猪结肠脱细胞支架联合结肠癌HCT116细胞的体外共培养

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.3049

中国组织工程研究 ›› 2021, Vol. 25 ›› Issue (10): 1533-1538.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.3049

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猪结肠脱细胞支架联合结肠癌HCT116细胞的体外共培养

朱茗祺1，周京旭2，林丽珠3，陈泽仁1，廖志晓1

1广州中医药大学，广东省广州市 510006；广州中医药大学第一附属医院,2肿瘤中心一区，3肿瘤中心四区，广东省广州市 510400

收稿日期:2019-12-30 修回日期:2020-01-07 接受日期:2020-06-12 出版日期:2021-04-08 发布日期:2020-12-18
通讯作者: 周京旭，博士，主任医师，广州中医药大学第一附属医院肿瘤中心一区，广东省广州市 510400
作者简介:朱茗祺，女，1996年生，广东省珠海市人，汉族，硕士，主要从事中西医结合防治肿瘤方面的研究。

In vitro co-culture of decellularized matrix of porcine colon with colon cancer HCT116 cells

Zhu Mingqi1, Zhou Jingxu2, Lin Lizhu3, Chen Zeren1, Liao Zhixiao1

1Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China; 2District 1, 3District 4, Cancer Center, the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510400, Guangdong Province, China

Received:2019-12-30 Revised:2020-01-07 Accepted:2020-06-12 Online:2021-04-08 Published:2020-12-18
Contact: Zhou Jingxu, MD, Chief physician, District 1, Cancer Center, the First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510400, Guangdong Province, China
About author:Zhu Mingqi, Master, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, Guangdong Province, China

摘要/Abstract

摘要：

文题释义：
猪结肠脱细胞支架：一种通过化学、物理等方法对新鲜猪结肠组织进行脱细胞处理后得到的天然支架，能为细胞提供天然细胞外基质成分的三维生长环境。
浸润性生长：指肿瘤细胞生长增殖并破坏周围组织(包括组织间隙、淋巴管或血管)的生长方式。

背景：近年来脱细胞支架已被广泛用于各种肿瘤的研究，支架的空间排列、生物力学性质和生物相容性等特性均有助于还原肿瘤细胞生长的微环境。
目的：探讨猪结肠脱细胞支架作为结肠癌体外模型的特点与优势。
方法：将新鲜猪结肠以2%SDS、1%Triton X-100及0.5%EDTA浸泡结合反复振荡的方法进行脱细胞处理，制备猪结肠脱细胞支架。将人结肠癌HCT116细胞接种于猪结肠脱细胞支架黏膜面，活-死染色观察支架上的细胞生长情况，鬼笔环肽染色观察支架上的细胞形态，苏木精-伊红染色与免疫荧光染色观察细胞在支架上的纵向生长情况。
结果与结论：①活-死染色显示，培养第1天，HCT116细胞能很好地聚集在支架黏膜层的孔隙内，少见死细胞；第3天时，细胞逐渐向孔隙外蔓延生长，小部分细胞已生长连接成片，无死细胞；第7天时，细胞生长密度进一步增大，在黏膜层表面生长成片，无死细胞与脱落细胞；②培养第7天苏木精-伊红染色及免疫荧光染色显示，部分HCT116细胞可在孔隙内生长成团，并有部分细胞沿着孔隙继续向黏膜下层生长，表现出原位肠癌浸润性生长的特点；③培养第7天鬼笔环肽染色显示，HCT116细胞与支架黏膜层在超微结构水平上有紧密的接触，并且具有分化良好的上皮形态特征；④结果表明，猪结肠脱细胞支架可作为结肠癌细胞三维培养的载体。
https://orcid.org/0000-0003-2602-3254 (朱茗祺)

