离心14 min)程序获得改良富血小板纤维蛋白，另一组通过中速离心(3 000 r/min离心10 min)程序获得传统白细胞富血小板纤维蛋白。通过苏木精-伊红染色、免疫组化技术、扫描电镜及透射电镜观察两组纤维蛋白中的白细胞、纤维蛋白基质分布情况及差异。
结果与结论：①苏木精-伊红染色：两组纤维蛋白均含有较多白细胞，多集中在中间层并偏向于红细胞端层，凝胶层大部分为纤维蛋白基质，其中改良富血小板纤维蛋白中的白细胞在凝胶层有一些散在均匀分布；②免疫组化：两组纤维蛋白在中间层区域含有大量白细胞，包括单核细胞和中性粒细胞，改良富血小板纤维蛋白中的中性粒细胞比例大于白细胞富血小板纤维蛋白(P﹤0.05)，两组单核细胞比例比较差异无显著性意义(P > 0.05)；③扫描电镜：两组纤维蛋白的白细胞分布广泛，其中改良富血小板纤维蛋白中纤维蛋白基质空间内白细胞和血小板数量稍多，纤维基质条索排列略紧密；④透射电镜：两组纤维蛋白中间层聚集较多的中性粒细胞、单核细胞，血小板密集并含量较多，纤维蛋白基质排列致密，其中改良富血小板纤维蛋白中的纤维基质排列略密集，白细胞含量及血小板稍多；⑤结果表明：因含有的白细胞数量差别，改良富血小板纤维蛋白可能比白细胞富血小板纤维蛋白在促进组织愈合中发挥更积极的作用。
https://orcid.org/0000-0001-5501-650X (毕庆伟)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 材料, 富血小板纤维蛋白, 改良, 离心, 组织工程, 炎症, 中性粒细胞, 单核细胞, 血小板

Abstract: BACKGROUND: Platelet-rich fibrin has been widely used in clinic because of its characteristics, but the structure and composition of fibrin produced by different centrifugation procedures will be different, which will affect the clinical effect.
OBJECTIVE: To compare the histological characteristics of platelet-rich fibrin prepared by the different centrifugation procedures.
METHODS: Venous blood samples from 40 voluntary patients were divided into two groups (n=20). In group A, modified platelet-rich fibrin was obtained by low-speed centrifugation (1 500 r/min centrifugation for 14 minutes). In group B, traditional platelet-rich fibrin was obtained by medium-speed centrifugation
(3 000 r/min for 10 minutes). Hematoxylin-eosin staining, immunohistochemistry, scanning electron microscopy, and transmission electron microscope were used to analyze the difference of leukocytes and fibrin matrix in two groups of platelet-rich fibrin.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Hematoxylin-eosin staining: Both groups contained more leucocytes, mostly concentrated in the middle layer and biased towards the end layer of erythrocytes. Gel layer was mainly composed of fibrin matrix, and the leucocytes were coagulated in the advanced platelet-rich fibrin. The glue layer was scattered and evenly distributed. (2) Immunohistochemistry: The two groups contained a large number of leucocytes in the middle layer, including monocytes and neutrophils. The proportion of neutrophils in the modified platelet-rich fibrin was greater than that of the leukocyte-rich platelet fibers (P < 0.05). There was no significant difference in the ratio of monocytes between the two groups (P > 0.05). (3) Scanning electron microscopy: The leucocytes of the two groups were distributed slightly widely. The numbers of leucocytes and platelet in the advanced platelet-rich fibrin were slightly higher than those in leucocyte- and platelet-rich fibrin. The fiber matrix cords were slightly tightly arranged in the modified platelet-rich fibrin. (4) Transmission electron microscopy: The two groups of intermediate layers gathered a large number of platelets and many neutrophils and monocytes. The protein matrix was densely arranged, among which the fiber matrix in the modified platelet-rich fibrin was slightly denser than that in leucocyte- and platelet-rich fibrin. (5) The results showed that the modified platelet-rich fibrin may be better than leucocyte- and platelet-rich fibrin due to the difference in the number of leucocytes. The advanced platelet-rich fibrin may play a more active role in promoting tissue healing.

Key words: materials, platelet-rich fibrin, improvement, centrifugation, tissue engineering, inflammation, neutrophils, monocytes, platelets

中图分类号:

毕庆伟, 刘承璞, 李岩, 赵雯雯, 韩梅. 两种离心程序制备的富血小板纤维蛋白结构分析[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3534-3539.

