尿液环境中肠上皮细胞及其凋亡因子半胱氨酸蛋白酶3、Bax和Bcl-2表达的变化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3213

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (20): 3173-3177.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3213

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尿液环境中肠上皮细胞及其凋亡因子半胱氨酸蛋白酶3、Bax和Bcl-2表达的变化

徐彬，杨秀书，刘旋，王振兴

贵州省人民医院泌尿外科，贵州省贵阳市 550002

收稿日期:2020-05-11 修回日期:2020-05-16 接受日期:2020-07-09 出版日期:2021-07-18 发布日期:2021-01-15
通讯作者: 王振兴，硕士，主治医师，贵州省人民医院泌尿外科，贵州省贵阳市 550002
作者简介:徐彬，男，1981年生，贵州省贵阳市人，2015年贵州医科大学毕业，硕士，主治医师，主要从事泌尿系肿瘤及上尿路修复重建方面的研究。
基金资助:
贵州省科学技术厅资助项目(黔科合基础[2018]1100)，项目负责人：王振兴

Changes of intestinal epithelial cells and their apoptotic factors Caspase-3, Bax and Bcl-2 under urinary environment

Xu Bin, Yang Xiushu, Liu Xuan, Wang Zhenxing

Department of Urology, Guizhou Provincial People’s Hospital, Guiyang550002, Guizhou Province, China

Received:2020-05-11 Revised:2020-05-16 Accepted:2020-07-09 Online:2021-07-18 Published:2021-01-15
Contact: Wang Zhenxing, Master, Attending physician, Department of Urology, Guizhou Provincial People’s Hospital, Guiyang 550002, Guizhou Province, China
About author:Xu Bin, Master, Attending physician, Department of Urology, Guizhou Provincial People’s Hospital, Guiyang 550002, Guizhou Province, China
Supported by:
the grant from the Department of Science and Technology of Guizhou Province, No. [2018]1100 (to WZX)

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
尿液环境：是连接肾与膀胱通道中的细胞在一种主要成分为水、尿素、尿酸、无机盐的液体生存空间中，直接或间接影响细胞生存的各种因素。此次研究选择pH 5.5、高浓度渗透压为2 000 mOsm/(kg•H2O)的人工尿液和一定比例的培养基稀释构成细胞液体生存空间的影响因素。
肠上皮细胞：是具有极性的柱状上皮细胞，参与小肠黏膜上皮组织的构成，由隐窝下1/3处的干细胞生成，在3-5 d内到达肠腔，其子代细胞沿隐窝绒毛细胞轴迁移、逐渐成熟衰老最终在绒毛顶端脱落。肠道黏膜上皮细胞稳态是由上皮细胞不断增殖与凋亡之间的平衡来维系，一般情况下凋亡处于低水平。

背景：回肠代输尿管重建尿路，在临床上取得了较好的疗效。回肠代输尿管后的适应性改变与什么有关目前尚未见有关报道。此次研究希望通过观察尿液对肠上皮细胞内凋亡因子表达的影响，进一步探讨背后可能的机制，为回肠代输尿管后的病理学特点提供实验依据。
目的：观察尿液环境对肠上皮细胞内凋亡因子半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)、Bax、Bcl-2表达的影响，进一步探讨尿液环境是否促进了肠上皮细胞的凋亡及其机制。
方法：选取人工尿液分别与培养基按0，1∶1，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128进行稀释，处理人正常肠上皮细胞，分别处理24，48，72 h，用CCK-8法检测，观察尿液对肠上皮细胞增殖的影响。采用RT-PCR法和Western blot法检测肠上皮细胞中Caspase-3、Bax和Bcl-2的mRNA和蛋白表达情况。
结果与结论：①肠上皮细胞内凋亡因子Caspase-3、Bax在尿液浓度最高的组中呈高表达，随着尿液浓度梯度的不断降低，表达水平逐渐降低；②肠上皮细胞内抗凋亡因子Bcl-2在尿液浓度高的组中(1∶8和1∶16组)呈低表达，随着尿液浓度梯度的不断降低，表达水平逐渐升高；③提示尿液浓度越高，促凋亡因子Caspase-3、Bax在肠上皮细胞内呈高表达，而抑制凋亡因子Bcl-2呈低表达，表明尿液对肠道上皮细胞具有凋亡促进作用。

https://orcid.org/0000-0002-4345-8869 (徐彬)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