中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

关键词: 材料, 肿瘤, 支架, 脱细胞支架, 三维培养, 结肠癌, 浸润性生长

Abstract: BACKGROUND: Acellular scaffolds have been widely used in the study of various tumors in recent years. The spatial arrangement, biomechanical properties and biocompatibility of the scaffolds are helpful to restore the microenvironment of tumor cell growth.
OBJECTIVE: To investigate the characteristics and advantages of porcine colon acellular scaffold as an in vitro model of colon cancer.
METHODS: Acellular scaffolds of porcine colon were prepared by soaking fresh porcine colon with 2% SDS, 1% TritonX-100 and 0.5% EDTA combined with repeated shaking. Human colon cancer HCT116 cells were inoculated on the mucous surface of porcine colon acellular scaffold. The growth of cells on the scaffold was observed by live-death staining. The morphology of cells on the scaffold was observed by phalloidin staining, and the longitudinal growth of cells on the scaffold was observed by hematoxylin-eosin staining and immunofluorescence staining.
RESULTS AND CONCLUSION: (1) Live-death staining showed that on the first day of culture, HCT116 cells could well gather in the pores of the mucosal layer of the scaffolds, and few dead cells were found. On the third day, the cells gradually spread out of the pores, and a small number of cells grew and connected into pieces, and there were no dead cells. On the 7th day, the cell growth density further increased and grew into a sheet on the surface of the mucous layer, and there were no dead cells and exfoliated cells. (2) On the 7th day of culture, hematoxylin-eosin staining and immunofluorescence staining showed that some HCT116 cells could grow into clusters in the pores, and some cells continued to grow to the submucosa along the pores, showing the characteristics of invasive growth of intestinal cancer in situ. (3) On the 7th day of culture, the phalloidin staining showed that HCT116 cells were in close contact with the scaffold mucosa at the ultrastructural level, and had well-differentiated epithelial morphological characteristics. (4) The result shows that porcine colon acellular scaffold can be used as a carrier for three-dimensional culture of colon cancer cells.

Key words: materials, tumor, scaffold, acellular scaffold, three-dimensional culture, colon cancer, invasive growth

中图分类号:

朱茗祺, 周京旭, 林丽珠, 陈泽仁, 廖志晓. 猪结肠脱细胞支架联合结肠癌HCT116细胞的体外共培养[J]. 中国组织工程研究, 2021, 25(10): 1533-1538.

Zhu Mingqi, Zhou Jingxu, Lin Lizhu, Chen Zeren, Liao Zhixiao . In vitro co-culture of decellularized matrix of porcine colon with colon cancer HCT116 cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2021, 25(10): 1533-1538.

图/表（结果） 5

2.1 脱细胞猪结肠支架的鉴定大体观察正常猪结肠组织的黏膜层呈淡粉色，浆膜层呈淡白色，见图1A、B；经过脱细胞处理后黏膜层明显瘫软，呈半透明白色，见图1C、D，组织体积大小在脱细胞处理前后的改变不大。

苏木精-伊红染色显示，新鲜猪结肠的肠壁结构分层清晰，黏膜层含有丰富的上皮细胞，黏膜下层结构疏松，有少量细胞分散分布，肌层则由大量平滑肌细胞构成，浆膜层的结缔组织较为致密，见图2A、C；经过脱细胞处理后，肠上皮细胞被完全清除，但细胞外基质成分完整保留，肠壁的4层结构排列完整，见图2B、D。

扫描电镜显示，猪结肠黏膜层表面较新鲜脱细胞猪结肠更为致密，肠隐窝结构保存完整，且在表面形成大小、分布均匀的多孔结构，孔隙的形状规则偏圆，内径大小范围在40-60 μm，见图3，孔隙大小符合细胞的种植、生长。

2.2 三维培养模式下人结肠HCT116细胞的生长与增殖 HCT116细胞在脱细胞猪结肠支架上培养7 d，活-死染色结显示，培养第1天时，细胞能很好地聚集在支架黏膜层的孔隙内，且无太多死细胞，见图4A；培养至第3天时，细胞逐渐向孔隙外蔓延生长，小部分细胞已生长连接成片，未看到死细胞，见图4B；培养至第7天时，细胞生长密度进一步增大，在黏膜层表面生长成片，未见到死细胞，且无细胞脱落的情况，见图4C。随着培养时间的延长，细胞能从脱细胞猪结肠隐窝中逐渐增殖，平铺在黏膜表层并逐渐蔓延生长成片，由于支架的大小固定，培养超过7 d后易产生细胞成片脱落，这一生长与细胞在培养皿上的二维培养相似，细胞会产生接触抑制。
三维培养第7天时苏木精-伊红染色及免疫荧光染色可见，部分HCT116细胞可在脱细胞猪结肠支架孔隙内生长成团，并有部分细胞沿着孔隙继续向黏膜下层生长，见图4D、E。这种纵向生长的趋势与肠癌细胞入侵黏膜层并向下侵犯肌层、浆膜层类似，符合侵袭性生长的特点。

