脂肪血管基质成分复合骨软骨一体化支架的体外评价

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3230

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (22): 3487-3492.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3230

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脂肪血管基质成分复合骨软骨一体化支架的体外评价

陈磊，郑蕊，杰永生，綦惠，孙磊，舒雄

北京积水潭医院/北京市创伤骨科研究所，北京市 100035

收稿日期:2020-08-17 修回日期:2020-08-21 接受日期:2020-10-09 出版日期:2021-08-08 发布日期:2021-01-19
通讯作者: 舒雄，助理研究员，北京积水潭医院/北京市创伤骨科研究所，北京市 100035
作者简介:陈磊，男，1979年生，北京市人，汉族，主管技师，主要从事组织修复材料方面的研究。
基金资助:
北京市属医学科研院所科技发展项目(PXM2018_026275_000004)，项目参与者：陈磊；北京市属医学科研院所公益发展改革试点项目(BMHC2018-4，BMHC2019-9)，项目参与者：陈磊

In vitro evaluation of adipose-derived stromal vascular fraction combined with osteochondral integrated scaffold

Chen Lei, Zheng Rui, Jie Yongsheng, Qi Hui, Sun Lei, Shu Xiong

Beijing Jishuitan Hospital, Beijing Institute of Traumatology and Orthopaedics, Beijing 100035, China

Received:2020-08-17 Revised:2020-08-21 Accepted:2020-10-09 Online:2021-08-08 Published:2021-01-19
Contact: Shu Xiong, Assistant Researcher, Beijing Jishuitan Hospital, Beijing Institute of Traumatology and Orthopaedics, Beijing 100035, China
About author:Chen Lei, Technician-in-charge, Beijing Jishuitan Hospital, Beijing Institute of Traumatology and Orthopaedics, Beijing 100035, China
Supported by:
the Science and Technology Development Project of Beijing Municipal Medical Research Institute, No. PXM2018_026275_000004 (to CL); the Public Welfare Development and Reform Pilot Project of Beijing Municipal Medical Research Institutes, No. BMHC2018-4, BMHC2019-9 (to CL)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
脂肪来源的血管基质成分：指脂肪组织去除成熟脂肪细胞后所获得的具有干细胞特性的基质细胞，是一组混合细胞群体。基质血管组分包括脂肪前体细胞、间充质干细胞、造血干(祖)细胞、内皮祖细胞、淋巴细胞(包括调节性T细胞)和巨噬细胞等。
骨软骨一体化支架：基于骨软骨界面处的天然分层组织结构、矿物质分布、结构-功能关系，采用真皮细胞外基质和磷酸三钙颗粒开发新型含有稳定界面的双相层状支架，充分模拟骨软骨界面组织的特性。

背景：大量的动物和临床实验已证实，脂肪来源的血管基质成分局部移植可促进关节软骨修复。
目的：探讨脱细胞真皮基质/生物矿化胶原一体化骨软骨支架复合脂肪来源血管基质成分构建组织工程软骨的可行性。
方法：无菌条件下取出雌兔双侧腹股沟脂肪垫，利用酶消法获得血管基质组分，采用流式细胞仪检测其表面特异性蛋白，观察其成脂、成骨与成软骨分化能力。将脂肪来源血管基质成分(实验组)、含转化生长因子β3的脂肪间充质干细胞(软骨诱导组)、含体积分数10%胎牛血清的脂肪间充质干细胞(对照组)分别接种于脱细胞真皮基质/生物矿化胶原一体化支架上共培养，CCK8法检测细胞增殖，荧光显微镜下观察细胞数量，实时定量PCR检测软骨相关基因表达，二甲基亚甲基蓝比色法测定胞外基质中糖胺多糖含量。
结果与结论：①流式细胞仪检测结果显示，脂肪来源血管基质成分高表达CD44、CD105与CD90，低表达CD14、CD19与CD45，脂肪来源血管基质成分具有向脂肪细胞、成骨细胞与软骨细胞分化的能力；②CCK8检测显示，随着培养时间的延长，脱细胞真皮基质/生物矿化胶原一体化支架上的3种细胞数量增加，其中实验组细胞数量高于其他两组(P < 0.05)；培养7 d荧光显微镜下观察可见，实验组中的细胞数量多于其他两组；③培养21 d的实时定量PCR检测显示，实验组中的Sox9、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA表达量高于其他两组(P < 0.05)；④培养7，14，21 d的二甲基亚甲基蓝比色检测显示，实验组中的糖胺多糖含量高于其他两组(P <0.05)；⑤结果表明，脂肪来源血管基质成分复合脱细胞真皮基质/生物矿化胶原一体化支架可以在体外有效支持软骨形成。

https://orcid.org/0000-0003-4195-0099 (陈磊)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 骨, 材料, 脂肪来源血管基质成分, 脱细胞真皮基质, 生物矿化胶原, 一体化支架, 软骨缺损, 骨软骨