Bi Qingwei, Liu Chengpu, Li Yan, Zhao Wenwen, Han Mei. Structure analysis of platelet-rich fibrin derived from two centrifugation procedures[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(22): 3534-3539.

图/表（结果） 5

2.1 两种纤维蛋白的大体形态离心后，离心管上部分凝胶为富血小板纤维蛋白。将A-PRF和L-PRF凝胶分为3部分，包括：黄色部分为纤维蛋白凝胶，占据富血小板纤维蛋白大部分空间(凝胶层)；血凝块集中区为红细胞接触部分，即红细胞沉积层(红细胞端层)；中间部分为凝胶层与红细胞沉积层两者之间的部分(中间层)，见图1；制作完成的2种富血小板纤维蛋白凝胶颜色、形态接近。

2.2 两种纤维蛋白苏木精-伊红染色结果光学显微镜下可以观察到，A-PRF和L-PRF均含有较多白细胞，多集中在中间层并偏向于红细胞端层，凝胶层大部分为纤维蛋白基质；A-PRF中的白细胞在凝胶层有一些散在均匀分布，L-PRF中的白细胞在凝胶层散在分布较少(图2)。

2.3 两种纤维蛋白免疫组化染色结果免疫组化染色结果显示，两种纤维蛋白在中间层区域含有大量白细胞，包括单核细胞(CD68阳性细胞)和中性粒细胞(CD15阳性细胞)，其中A-PRF含有的中性粒细胞分布更广泛、数量更多；L-PRF在中间层含有中性粒细胞数量较多，在凝胶层较少；二者含有的单核细胞数量无明显差别，分布主要集中在中间层，见图3。

显微镜下随机选择中间层近凝胶层3个视野，按照百分比例分配原则，取3次计数平均数计入结果，A-PRF组、L-PRF组中性粒细胞(CD15阳性细胞)占的比例分别为(55.30±12.15)%和(34.30±11.55)%，两组比较差异有显著性意义(P < 0.05)；A-PRF组、L-PRF组单核细胞(CD68阳性细胞)占的比例分别为(29.20±8.15)%和(26.50±8.72)%，两组比较差异无显著性意义 (P > 0.05)。
2.4 两种纤维蛋白扫描电镜观察结果扫描电镜下观察可见，两种纤维蛋白中间层均含有大量成簇白细胞，白细胞集中区域表面纤维蛋白较少，白细胞数量向凝胶层方向开始减少，纤维蛋白基质呈网格状立体交错排列，并包裹白细胞和血小板；其中A-PRF纤维蛋白基质交错略显紧密，纤维略细，凝胶层中白细胞数量多于L-PRF，呈散在排列，并且血小板活化程度高于L-PRF，见图4。

2.5 两种纤维蛋白透射电镜观察结果透射电镜下可见，两种纤维蛋白中均可观察到单核细胞、中性粒细胞，A-PRF交界处细胞及种类含量比L-PRF多，并且A-PRF凝胶层中的纤维蛋白基质略显紧密；两组中间层白细胞种类较多，中性粒细胞和单核细胞在不同位置聚集，见图5。
2.6 生物相容性实验制备的两种纤维蛋白来自于人体，具有良好的生物相容性。