2.3 二维及三维培养模式下人结肠HCT116的形态学特点二维培养模式下，HCT116细胞表现为短梭形片状，且无重叠生长表现；三维培养模式下，HCT116细胞聚集在脱细胞猪结肠支架孔隙中，表现为成团聚集生长，聚集的HCT116细胞表现得较为圆润(黄色箭头)，然而团聚生长细胞群的边缘细胞则表现为纺锤形(白色箭头)，表现为向周边生长增殖、侵袭的趋势，见图5。

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引言

结直肠癌是最常见的消化系统肿瘤之一，在中国该病的发病率也呈逐年上升趋势，目前治疗方案仍以外科手术为主，术后转移、复发、放化疗耐药性产生是导致治疗失败的主要原因。然而患者接受化疗药物治疗的有效率与机体对化疗药物的敏感性息息相关，但药物筛选的成功与否依赖于肿瘤模型的开发，肿瘤细胞的许多特性需要在特定环境中才能展现[1]。
目前广泛应用的细胞培养方法是二维培养，该培养方法操作简便、技术成熟、易于保存且成本较低，然而其无法提供细胞外基质等生长介质，也缺乏相应的离体基质，因此新型的三维肿瘤细胞培养方法不断被研究者探索并应用，如生物凝胶、3D细胞克隆球培养、类器官等[2-6]，涉及领域涵盖了肿瘤的发生发展、血管拟态、侵袭转移及免疫逃逸等诸多方面。与传统二维培养相比，这类三维培养技术能提供给细胞一个更接近于体内微环境的生长空间，所以在临床前药敏试验和药物筛选实验中，利用三维细胞培养的方法能一定程度上代替动物体内实验，缩短临床前期试验周期，减少研究资金的浪费[7]。
脱细胞支架是一种通过化学、物理、生物等方法去除组织中的细胞成分仅保留细胞外基质的组织工程支架，由于去除了DNA及表面抗原等细胞成分，且保留着组织的完整结构、细胞附着点和血管管道，具有无免疫原性或低免疫原性等特点。近年来脱细胞支架已被广泛用于各种肿瘤的研究，且取得了一定的进展和成果。脱细胞支架的空间排列、生物力学性质和生物相容性等特性均有助于还原肿瘤细胞生长的微环境[8]，同时脱细胞支架还能提供丰富的细胞因子[9]，能使肿瘤细胞表现出与在平面培养上不同的生物学形态[10]，有助于增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力[11]，不少肿瘤细胞能在脱细胞模型培养条件下表现为更接近体内环境生长的肿瘤。
在大量的脱细胞组织研究中，结肠组织脱细胞方面的研究还停留在初步探索阶段，大部分仅从脱细胞的可行性、脱细胞结肠的组成特点方面进行探究。由于没有系统的细胞培养研究和证据，现在关于构建结肠脱细胞支架联合肿瘤细胞培养的可行性和意义尚待探究。脱细胞支架能提供天然的细胞外基质，细胞外基质不仅为细胞提供物理支撑，同时对其增殖、分化和存活也起到非常重要的作用。上皮性的结肠癌细胞系HCT116具有很强的侵袭能力及很强的抗失巢凋亡能力[12-14]，更适合在脱细胞三维支架上培养。
由于猪和人类的基因组相似，猪与人的细胞外基质蛋白高度保守，表明猪结肠基质适合用于人类肿瘤模型的应用。此外，猪结肠很容易从市场上获取，价格低廉，能节约成本。因此，该实验探究了猪结肠脱细胞支架的基本表征，提供了HCT116细胞在支架上生长的可行性证据，同时探究该支架与其他三维肿瘤模型(如水凝胶支架、三维肿瘤球模型、类器官等三维模型)的区别与优势，旨在为体外三维培养肠癌细胞的模型应用提供新的思路和方向。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