Abstract: BACKGROUND: A large number of animal and clinical experiments have confirmed that local transplantation of adipose-derived stromal vascular fraction can promote articular cartilage repair.
OBJECTIVE: To explore the feasibility of constructing tissue-engineered cartilage with acellular dermal matrix/biomineralized collagen integrated bone cartilage scaffold combined with autologous adipose-derived stromal vascular fraction.
METHODS: The groin fat pads of both sides of the female rabbit were taken out under sterile conditions, and the stromal vascular fraction was obtained by enzyme digestion. Flow cytometry was used to detect the surface specific protein and observe the ability of adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation. Adipose-derived stromal vascular fraction (experimental group), adipose-derived mesenchymal stem cells containing transforming growth factor-β3 (cartilage induction group) and adipose-derived mesenchymal stem cells containing 10% fetal bovine serum (control group) were co-cultured on acellular dermal matrix/biomineralized collagen scaffold. CCK8 assay was used to detect cell proliferation. The number of cells was observed under fluorescence microscope. Real time-quantitative PCR detection was used to detect cartilage related gene expression. The content of glycosaminoglycan in extracellular matrix was determined by dimethylmethylene blue colorimetry.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) The results of flow cytometry showed that the adipose-derived stromal vascular fraction had high expression of CD44, CD105 and CD90, and low expression of CD14, CD19 and CD45. Adipose-derived stromal vascular fraction had the ability to differentiate into adipocytes, osteoblasts and chondrocytes. (2) CCK8 assay showed that with the extension of culture time, the number of three kinds of cells on the acellular dermal matrix/biomineralized collagen scaffold increased, and the number of cells in the experimental group was higher than that in the other two groups (P < 0.05). Under the fluorescence microscope, the number of cells in the experimental group was more than that in the other two groups at 7 days after culture. (3) Real time-quantitative PCR results showed that at 21 days after culture, the mRNA expression levels of Sox9, proteoglycan and type II collagen in the experimental group were higher than those in the other two groups (P < 0.05). (4) Dimethylmethylene blue colorimetry results demonstrated that at 7, 14, and 21 days, the content of glycosaminoglycan in the experimental group was higher than that in the other two groups (P < 0.05). (5) The results showed that adipose-derived stromal vascular fraction combined with acellular dermal matrix / biomineralized collagen scaffold could effectively support cartilage formation in vitro.

Key words: bone, material, adipose derived stromal vascular fraction, acellular dermal matrix, biomineralized collagen, integrated scaffold, cartilage defect, osteochondral

中图分类号:

陈磊, 郑蕊, 杰永生, 綦惠, 孙磊, 舒雄. 脂肪血管基质成分复合骨软骨一体化支架的体外评价[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(22): 3487-3492.

Chen Lei, Zheng Rui, Jie Yongsheng, Qi Hui, Sun Lei, Shu Xiong. In vitro evaluation of adipose-derived stromal vascular fraction combined with osteochondral integrated scaffold[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(22): 3487-3492.

图/表（结果） 6

2.1 脂肪来源血管基质成分的细胞培养和鉴定脂肪来源血管基质成分细胞接种24 h后，细胞培养皿中大多数细胞呈现梭形，且处于分裂期；48-72 h后细胞增殖明显增多，细胞集落数量明显增多(图1)。

流式细胞仪检测结果显示，脂肪来源血管基质成分分离培养的细胞表型呈CD44+、CD105+、CD90+、CD14-、CD19-、CD45-，见图2。脂肪来源的血管基质成分经成脂诱导28 d后，油红O染色显示大量红染的脂质沉淀；经成骨诱导21 d后，茜素红染色结果显示有大量红染的钙结节形成；经成软骨诱导14 d后，阿尔新蓝染色可见呈阳性，表明有软骨细胞外基质成分产生(图3)。

2.2 复合培养细胞增殖检测结果 CCK8实验结果显示，随着培养时间的延长，3组细胞数量增加，实验组复合培养7，9，11 d的细胞数量多于与其他两组
(P < 0.05)，见图4A。这表明脂肪来源血管基质成分在骨软骨一体化支架中的细胞增殖能力强。
复合培养7 d后的荧光显微镜下可见，实验组蓝光细胞多于其他两组，见图4B。结果提示脂肪来源血管基质成分与骨软骨一体化支架具有良好的生物相容性。

