1.1 设计 体外细胞学实验。
1.2 时间及地点 于2019年1至12月在湖北中医药大学实验动物中心和针灸研究所完成。
1.3 材料
1.3.1 实验动物 10周龄清洁级SD大鼠36只,体质量约200 g,雌雄不限,用于制备含药血清;4周龄清洁级SD大鼠30只,体质量约80 g,雄雌不限,用于提取细胞,均由湖北省医学科学研究院实验动物中心提供[合格证号:SCXK (鄂)2019-0018],经湖北中医药大学实验伦理委员会批准,将动物饲养于湖北中医药大学实验动物中心。
1.3.2 仪器 高速低温离心机(Eppendorf),CO2培养箱(Thermo Fisher),倒置荧光数码显微镜(Leica),Elx800酶标仪(Bio-Tek),Infinite M200多功能酶标仪(Tecan),9600型DNA扩增仪(PE),凝胶成像系统(Bio-Rad)等。
1.3.3 药品与试剂 Ⅱ型胶原酶(Sigma),0.25%胰蛋白酶(Gibco),胎牛血清(Gibco),DMEM低糖培养基(Hyclone),PBS(Hyclone),青霉素-链霉素双抗混合液(Hyclone),MTT试剂盒(Biosharp),qRT SuperMix for qPCR(Vazyme),ELISA试剂盒(中国西塘公司),反转录反应试剂盒(Fermentas),NOD样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like
receptor protein 3,NLRP3)一抗(CST),Caspase-1一抗(Santa
Cruz),Gasdermin D(GSDMD)一抗(Abcam),β-actin抗体(Proteintech),二抗(Proteintech),脂多糖(Biosharp),ATP (Solarbio)。
通督活血汤药物组成如下:鹿角片18 g、金毛狗脊12 g、
杜仲9 g、黄芪18 g、当归9 g、苏木9 g、泽兰叶9 g、地龙9 g、赤芍9 g、丹参18 g。以上中药由湖北中医药大学附属国医堂提供并由湖北省中医院药剂科制备成含生药1 g/mL的药液,常温冷却后-20 ℃保存备用。
1.4 方法
1.4.1 通督活血汤含药血清的制备 健康10周龄SD大鼠36只,适应性喂养7 d后,参照“动物和人体表面积折算的等效剂量比率表”进行换算,按10.8 g/(kg•d)的量给于通督活血汤灌胃,连续灌胃7 d,最后1 d连续灌胃2次,中间间隔2 h。采血前需禁食12 h,在末次灌胃2 h后行腹主动脉取血,每只取血约8 mL,将所取全血放至37 ℃恒温水浴箱中水浴20 min,随后3 000 r/min离心20 min,吸取上清,过滤除菌后分装,-20 ℃保存备用。
1.4.2 椎间盘纤维环原代细胞的分离与培养 4周龄SD大鼠进实验室后立行腹腔注射10%水合氯醛麻醉处死,逐层分离并剔除腰椎两旁的肌肉,暴露腰椎,咬骨钳取出腰椎,尽量剥离椎体周围附着的肌肉,逐个取出椎间盘。剔除中间髓核,余下纤维环用眼科剪剪成约1 mm3大小的碎片,将组织碎片至于装有1×PBS的离心管中,4 ℃下1 200 r/min离心机中离心2 min,漂洗2次后小心倒尽PBS,用0.2%Ⅱ型胶原酶
3 mL,置于37 ℃恒温箱中消化,每隔2 h提取一次上清液,1 000 r/min离心5 min后倒掉上清液,收集细胞沉淀。共收集3次,将收集到的细胞沉淀用含体积分数10%的胎牛血清和100 U/mL青-链霉素的细胞培养液重悬,后分装至培养瓶,置于37 ℃恒温CO2培养箱中孵育。密切观察细胞,约48 h细胞贴壁后首次换液,隔天换培养液1次,待细胞铺满培养瓶底约90%时进行传代。
1.4.3 纤维环细胞的鉴定
(1) 甲苯胺蓝染色:将第2代细胞调整个数为2.6×106 L-1
种板在6孔板中的无菌盖玻片上,待细胞铺满玻片时,吸弃培养液并用PBS漂洗3次,每孔用1 mL 40 g/L的多聚甲醛固定30 min,吸尽多聚甲醛,用PBS漂洗3次,每孔滴入
500 μL甲苯胺蓝染色液,室温30 min,自来水冲洗,加入冰醋酸进行分化,ddH2O冲洗3次后,快速加入无水乙醇漂洗1次,常温下风干后中性树胶封固,光学显微镜下观察形态并进行鉴定。
(2) Ⅱ型胶原免疫组化染色:同上,将第2代细胞种板、漂洗、固定,PBS漂洗3次后加入50 μL的0.1%破膜剂处理细胞,20 min后PBS漂洗3次,在盖玻片上滴加50 μL 3%的双氧水室温静置30 min,PBS漂洗3次,每片滴加5%BSA封闭30 min后,阳性组滴加Ⅱ型胶原一抗(1∶200)反应过夜,阴性组用PBS替代,一抗孵育完成后,PBS漂洗3次,加入二抗约50 μL(1∶200)室温静置30 min,PBS漂洗3次后吸净。将50 μL DAB溶液均匀滴加在每片玻片上,10 min后自来水漂洗3次,经苏木精复染,PBS漂洗3次,于含体积分数5%盐酸乙醇溶液中返蓝2 s,常温下晾干后脱水、透明、中性树胶封固,光学显微镜下观察形态并进行鉴定。
1.4.4 脂多糖/ATP诱导纤维环细胞焦亡模型的建立 参照制造细胞焦亡模型相关文献[10],将第2代纤维环细胞培养液中加入1 mg/L的脂多糖处理6 h后,更换ATP(3 mmol/L)1 h后形成细胞焦亡模型。