材料方法

1.1 设计体外细胞观察实验。
1.2 时间及地点实验于2019年3至9月在南方医科大学基础医学院解剖实验室完成。
1.3 材料获取市场上6月龄长白猪的结肠，用冰盒保存运送至实验室备用。人结肠癌HCT116细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。
实验用主要试剂和仪器： DMEM高糖培养基、体积分数10%胎牛血清(Gibco)；十二烷基硫酸钠 SDS(Solarbio Life Science)；乙二胺四乙酸 EDTA、曲拉通 Triton X-100、Viability、Cytotoxicity Assay Kit for Animal Live&Dead Cells(US EVERBRIGHT INC.)；苏木精-伊红染色试剂盒、DAPI封固剂、TRITC Phalloidin罗丹明标记鬼笔环肽(Yeasen)；系统显微镜(型号：BX53，OLYMPUS)；扫描电子显微镜(型号：EVO MA，Carl Zeiss)；共聚焦显微镜(型号：TCS SPEⅡ，Leica)。
1.4 实验方法
1.4.1 脱细胞猪结肠支架的制备将新鲜取下的猪结肠组织在流水中冲洗，并用镊子将结肠外的结缔组织、脂肪、淋巴结等钝性剥离后去除，反复用PBS进行清洗。将处理好的猪结肠横断剪成长3.0-4.0 cm的长条管状，把黏膜层向外翻，用2%SDS+0.5%EDTA溶液浸泡，室温下摇床振荡12 h，每3 h换液1次。随后取出，用PBS浸泡洗涤10-15次，浸入1%Triton X100+0.5%EDTA室温振荡12 h，每3 h换液1次。取出后用PBS冲洗10-15次，PBS浸泡下4 ℃冰箱保存。
1.4.2 脱细胞猪结肠支架的组织形态学检测
组织化学染色及免疫荧光染色：将新鲜猪结肠组织及脱细胞结肠组织用PBS漂洗10次，剪成约1 cm×1 cm大小，用滤纸把水分稍吸干，用OCT进行包埋，液氮速冻，冰冻切片机切片，切片厚度为2 0 μm。①苏木精-伊红染色：用PBS清洗玻片上的OCT，用预冷的丙酮浸泡玻片固定10 min，苏木精染色3 min，盐酸乙醇返蓝5 s，流水冲洗5 min，伊红染色1 min，取出后流水冲洗5 min，乙醇梯度脱水、二甲苯透明切片后通风橱风干，中性树脂封固；②DAPI染色：用PBS清洗玻片上的OCT，滴加0.2%Triton通透15 min，PBS洗3遍，用DAPI避光封固。
扫描电镜观察：将新鲜结肠组织及脱细胞结肠组织剪成约5 mm×5 mm正方形片状，用2.5%戊二醛于4 ℃下避光固定过夜，将组织用PBS浸泡清洗3次，每次10 min，分别用体积分数50%，70%，90%乙醇浸泡脱水各1次，每次10 min；用无水乙醇浸泡脱水3次，每次10 min，将脱水后的组织放入临界点干燥仪脱水，喷金，用扫描电子显微镜观察支架黏膜层超微结构。
1.4.3 实验分组人结肠HCT116细胞复苏后经胰酶消化成单细胞悬液，细胞浓度约为5×107 L-1。将细胞悬液滴在细胞爬片上，待镜下观察到细胞贴壁形态，生长至密度约为70%时取出固定。①三维培养：将脱细胞猪结肠支架剪成约1 cm×1 cm大小块状，体积分数75%乙醇浸泡过夜，随后用无菌PBS浸泡清洗3次，用完全培养基浸泡4 h，用无菌滤纸将黏膜层培养基尽量吸干，黏膜层向上，将细胞浓度为2×1010 L-1的单细胞悬液滴在黏膜层表面，使之保持湿润，放入孵箱培养两三小时，取出后沿孔壁小心加入完全培养基培养；②二维培养：取细胞爬片放入12孔板，将人结肠HCT116单细胞悬液滴在细胞爬片上，再沿孔壁小心加入完全培养基，待培养基没过爬片放入孵箱培养。
1.4.4 活-死染色观察细胞生长情况三维培养1，3，7 d后取出脱细胞猪结肠支架，PBS轻轻漂洗1次，避光室温下在黏膜层滴上100 μL活死染色工作液，避光放置5-10 min，荧光显微镜下观察细胞在支架上的黏附、生长情况。
1.4.5 鬼笔环肽染色观察细胞形态二维及三维培养7 d后，用鬼笔环肽工作液进行细胞骨架染色，通过荧光显微镜观察HCT116细胞的生长情况和形态表现。染色方法：用多聚甲醛固定支架过夜；PBS洗3遍，每次5 min；0.2%Triton透膜10 min；PBS洗3遍，每次5 min；加鬼笔环肽工作液(1.5∶1 000)避光染色30 min；PBS洗3遍，每次5 min；加DAPI，避光保存。
1.4.6 支架标本的切片染色三维培养7 d后取出支架，用PBS轻微清洗1次，用滤纸把水分稍吸干，包埋，液氮速冻后进行冰冻切片，用预冷的丙酮浸泡玻片固定，分别进行苏木精-伊红染色与免疫荧光染色。
1.5 主要观察指标 ①猪结肠脱细胞前后组织内细胞核残留情况；②猪结肠脱细胞前后黏膜层的超微结构；③HCT116细胞在脱细胞猪结肠支架上的生长、增殖情况；④HCT116细胞在二维及三维培养模式下的生长形态。