2.3 复合培养细胞软骨相关基因表达检测结果复合培养21 d后，实验组的Sox9、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA相对表达量高于其他两组(P < 0.05)，并且软骨诱导组Sox9、蛋白聚糖和Ⅱ型胶原mRNA相对表达量高于对照组(P < 0.05)，见图5。

2.4 复合培养细胞糖胺多糖含量检测结果实验组复合培养7，14，21 d的糖胺多糖含量高于其他两组(P < 0.05)，软骨诱导组复合培养7，14，21 d的糖胺多糖含量高于对照组(P < 0.05)，见图6。

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引言

由创伤、骨关节炎和骨软骨病等引起的软骨损伤和退化，最终可导致膝关节疼痛、畸形、活动障碍等异常表现，严重时甚至致残[1-2]。由于关节软骨缺乏血管、淋巴和神经营养及氧气依赖性扩散特性，其自我修复能力很差，目前临床上常用微骨折术、骨软骨移植、自体/异体软骨细胞移植等技术和方法治疗关节软骨缺损 [3-6]，取得了不同程度的疗效。但还有很多问题需要解决，如修复组织是纤维软骨、承重区修复效果不明显且易于复发等；同时供区有限，大块软骨缺损难以应用，易造成疾病传播和免疫排斥反应等一系列问题，制约传统治疗方法对骨软骨缺损修复的进展。因此，探究新型和有效促进软骨再生修复的方法具有重要的临床意义。
近年来，组织工程和再生医学技术逐渐成为研究热点，为软骨修复的质量提升带来新的希望。脂肪来源血管基质成分是脂肪组织中成熟脂肪细胞以外的混合细胞群，包括脂肪来源干细胞、脂肪前体细胞、巨噬细胞、内皮细胞和周细胞等[7-10]。脂肪来源血管基质成分含量丰富、获取简便，大量的动物和临床实验证实了脂肪来源血管基质成分局部移植均可促进关节软骨修复[11-12]。此外，前期研究已成功构建脱细胞真皮基质/生物矿化胶原骨软骨一体化支架，具有良好生物相容性特征[13]。
实验拟采用脂肪来源血管基质成分复合脱细胞真皮基质/生物矿化胶原骨软骨一体化支架，观察其生物相容性和体外成软骨的作用，为下一步脂肪来源血管基质成分复合骨软骨一体化支架修复骨软骨损伤动物实验提供相应的研究基础。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外对比观察实验。
1.2 时间及地点实验于2019年7至10月在北京市创伤骨科研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 主要试剂与材料 Ⅰ型胶原酶、胰酶、Trizol试剂、DMEM高糖、低糖培养基和胎牛血清购自美国GIBCO公司；10%的CaCl2溶液、阿利辛蓝染料购自北京索莱宝生物科技有限公司；地塞米松和ITS+购自Sigma公司；cDNA Synthesis SuperMix和UltraSYBR Mixture购自日本Takara公司；糖胺多糖定量检测试剂盒购自上海杰美基因医药科技有限公司；新鲜牛跟腱、新鲜牛皮来源市售；1%的胃蛋白酶、CCK8、氯化钠、磷酸三钙、无水乙酸、36.5%的甲醛和DAPI染料购自美国Sigma公司。
1.3.2 主要仪器 CO2细胞培养箱(SHELLAB公司，美国)；SEM-6380LV型扫描电镜购自日本电子；往复式真空泵(上海益化真空设备有限公司)；倒置相差显微镜(Olympus公司，日本)；SHW200R型匀浆机购自上海盛海威电气仪表有限公司；冷冻大容量离心机(湘仪，中国)；荧光显微镜(Leica，德国)；荧光定量PCR仪(Bio-rad，美国)；Nanodrop ND-2000分光光度计(Thermo Fisher公司，美国)。
1.3.3 实验动物 12月龄健康雌新西兰兔1只，普通级，体质量2.5 kg，购自北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司。
1.4 实验方法　
1.4.1 骨软骨一体化支架的制备
生物矿化胶原悬液的制备：取牛跟腱5 g剪碎，置于
0.5 mol/L乙酸溶液中，并加入2.5 g胃蛋白酶，匀浆机匀浆；4 000 r/min离心30 min，取上清，加入20%NaCl 体积
500 mL；4 000 r/min离心15 min，弃上清；取沉淀约
100 mL，加入蒸馏水400 mL、0.5 mol/L乙酸15 mL；置于透析袋中透析4 d，每日换水；透析结束后加入0.5 mol/L乙酸10 mL，4 ℃保存，制备胶原溶液。将胶原和β-磷酸三钙按质量比3∶7通过匀浆机高速混匀，制备生物矿化胶原悬液。