1.4.5 MTT法检测最佳干预浓度和干预时间 取第2代纤维环细胞,以5×103个/孔接种于3块96孔板中,分别标记为12 h组、24 h组、48 h组,常规培养48 h后加入DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)细胞培养基同步化细胞,饥饿培养24 h后吸净DMEM,加入培养液并滴加1 mg/L的脂多糖6 h后更换3 mmol/L的ATP 1 h后造模。成模后在96孔板上标记分组,每组设立8个复孔,分别加入0,5%,10%,20%,40%的含药血清,对应培养时间结束后,吸净培养液,每孔分别加入100 μL MTT(浓度为1 g/L)。37 ℃下培养5 h后弃MTT,向每孔中加入150 μL
二甲基亚砜,于震荡仪上均匀震荡10 min后在酶标仪上以570 nm波长下对各孔吸光度(A)值进行检测,记录并分析数据。
1.4.6 流式细胞术检测细胞焦亡比例 将第2代细胞以1×106个/孔接种于5块6孔板中,细胞贴壁后分为空白组、模型组、含药血清低、中、高剂量组。除空白组外,其余4组予脂多糖/ATP制造细胞焦亡模型,成模后低、中、高剂量含药血清组分别予5%,10%,20%通督活血汤含药血清干预,空白组不采取任何干预措施。分组干预结束后用不含EDTA的胰酶消化,离心后吸弃上清液,PBS清洗后离心,收集细胞沉淀,用试剂盒中的缓冲液重悬细胞,调整浓度为1×109 L-1,参照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书进行处理,采用Cell Quest软件获取1×104个细胞,将UR象限细胞认定为发生焦亡的细胞[11]。
1.4.7 ELISA法检测各组细胞上清液白细胞介素1β、白细胞介素18表达量 取第2代纤维环细胞,以3×108 L-1接种于6孔板中,常规培养48 h后分为空白组、模型组、含药血清低、中、高剂量组。空白组培养液为常规培养液(10%胎牛血清+ DMEM),模型组培养液为含脂多糖和ATP的培养液(常规培养液+1 mg/L 脂多糖+3 mmol/L ATP),含药血清低、中、高剂量组分别为含5%,10%,20%含药血清的培养液(常规培养液+5%/10%/20%含药血清),培养24 h后,收集细胞上清液,按照ELISA试剂盒说明书检测各组上清液中白细胞介素1β、白细胞介素18的表达量。
1.4.8 qRT-PCR法检测各组细胞Caspase-1、GSDMD、NLRP3基因的表达量 将干预完成的各组细胞用PBS漂洗3次后,再将1 mL Trizol滴入25 mL培养瓶中反应5 min,采用Trizol法提取总RNA,再将提取的mRNA进行反转录反应。反应条件为:50 ℃进行15 min,85 ℃进行2 min,反应结束后采用实时荧光定量PCR检测各组Caspase-1、GSDMD、NLRP3基因的表达量,扩增反应条件如下:95 ℃30 s,95 ℃ 10 s,
60 ℃ 30 s,共40个循环,得到扩增曲线与CT值。95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s,共40个循环,得到熔解曲线。以GAPDH为对照,采用2-ΔΔCt计算各组基因mRNA的相对表达量。Caspase-1、GSDMD、NLRP3引物见表1。
1.4.9 Western Blot法检测各组细胞Caspase-1、GSDMD、
NLRP3蛋白的表达量 采用RIPA裂解液获取各组细胞蛋白,参照蛋白凝胶试剂盒制备凝胶,上样完成后以20 V 10 min、50 V 30 min、100 V 70 min完成跑胶,将凝胶切割后采用半干转膜法转至PVDF膜上,TBST漂洗3次后,置于脱脂牛奶中封闭2 h;封闭完成后TBST漂洗3次,将洗好的膜放入已配置好的一抗[β-actin(1∶2 000)、Caspase-1(1∶1 000)、GSDMD(1∶1 000)、NLRP3(1∶1 000)]中,4 ℃摇床过夜,孵育完成后TBST漂洗3次,置于装有二抗(1∶5 000)的自封袋中室温孵育1 h,TBST漂洗3次后采用高效显影液显影,Image Lab软件分析并记录。
1.5 主要观察指标 ①MTT法观察通督活血汤含药血清干预纤维环细胞焦亡的最佳浓度和最佳时间;②流式细胞术检测各组细胞焦亡率;③ELISA法检测各组细胞上清液中白细胞介素1β、白细胞介素18的表达量;④qRT-PCR法检测各组细胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD基因的表达量;⑤Western
Blot法检测各组细胞中NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白的表达量。
1.6 统计学分析 采用SPSS 21.0软件进行分析,所得实验数据以x±s表示。所得数据若符合正态分布,则采用单因素方差分析;若不符合正态分布,则采用非参数检验。以P < 0.05表示差异有显著性意义。