讨论

此次实验介绍了一种以制备脱细胞猪结肠支架为基础，并提供肠癌细胞体外三维培养体系的一种可行性方案。目前最有效的脱细胞方法是联合物理、化学及酶的方法[15-17]，先用物理方法或者化学去垢剂破坏细胞膜，然后用酶将细胞组分与细胞外基质分离开，最后用搅拌、振荡等物理方法提高脱细胞效率，最终达到既能保留较为完整的细胞外基质又能保持其天然机械性能和生物性能的目标。与肾脏、肝脏等实质脏器不同，结肠组织为空腔器官且管壁很薄，所以使用洗涤剂SDS、Triton和EDTA反复振荡洗涤组织进行脱细胞，选择了较为温和的方法进行脱细胞处理，在时间与洗涤溶液浓度配制上也进行了多次调整，最终得到既能完全脱细胞又能保留其基本组织结构的支架。
部分脱细胞支架能提供天然的细胞龛洞[9]，经扫描电镜观察到脱细胞后的支架孔隙大小符合细胞黏附于支架的理想数值[18]，有利于细胞的附着与富集，为下一步利用该支架培养细胞进行体外实验的可行性提供了证据。另一方面，猪与人的细胞外基质蛋白高度保守，猪结肠的基质适用于模拟人结肠。与动物实验相比，脱细胞支架不仅能为细胞提供与正常组织器官相同的空间框架，伦理上又能减少实验动物的牺牲，经济上节约成本，减少了培养周期，能更快地建立起三维培养模型。MAZZA等[19]通过人肝脏脱细胞支架建立了不同细胞在该支架上生长的模型，发现与标准二维细胞培养相比，在支架中生长的实质型和非实质型肝细胞表现出明显不同的基因表达，且人原代肝细胞能在该支架的动态生长条件下保持基本代谢功能和蛋白质合成。越来越多的研究者倾向于使用三维培养体系来进行肿瘤的转移、耐药等方面的研究[20-23]，表明脱细胞结肠支架也具有用作肿瘤转移、耐药方向研究的前景。
已经有相关研究建立了脱细胞羊结肠支架并鉴定了基本表征[24]，或通过建立人结肠脱细胞支架在结肠基质重新种植携带突变基因的肠上皮细胞，证明了脱细胞支架用于肠癌研究的潜力[25]。脱细胞结肠作为细胞培养的载体具有诸多优势，能够提供天然的细胞外基质[26-27]。鉴于结肠恶性肿瘤发展的特殊性，大家忽略了肠癌进展中的关键一步——跨越基底膜的浸润侵袭，这一过程提示了肿瘤转移的开始，也提示了肿瘤患者基本失去了痊愈的机会。但是人工合成的支架很难模拟这一结构，现今大部分三维培养模型大多分为基于支架和无支架2种，包括三维肿瘤球体培养[28-29]、人工合成三维仿生支架等[30-33]，这些模型很难模仿原位肠癌从结肠黏膜向下侵袭的表现。目前大部分脱细胞支架培养是利用肿瘤组织进行脱细胞处理后进行细胞再种植，可是原部位组织形态结构早已被破坏，不能再模拟还原出早期肿瘤发生发展的生物学行为[33]。此次实验直接利用支架本身黏膜层具有的孔隙结构种植肠癌细胞，与普通的动物模型和二维培养模型相比，此次研究建立了更简单经济的培养模型，满足了三维肿瘤模型的最低要求，并通过实验证明该支架能模拟早期肠癌细胞向黏膜下层浸润转移的生物学行为。