脱细胞真皮基质的制备：①脱细胞处理：取新生小牛背部皮肤，脱毛、清洗，乙酸溶液浸泡溶胀2 h，使皮肤表皮、真皮和皮下组织各层有相对明显的界线，电动取皮刀切取厚度为1.0-2.0 mm的真皮层；流水冲洗乙酸后，室温下用0.5% SDS溶液水平振荡脱细胞2 h，更换新的SDS溶液，再继续作用2 h；流水冲洗过夜；蒸馏水再次冲洗20次后冷冻干燥机中冻干；②结构重塑：将脱细胞真皮基质置于0.5%胰蛋白酶溶液中，室温超声振荡2.5 h，冷冻干燥机中冻干；③交联：结构重塑后，用甲醛作为交联剂室温浸泡2 h；PBS冲洗3次，流水冲洗过夜，以去除残留的交联剂，再用蒸馏水清洗20 次后冻干，冷冻干燥，60Co照射后备用。
骨软骨一体化支架的制备：将脱细胞真皮基质作为一体化支架上层。首先将冷冻干燥的脱细胞真皮基质放入聚丙烯圆筒形模具中(内径 5 mm、高 5 mm)，将制备的生物矿化胶原悬液经脱气后缓慢注入模具中。为使接触界面紧密，使悬液固化成型，即在-80 ℃冰箱内维持2 h，冷冻样品最终在冷冻干燥机内真空条件下冷冻干燥48 h，脱模后成功取出支架。另将制作好的支架用20 kGy 60Co γ射线辐照灭菌，4 ℃下密封保存备用。
1.4.2 脂肪来源血管基质成分的分离与鉴定无菌条件下获取兔双侧腹股沟脂肪组织，PBS中清洗3次，彻底去除红细胞与组织碎片。加入预热的0.1%Ⅰ型胶原酶溶液，置37 ℃水浴震荡消化1 h。300×g离心5 min，去除上层脂肪细胞与胶原酶溶液。加入适量含10%牛血清白蛋白的DMEM重悬细胞，经400 μm细胞筛过滤，获得血管基质成分细胞进行计数。将血管基质成分置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中，以含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养48 h后换液，去除未贴壁细胞及残留的红细胞，当细胞集落达到80%汇合后用胰蛋白酶消化细胞，这些细胞被称为脂肪间充质干细胞的P1。
将脂肪来源血管基质成分经培养后的原代细胞经Trypsin消化后调整细胞浓度为109 L-1，与FITC和PE标记的抗体冰上避光孵育30 min，用含1%牛血清白蛋白的PBS重悬细胞，流式细胞术分析其表面特异性抗原的表达情况。
使用脂肪来源血管基质成分经培养后的原代细胞进行诱导分化，分别添加成脂诱导培养基(10-6 mol/L地塞米松、10 mg/L胰岛素和0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)、成骨(0.1 µmol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠和
50 µmol/L抗坏血酸磷酸盐)和成软骨(6.25 mg/L胰岛素、10 µg/L转化生长因子β和50 µg/L抗坏血酸)诱导培养基，观察其形态变化，并对诱导分化后的细胞分别进行油红O染色、茜素红染色与阿利新蓝染色。
1.4.3 脂肪来源血管基质成分与骨软骨一体化支架共培养使用前期研究中含转化生长因子β3的P3代脂肪间充质干细胞作为软骨诱导组和含体积分数10%胎牛血清的P3代脂肪间充质干细胞作为对照组[14]。脂肪来源血管基质成分(实验组)、含转化生长因子β3的脂肪间充质干细胞和含体积分数10%胎牛血清的脂肪间充质干细胞分别接种于含骨软骨一体化支架的96孔板内，即在骨软骨一体化支架表面缓慢滴加
0.2 mL细胞悬浮液，至完全覆盖支架，每个支架接种2×105个细胞，放在37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。
1.4.4 复合培养后的细胞增殖检测复合培养1，3，5，7，9，11 d后，每孔加入CCK8孵育4 h，测定450 nm处的吸光度值。复合培养7 d后，取出3组复合物，置于甲醇和丙酮等体积混合固定液中室温固定 10 min，PBS洗2次，用刀片将膜割下，采用含1 mg/L DAPI、50%甘油的PBS染色，荧光显微镜下拍照。
1.4.5 复合培养后的细胞软骨相关基因检测复合培养21 d后，通过TRIzol法提取总RNA，根据试剂盒说明书进行反转录和Real time-PCR反应，反应条件：95 ℃10 min，95 ℃15 s，55 ℃1 min，40个循环，72 ℃延伸1 min。检测相关目的基因，以GAPDH为内参基因，各引物序列见表1，采用ΔΔCt 法计算各组基因相对表达量。