关键词: 尿液, 肠上皮细胞, 凋亡, 回肠, 输尿管, Caspase-3, Bax, Bcl-2

Abstract: BACKGROUND: Reconstruction of the urinary tract with the ileum instead of the ureter has achieved a good clinical effect. There are yet no reports on what the adaptation relates to after the ileum acts as a substitute of the ureter. This study attempted to observe the effect of urine on the expression of apoptotic factors in intestinal epithelial cells, to further explore the possible underlying mechanism, and to provide experimental evidence for the pathological characteristics of the ileum instead of the ureter.
OBJECTIVE: To observe the effect of urine environment on the expression of Caspase-3, Bax and Bcl-2 in human intestinal epithelial cells and to further investigate whether the urine environment promotes the apoptosis of intestinal epithelial cells and its underlying mechanism.
METHODS: Human normal intestinal epithelial cells were treated with artificial urine that was diluted in culture medium at the rate of 0, 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, and 1:128 for 24, 48, and 72 hours. Cell counting kit-8 was used to observe the effect of urine on the proliferation of intestinal epithelial cells. RT-PCR and western blot assay were used to detect the mRNA and protein expressions of Caspase-3, Bax and Bcl-2 in intestinal epithelial cells.
RESULTS AND CONCLUSION: Caspase-3 and Bax were highly expressed in intestinal epithelial cells of the group with the highest urine concentration, and the expression level gradually decreased as the urine concentration gradient decreased. The expression of Bcl-2 in intestinal epithelial cells was low in the group with the highest urine concentration, and the expression level gradually increased as the urine concentration gradient decreased. The higher the urine concentration, the higher the expression of pro-apoptotic factors Caspase-3 and Bax in intestinal epithelial cells, and the lower the expression of anti-apoptotic factor Bcl-2,indicating that the urine can promote the apoptosis of intestinal epithelial cells.

Key words: urine, intestinal epithelial cells, apoptosis, ileum, ureter, Caspase-3, Bax, Bcl-2

中图分类号:

徐彬, 杨秀书, 刘旋, 王振兴. 尿液环境中肠上皮细胞及其凋亡因子半胱氨酸蛋白酶3、Bax和Bcl-2表达的变化[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(20): 3173-3177.

Xu Bin, Yang Xiushu, Liu Xuan, Wang Zhenxing. Changes of intestinal epithelial cells and their apoptotic factors Caspase-3, Bax and Bcl-2 under urinary environment[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(20): 3173-3177.

图/表（结果） 3

2.1 CCK-8法检测尿液环境对肠上皮细胞增殖的抑制率采用CCK-8法检测细胞凋亡情况，见图1，与对照组相比，发现人工尿液1∶128组与其差异无显著性意义；而当人工尿液的稀释比例降低时，在人工尿液1∶64的环境下，48 h可见细胞凋亡增加[(3.98±1.95)%，P < 0.01]；在人工尿液1∶8的环境下，与对照组相比，24，48，72 h细胞抑制率(35.32%±1.40)%，(24.65%±2.2)%，(42.85%±1.86)%均显著增加(P < 0.01)，细胞凋亡以 72 h 效果更为明显。由此推断，尿液环境可诱导肠上皮细胞凋亡，且呈浓度梯度性。

.2 不同浓度的尿液对肠上皮细胞内凋亡因子Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响如图2，与对照组比较，1∶8，1∶16，1∶32和1∶64各组Bax蛋白表达显著增高(P < 0.01)，其中1∶8组表达量增高最大；1∶8和1∶16各组Caspase-3蛋白表达显著上升(P < 0.01)，1∶32组表达升高，且差异有显著性意义(P < 0.05)；1∶8和1∶16组Bcl-2蛋白表达显著下降(P < 0.01)，1∶128组Bcl-2蛋白表达升高，且差异有显著性意义(P < 0.05)。因此，只有达到一定浓度的尿液环境才能起到促进肠上皮细胞凋亡的作用，不同浓度的尿液环境对肠上皮细胞的影响并不一致。