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引言

富血小板纤维蛋白是在富血小板血浆研究基础上衍化出来的自体生物材料。第一代浓缩富血小板血浆在医学各种领域获得应用共识并被广泛使用，但在制备中因含有抗凝剂，从而会阻止伤口正常愈合及带来潜在风险[1-3]，为临床使用带来不便。因此，衍生的富血小板纤维蛋白在制备过程中不使用抗凝剂，由于其白细胞含量较高，也被命名为白细胞富血小板纤维蛋白(leukocyte-platelet-rich fibrin，L-PRF)。富血小板纤维蛋白具有三维纤维蛋白基质结构，可以在引导性骨再生和引导性组织再生程序中发挥功能[4-6]。富血小板纤维蛋白能够集合自体血液中的白细胞、血小板和纤维蛋白基质分子，借助纤维蛋白立体结构可以缓慢释放生长因子等[7]，被认为是参与组织愈合过程中安全、有效的生物材料。富血小板纤维蛋白经常在口腔颌面外科手术中用作外科辅助剂，以改善愈合并促进组织再生[8-9]。由于富血小板纤维蛋白具有调节血管反应的潜在能力[10]，并可通过促进早期血管形成和组织生长来加速伤口愈合[11]，因此在口腔医学领域得到了广泛的应用，包括牙周再生[12-13]、牙根覆盖[11]、牙槽嵴保存和上颌窦提升等[14-15]。
但是，在白细胞成分及生长因子种类等研究方面富血小板纤维蛋白仍有很多未知的研究区域。国内外有些研究表明，不同的离心方式会对富血小板纤维蛋白的生物学特性产生影响，低速度离心方式可获得较大的细胞含量[7，16]。实验采用中速、低速两种离心方式进行收集，对制备完成的富血小板纤维蛋白标本进行组织学及电镜观察分析，评价两种离心程序下制备完成的富血小板纤维蛋白的结构及生物学特性，遴选优化的富血小板纤维蛋白制备方法，为临床应用富血小板纤维蛋白提供数据支持。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计组织学对比观察实验。
1.2 时间及地点实验于2016年3月至2017年8月在黑龙江省口腔病防治院和哈尔滨医科大学、哈尔滨工业大学完成。
1.3 材料
1.3.1 血液样本采集40例就诊患者静脉血，其中男23例，女性17例；年龄20-62岁，平均(45.8±12.2)岁。按照随机对照原则将40例患者分为2组，每组20例，一组通过低速离心程序制备改良富血小板纤维蛋白(advanced-platelet-rich fibrin，A-PRF)，另一组通过中速离心程序制备L-PRF。实验经黑龙江省口腔病防治院伦理委员会审查批准，所有研究对象均知晓研究目的并签署知情同意书。
纳入标准：血常规指标正常且3个月内未曾服用过影响白细胞和血小板的相关药物，无全身系统性疾病等的患者。
排除标准：离心后未形成完整富血小板纤维蛋白凝胶块，无法进行压膜成形者。
1.3.2 实验用器材与主要试剂富血小板纤维蛋白离心制造机(PROCESS PC-02型，Nice，法国)；扫描电子显微镜(S-3400N型，日立，日本)；透射电子显微镜(H-7650，日立，日本)；病理切片机(RM2235，德国徕卡)；倒置显微镜(NIKON CI-S，日本尼康)；鼠抗人CD15单克隆抗体(货号BA0221，博士德生物工程有限公司)；鼠抗人CD68单克隆抗体(货号BA3639，博士德生物工程有限公司)；DAB显色剂、PBS(北京中科万邦生物科技有限公司)。
1.4 实验方法
1.4.1 富血小板纤维蛋白的提取每例患者分别采集2管外周静脉血共20 mL，按照随机分组原则立即放入预先设定好程序的离心机中离心，离心后凝胶块去掉红色血块部分后仔细从试管中取出(不破坏红色血块与纤维蛋白接触部分)，压膜工具盒制成片状标本，随后分别被固定在体积分数4%甲醛溶液中(苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色备用)和2.5%戊二醛溶液中(扫描电子显微镜、透射电子显微镜备用)24 h，再分别进行包埋。富血小板纤维蛋白离心制造机离心程序参照文献[17-18]，A-PRF组离心程序：1 500 r/min离心14 min；L-PRF组离心程序：3 000 r/min离心10 min。
1.4.2 苏木精-伊红及免疫组化染色将A-PRF和L-PRF标本按照固定、脱水透明、石蜡包埋、切片等步骤制作成5 μm组织切片，进行常规苏木精-伊红染色。组织切片经过二甲苯、梯度乙醇脱水、PBS冲洗、一抗4 ℃过夜、二抗37 ℃
30 min、DAB显色、苏木精复染、脱水、透明、封固等步骤进行免疫组化染色(检测CD15抗体和CD68抗体)，光学显微镜观察、采集图像。
1.4.3 扫描电镜观察将A-PRF和L-PRF标本分别固定于2.5%戊二醛溶液中24 h(4 ℃)；0.1 mol/L的PBS(pH=7.2)漂洗组织3次，每次10 min；1%饿酸固定2 h；0.1 mol/L的PBS(pH=7.2)将固定的标本漂洗3次，每次10 min；乙醇梯度脱水，乙酸异戊酯置换20 min；CO2临界点干燥40 min，喷镀金属膜，扫描电镜下观察并采集图像。
1.4.4 透射电镜观察将A-PRF和L-PRF标本分别加入2.5%戊二醛溶液4 ℃过夜；0.1 mol/L的PBS(pH=7.2)漂洗，用1%饿酸固定1 h，蒸馏水4 ℃漂洗10 min；乙醇梯度脱水，环氧丙烷梯度脱水，重复2次，40 ℃10 min；1∶1环氧丙烷和EPON包理液的混合液浸透标本2 h后加入包理液浸透，标本挑入胶囊中放入烤箱(600 ℃，24 h)；超薄切片机切片，厚度500 nm；醋酸铀染液染10 min，铅染液染8 min，透射电镜下观察并采集图像。
1.5 主要观察指标 A-PRF和L-PRF中白细胞成分及分布、血小板活性、纤维蛋白基质类型。
1.6 统计学分析应用SPSS 19.0统计软件进行统计，计量资料采用x±s表示，组间差异应用t检验进行比较，以P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