1.4.6 复合培养后的细胞糖胺多糖含量检测复合培7，14，21 d后，将组织消化液 50 μL 加入96 孔板，另外加入200 μL预先配置好的二甲基亚甲基蓝比色染色液。利用二甲基亚甲基蓝比色法测定糖胺多糖的含量，实验步骤依据二甲基亚甲基蓝比色法测定糖胺多糖总含量定量检测试剂盒说明书进行。
1.5 主要观察指标各组细胞增殖、软骨相关基因表达与糖胺多糖总含量。
1.6 统计学分析各组所得计量数据以x±s表示，用SPSS 10.0进行统计学分析，两组间均数比较用t检验。检验水准α=0.05，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

关节软骨无血管、无淋巴管、无神经组织的结构特点使其再生能力十分有限，一旦受损其难以自我修复。目前已被用于关节软骨缺损的治疗方法包括微骨折术、自体软骨细胞移植、人工关节置换等，这些治疗方法可暂时改善其临床症状，但长期修复效果不佳。近年来，组织工程学的发展为软骨缺损修复提供了新的治疗策略，其中以干细胞为基础的组织工程方法为软骨缺损修复开辟了一条全新的途径[15-25]，而拥有足够数量、功能正常、具有成软骨分化能力的种子细胞尤为重要。血管基质成分是脂肪组织通过胶原酶消化、过滤、离心除去成熟脂肪细胞后得到混杂的细胞群体。与其他的自体干细胞(比如与脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞等)相比，脂肪来源血管基质成分具有如下优势：第一，虽然在免疫调节、血管发生和抗炎等特征方面相似，异质细胞组成的脂肪来源血管基质成分可能在动物实验中有更好的疗效[26-30]；第二，脂肪来源血管基质成分获得更容易，不需要体外细胞分离和培养，因而可以通过一次手术广泛应用临床[31-35]。
实验首先从雌兔双侧腹股沟脂肪组织分离血管基质成分，进一步以干细胞诱导多向分化能力作为金标准鉴定。通过与含转化生长因子β3的脂肪间充质干细胞和含体积分数10%胎牛血清的脂肪间充质干细胞相比，证实脂肪来源血管基质成分在骨软骨一体化支架上的增殖快速。很多体内外实验证实，旁分泌在脂肪来源血管基质成分的促血管化作用中扮演了重要角色。转化生长因子β3是转化生长因子家族的主要成员之一，可促进脂肪干细胞的增殖分化、促进细胞外基质形成，尤其在软骨细胞生长中发挥关键的作用[36-40]。DAPI染色显示，血管基质成分复合一体化支架组的细胞增殖明显，细胞数量高于软骨诱导组；另外，与软骨诱导组和对照组相比，实验组软骨表达相关基因和糖胺多糖含量增高。对于潜在的临床应用，含转化生长因子β3的脂肪间充质干细胞和体积分数10%胎牛血清的脂肪间充质干细胞存在两个方面的污染风险：其一为外源性物质在制备过程中可能发生的外源性污染；其二是添加试剂为外源蛋白，其本身生物污染不可小觑。另外，脂肪间充质干细胞的贴壁培养和纯化需要专业实验室设备和丰富经验操作人员，这限制了脂肪间充质干细胞在临床上的进一步应用[34-38]。实验显示，兔脂肪来源血管基质成分与骨软骨一体化支架具有良好的生物相容性，证实了自体血管基质成分复合骨软骨一体化支架修复关节软骨缺损的可行性方法，为软骨组织工程的临床应用提供了新的策略。
体外实验证实，脂肪来源血管基质成分与骨软骨一体化支架具有良好的生物相容性，接下来将进一步探讨其对关节软骨缺损修复动物实验的安全性和有效性。由于脂肪来源血管基质成分是一个组分十分复杂的细胞群，难以模拟细胞之间相互作用促进其关节软骨修复生长状态，对将脂肪来源的血管基质成分复合骨软骨一体化支架入动物体内的修复再生表现尚不明确。因此，下一步将探究脂肪来源血管基质成分主要的细胞成分如内皮细胞和其他循环细胞等各自在干细胞分化和软骨修复中如何发挥作用以及如何进行相互作用，为临床转化与应用做进一步努力。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

脂肪血管基质成分复合骨软骨一体化支架的体外评价

In vitro evaluation of adipose-derived stromal vascular fraction combined with osteochondral integrated scaffold

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