2.3 不同浓度的尿液对肠上皮细胞内凋亡因子Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA表达的影响如图3所示，与对照组比较，不同尿液浓度干预组Caspase-3和Bax mRNA表达显著增高(P < 0.01)，Bcl-2 mRNA表达显著降低(P < 0.01)，说明尿液环境浓度越高，效果越佳。由此可知，尿液对肠上皮细胞内凋亡因子Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA表达的影响呈浓度依赖性。

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引言

材料方法

1.1 设计细胞学水平对比观察实验。
1.2 时间及地点于2018年7月至2019年3月在贵州省人民医院中心实验室完成。
1.3 材料
1.3.1 细胞与试剂人正常肠上皮HIEC细胞株为ATCC来源；根据要求定制pH 5.5，高浓度渗透压为2 000 mOsm/(kg•H2O)的人工尿液(索莱宝，A6660)；Cell count Kit-8细胞增殖试剂盒(CK04，500T)购于日本同仁化工公司；DMEM高糖培养基(含谷氨酰胺和丙酮酸钠)、PBS、青、链霉素购于美国HyClone公司；胎牛血清(Biological Industries，Israel)；FastStart Universal SYBR Green Master(Rox)(Roche，USA)；ECL化学发光底物(Bio-Rad，USA)；BCA蛋白浓度测定试剂盒、蛋白Marker购于Thermo公司；一抗Caspase-3、Bax、Bcl-2、β-actin兔抗鼠多克隆抗体，抗兔、抗鼠荧光二抗购于英国Abcam公司。
1.3.2 主要仪器及设备电泳槽购于美国Bio-Rad公司，
Stepone plus荧光定量PCR仪购于美国ABI公司，SW-CJ-1FD超净工作台购于中国苏净安泰公司，NanoDrop2000超微量分光光度计购于美国Thermo公司。
1.4 方法
1.4.1 细胞培养人正常肠上皮细胞株为HIEC细胞，在含有体积分数10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM培养基内培养，置于37 ℃、体积分数5%CO2常规培养箱中培养，每一两天换培养液，细胞生长至90%融合时传代。
1.4.2 CCK-8法检测肠上皮细胞抑制将对数生长期HIEC细胞用胰蛋白酶消化，配制成细胞悬液(浓度为1×108 L-1)，按
5 000细胞/孔接种于96孔板，每孔加100 μL，置于CO2(体积分数5%)培养箱中37 ℃下培养24 h以贴壁。继续培养24 h，取人工尿液分别用培养基按0，1∶1，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128稀释后加入10 μL各组孔内作为实验组，对照组采用纯培养基培养(人工尿液与培养基比例为0)。每个浓度的样本设6个重复，培养72 h后拍照观察。所有孔中加入10 μL CCK-8溶液，培养箱中孵育1-4 h。使用酶标仪测定450 nm吸光度(A)值，不含细胞的培养基为空白组，按公式计算药物对细胞的抑制率。细胞抑制率(%)=1-(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)×100%。
1.4.3 免疫印迹(Western blot)法检测肠上皮细胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2的蛋白表达取人工尿液分别用培养基按0，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128稀释后加入200 μL各组孔内作为实验组，对照组加入200 μL纯培养基培养，培养周期结束，收集各组细胞。提取细胞蛋白后测定蛋白浓度，大致步骤：取50 μg/孔细胞蛋白进行凝胶电泳，常温下将电泳分离后的蛋白转膜于PVDF膜，适量5%脱脂牛奶室温下封闭1 h，加入一抗Caspase-3、Bax、Bcl-2(1∶5 000、
1∶8 000、1∶1 000)及内参β-actin(1∶5 000)，于4 ℃孵育过夜。用TBST洗5次，每次5 min，二抗(1∶10 000)室温下摇床孵育1 h。滴加新鲜配制的ECL混合溶液到膜的蛋白面，暗室曝光，显影、定影。iBrightv 1.4.0对胶片进行存档和分析，分析靶带和内参的A值，并以靶蛋白带A与β-actin A比值表示蛋白表达量。
1.4.4 采用RT-PCR法检测肠上皮细胞中Caspase-3、Bax、
Bcl-2 mRNA表达情况使用Trizol进行总RNA抽提，Nanodrop
2000检测RNA浓度及纯度。将浓度过高的RNA进行适当比例的稀释，使其终浓度为200 μg/L，后将1 μg总RNA反转录合成cDNA作为模板，荧光定量PCR试剂盒进行扩增，按照试剂盒说明书步骤操作。PCR扩增条件为95 ℃预变性
10 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火延伸60 s，循环40次，熔解曲线60 ℃→95 ℃，每15 s升温0.3 ℃。使用HT7500生物系统以及SYBRGreen的试剂盒，选择β-actin为内参基因，用2-∆∆Ct法对样本基因进行表达差异相对定量分析。引物由Servicebio公司合成，序列见表1。