富血小板纤维蛋白首先由法国CHOUKROUN教授等[19]研制出，富血小板纤维蛋白是一种自体纤维蛋白基质，含有的血小板和白细胞等成分集中在由纤维蛋白组成的一个的三维结构中。富血小板纤维蛋白是经由静脉全血离心浓缩而产生的，在提取过程中没有人为添加外源性生物药剂，因此最终制备品避免了潜在传染病风险等缺点，在临床中富血小板纤维蛋白的应用非常广泛 [20]。与富血小板血浆相比，A-PRF含有更高水平的血小板和血小板衍生生长因子，在细胞增殖实验中A-PRF显著刺激了骨膜细胞的增殖[21]。富血小板纤维蛋白被激活后释放出多种因子，包括转化生长因子β、血小板衍化生长因子、白细胞介素6、肿瘤坏死因子α和血管内生长因子等，释放出的部分因子在骨再生过程中发挥潜在的重要作用，如抗感染、促进愈合、抑制疼痛等作用[22-24]。基于这种情况，深入研究发现富血小板纤维蛋白可以体外诱导人骨髓间充质干细胞的增殖和分化[25] 。王灿莉等[16]研究结果提示，A-PRF促进成纤维细胞的增殖活性优于传统富血小板纤维蛋白。富血小板纤维蛋白与间充质干细胞混合物还对下颌骨重建发挥成骨作用[26]，同时富血小板纤维蛋白和替考拉宁、丁胺卡那霉素或聚盐酸己双胍溶液联合可以起到抑菌作用[27]。研究发现，富血小板纤维蛋白可预防口服双膦酸盐患者的颌骨骨坏死风险[28]。另有研究提示，骨形态发生蛋白2联合富血小板纤维蛋白在治疗药物相关性颌骨骨坏死方面会起到很好的治疗作用，部分患者病变能够完全消退[29]。近些年的临床研究发现，口腔黏膜的病变(例如白斑和扁平苔藓)切除后局部使用富血小板纤维蛋白膜也能够促进伤口愈合[30]，富血小板纤维蛋白还可以重建退缩的牙龈，同时能够降低术后不适[31]。这些研究结果均提示，富血小板纤维蛋白具有促进成骨和抑菌的潜在能力，以及在伤口愈合中具有积极作用。在口腔颌面外科学[32-33]、运动医学、骨科学和皮肤科学研究中对富血小板纤维蛋白都提出了有意义的结果[34-36]。虽然富血小板纤维蛋白的应用范围越来越广，但对富血小板纤维蛋白生物学结构的统一表述较少，而制备富血小板纤维蛋白的离心程序正是对其生物学结构产生影响的关键。离心程序中的离心速度及离心力、离心时间会影响富血小板纤维蛋白生物学结构，导致最终的富血小板纤维蛋白组织学特征也不尽相同[37]，目前制备富血小板纤维蛋白常用的离心程序包括：3 000 r/min离心10 min [18]、2 500 r/min离心10 min [38]、2 700 r/min离心12 min和1 500 r/min离心14 min等[17]。研究发现，离心力大、离心时间长，在制备过程中可能会有大量的血小板成分遭到破坏和白细胞成分的丢失等，离心方式显著影响富血小板纤维蛋白内部细胞、生长因子和纤维蛋白结构[39]。进一步的研究提出，低速离心程序制备的富血小板纤维蛋白有利于生长因子释放，通过增加成纤维细胞迁移、增殖和改变胶原mRNA水平而影响组织再生[40]。随着离心力的降低，富血小板纤维蛋白内部纤维蛋白支架间的白细胞数量增加，因此较低离心速度的使用导致白细胞和细胞因子被更多保留下来，并使它们在纤维蛋白凝块中更好地分布[41]。故实验选择以较低离心速度为研究重点的方法进行富血小板纤维蛋白凝胶的制备，比较较低离心转速条件与中等离心转速条件下制备的富血小板纤维蛋白在组织学上的差别，探讨制备富血小板纤维蛋白较为合适的离心程序，为临床选择富血小板纤维蛋白提供数据支持。