1.5 主要观察指标各组培养24，48，72 h，用CCK-8法检测肠上皮细胞增殖情况，采用Western blot法检测肠上皮细胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2的蛋白表达水平，采用RT-PCR法检测肠上皮细胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2 mRNA的表达情况。
1.6 统计学分析运用SPSS 21.0统计软件进行统计分析，计量资料以x±s表示，采用单因素方差分析，两两比较使用LSD检验，P < 0.05为差异有显著性意义。

讨论

输尿管损伤临床上较为常见，全段损伤往往不能自行愈合，需要特殊处理。导致损伤的常见原因除创伤外，还有输尿管结核、输尿管放射性损伤、慢性炎症及腹膜后纤维化等。输尿管全段损伤需要手术治疗，且较为棘手，在各种输尿管重建手术中，回肠代输尿管术可以处置较长的输尿管段损伤，取得了较好的效果[7-8]，成为全段输尿管损伤的常用术式。此次研究探讨回肠代输尿管应用重建尿路过程中，影响肠上皮替代输尿管上皮的因素及其可能的作用机制，进而为该过程中肠道黏膜出现病理学改变提供实验依据。
肠上皮细胞是肠道黏膜屏障的重要组成部分，HIEC细胞为人小肠上皮细胞，各种病理因素可引起肠上皮细胞损伤，肠道环境比尿道复杂，各种细菌和病因均可引起肠黏膜损伤及修复。相关基础研究表明，肠黏膜依靠位于肠腺隐窝的细胞不断增殖、分化及上皮细胞移行形成新的上皮细胞，从而促进黏膜修复[9]。回肠黏膜具有绒毛，绒毛表面上皮呈圆柱状，大多数为杯状细胞，也可见柱状上皮细胞和少许潘氏细胞[10]。输尿管上皮结构为移行上皮[11]，与小肠上皮结构具有一定的差异性。回肠替代输尿管后适应性改变，肠道黏膜在尿液的影响下出现绒毛萎缩变短，是否可能因为尿液对其稳态产生了影响？由于正常情况下，小肠肠液的pH值为5-7，尿液的pH值范围在5.5-6.5之间[12-13]，酸碱环境大体相同，pH值促进肠上皮细胞凋亡的可能性较小。因此，可能是尿液环境在回肠代输尿管适应性过程中加速肠上皮细胞凋亡，促进肠黏膜中的细胞增殖、分化及移行成新的上皮细胞以适应尿路环境。
考虑到人尿液的不稳定性以及不同时间、不同个体、正常人尿液的pH值和成分比例有一定差异。此次研究采取的人工尿液分别用培养基按0，1∶1，1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128稀释后加入各组孔内，模拟回肠代输尿管术后适应性过程中尿液的影响。实验结果显示，与对照组比较，1∶8，1∶16，1∶32和1∶64各组Bax/Bcl-2 蛋白表达增高，1∶8，1∶16和1∶32各组Caspase-3蛋白表达升高；与对照组比较，不同尿液浓度干预组Caspase-3和Bax/Bcl-2 mRNA表达升高；且随浓度梯度增高，mRNA和蛋白表达逐渐升高。然而与对照组比较，1∶128组Bcl-2蛋白表达升高，与mRNA表达结果不一致；同时，与蛋白表达结果相应，CCK-8结果显示1∶128组细胞凋亡无显著变化。综上所述，尿液环境促进肠上皮细胞凋亡，可能与升高凋亡因子Caspase-3、Bax/Bcl-2的表达有关。众所周知，RT-PCR检测mRNA的灵敏度较Western blot检测更高，并且mRNA翻译成蛋白质包括转录后加工、翻译、加工及修饰等多个层面，转录水平和翻译水平并不完全一致[14-15]，因此mRNA与蛋白表达结果不完全一致。