此次实验结果显示，使用不同的离心程序制备的富血小板纤维蛋白大体标本外观相似，均可分为3部分(红细胞端层、中间层、凝胶层)。苏木精-伊红染色结果显示，两组标本均含有大量的白细胞，白细胞集中于近红细胞端的中间层，凝胶层主要为纤维蛋白，红细胞端层主要为红细胞；A-PRF组中白细胞在中间层集中并向凝胶层有散在均匀分布，L-PRF组中这种向凝胶层散在分布情况较少见，其白细胞主要集中在中间层，这种观察结果表明A-PRF组中白细胞占据范围略广，提示其发挥抗炎等作用范围相对更广泛。免疫组织化学染色结果显示，两组标本含有较多中性粒细胞和单核细胞，以及大量的纤维蛋白基质， A-PRF组比L-PRF组的中性粒细胞含量丰富，分析其结果也具有统计学意义，单核细胞之间无明显差异，这种结果提示在抗炎症和抗感染等方面A-PRF比L-PRF可能会发挥更大的作用。扫描电镜观察结果显示，A-PRF和L-PRF均具有高密度的纤维蛋白网状立体结构，研究结果也与DOHAN EHRENFEST等[42] 报道相似，这是否因为离心力不同所导致尚不得而知，但是富血小板纤维蛋白这种致密结构对缓慢释放内部成分方面应该会有积极作用。实验还发现A-PRF纤维蛋白基质条索略细，网状结构相对要比L-PRF略紧密，与DOHAN EHRENFEST等[42]研究发现略有差别，观察这种结构紧密差别之间并不明显，分析可能在压膜成型时间存在误差导致或者可能相互之间在致密度方面略存在差别，对此结果尚待进一步观察。两组在中间层部分区域含有的白细胞较多，因此该区域纤维基质网状结构略少，细胞释放量也就相对较多，发挥抗炎等作用会更明显。扫描电镜观察两组中均存在血小板现象，血小板的活化可以在生长因子的释放方面也发挥重要的积极作用，并在局部促进凝血的作用也会更突出。因此，作者考虑这种纤维蛋白立体结构及血小板活化可能在缓慢释放白细胞和生长因子方面也会起到很好的作用。DOHAN EHRENFEST等[43]研究发现，L-PRF膜可以连续地释放大量生长因子，并在膜里产生较多的白细胞群，这也与此次实验的观点比较相近。实验透射电镜观察结果显示，纤维蛋白中间层和凝胶层交界处纤维蛋白基质状态同扫描电镜描述接近，在不同的观察视野内也发现了不同的细胞，包括中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等，进一步验证了以上的研究内容。
综上所述，富血小板纤维蛋白的内部结构和成分会受离心程序的影响，因此富血小板纤维蛋白中的成分和其缓慢释放特性对组织愈合也会产生不同的影响。此次实验发现，因含有的白细胞数量和血小板活化程度存在差别，A-PRF比L-PRF会发挥更多的积极作用，但是由于实验非同一个体自身的对比，而且存在样本量有限、样本染色差异及在样本制备过程中存在样本大小和凝胶液渗出量的差别等不足，研究结果还需要进一步研究验证。对于后续的研究尚需在血小板活化状态及透射电镜观察不同深度中细胞的种类方面进行更深入的探索，因此A-PRF在临床中的应用机制还有待于进一步观察。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

两种离心程序制备的富血小板纤维蛋白结构分析

Structure analysis of platelet-rich fibrin derived from two centrifugation procedures

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