蛋白质是行使生理功能的基本单位[16]，据此，在尿液环境中肠上皮细胞内Caspase-3和Bax/Bcl-2蛋白水平的变化可能影响肠上皮细胞细胞凋亡程序，进而促进肠上皮细胞凋亡，发生对新生存环境的适应性改变。除1∶128组以外，同一时间条件下，随着尿液浓度梯度的增高，肠上皮细胞内mRNA和蛋白表达逐渐升高，因此，肠上皮细胞所处环境尿液浓度越高，即与回肠代输尿管后适应性过程中影响因素越相似，肠上皮细胞凋亡越快。
Caspase-3是半胱天冬酶级联反应的执行者，半胱天冬酶级联反应是凋亡诱导细胞死亡的关键步骤[17]。Caspase-3的激活诱导特定底物的裂解，如PARP，这是凋亡发生的关键[18]。此外，Bcl-2家族蛋白比例的改变与线粒体内环境平衡失衡有关，这种失衡会导致细胞凋亡，促凋亡Bax水平的升高和/或抗凋亡Bcl-2水平降低均会导致线粒体膜电位丧失，从而启动细胞凋亡[19]。
Bax是Bcl-2基因家族中的一员，与Bcl-2形成同源或异源二聚体。Bcl-2家族在抑制细胞凋亡中起重要作用，在凋亡过程中主要表现为调控Bax蛋白表达增多，Bcl-2蛋白表达减少，Bax/Bcl-2比例上升，Bax同源二聚体增多，Bcl-2与Bax的异源二聚体减少[20-21]。当细胞受外界损失刺激时，凋亡信号能使Bax在线粒体外膜上的低聚，形成渗透性膜转移孔复合物，导致线粒体外膜通透性增加，建立线粒体膜离子通道，介导线粒体的释放反应，使细胞色素C可以进入线粒体与凋亡促进因子1和Caspase-9结合形成复合体，在ATP参与下，使Caspase-3等蛋白酶家族发生酶解级联激活，最后执行凋亡过程[21-24]。Bcl-2则通过阻碍细胞色素C的释放，阻断Caspase-3的激活，抑制细胞凋亡[25]。因此，尿液环境可能通过影响细胞内Bax和Bcl-2蛋白的表达，经线粒体信号转导途径促进 Caspase-3 水解产生酶解级联反应，最后导致人正常肠上皮HIEC细胞的凋亡。
综上所述，此次研究发现尿液环境可促进人正常肠上皮HIEC细胞的凋亡，显著上调细胞内凋亡因子Caspase-3、Bax/Bcl-2蛋白及mRNA表达，其机制可能是通过调控细胞凋亡因子Caspase-3、Bax/Bcl-2，进而促进肠上皮的适应性改变，加速肠上皮的化生，使回肠更好地替代输尿管。此次研究发现回肠代输尿管重建尿路过程，尿液环境是促进回肠适应性改变的其中一个因素，然而回肠代输尿管应用的适应过程复杂，是否有其他影响因素还需进一步研究，同时有关尿液环境促进回肠代输尿管应用是否有其他通路也有待研究。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建；骨细胞；软骨细胞；细胞培养；成纤维细胞；血管内皮细胞；骨质疏松；组织工程

尿液环境中肠上皮细胞及其凋亡因子半胱氨酸蛋白酶3、Bax和Bcl-2表达的变化

Changes of intestinal epithelial cells and their apoptotic factors Caspase-3, Bax and Bcl-2 under urinary environment

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