研究表明，细胞形态和运动能力的改变与肿瘤的转移相关，而三维培养往往能诱导肿瘤细胞表现出更强的转移侵袭能力[34-35]。HCT116细胞是一种上皮来源的低分化结肠恶性肿瘤细胞，二维培养条件下的HCT116细胞表现为短梭片状，而三维支架上的HC116细胞的形态变圆，聚集在孔隙中生长，孔隙外的边缘细胞呈纺锤形，表明在同一支架的不同的结构平面上细胞的生长形态是不同的，这种物理支撑结构发生改变与细胞的形态改变密切相关。
综上所述，实验介绍了一种制备猪结肠脱细胞支架的方案，且验证了这种支架体外培养HCT116细胞的可行性。利用该方法进行脱细胞处理可彻底地清除支架内的细胞，HCT116细胞在脱细胞支架上能很好地生长、增殖。不同于普通平面培养和人造三维支架培养模型，该支架提供了与结肠组织相似的细胞外基质，有助于研究肿瘤微环境中细胞外基质与肠癌相互作用等研究。同时，肠黏膜表面保留了适合细胞黏附的天然孔隙，细胞可在孔隙内进行增殖，甚至模拟原位结肠恶性肿瘤向肠黏膜下层浸润侵袭，进而突破基底层的这一过程，对于模拟肠腔内生长的原位浸润癌能提供一定的研究价值，这是其他肠癌生长体外三维模型难以实现的。HCT116细胞作为一种低分化结肠癌细胞具有较强的转移、侵袭能力，观察其在脱细胞肠黏膜层的生长形态表现较平面上更为圆润，更符合上皮细胞形态学特点，能聚集在孔隙中成团生长，向黏膜下层生长，而细胞团周围的细胞表现更倾向于间充质细胞的模样，能获得更强的转移、侵袭能力。
该实验仍然存在几点不足：①制备脱细胞支架常采用的化学方法和物理方法仍会对细胞外基质超微结构造成一定的损伤[36]，脱细胞过程也会改变原生组织中细胞外基质的结构和组成配比[37-38]；②该模型仍与体内肿瘤微环境然存在着一定的差异，该支架仅提供了细胞外基质，而血流动力学、成纤维细胞、免疫细胞、相关细胞因子等均未有涉及，而肿瘤微环境是一个构成复杂且动态变化的内环境[9，39-40]，所以后续可以进一步添加血管细胞、成纤维细胞、相关细胞因子等共培养改进造模方法，以期尽量接近于肿瘤微环境；③该模型仅观察了HCT116细胞在支架上的形态表现，没有进一步探究物理结构对于肿瘤转移、侵袭在分子机制上的影响。
中国组织工程研究杂志出版内容重点：生物材料；骨生物材料; 口腔生物材料; 纳米材料; 缓释材料; 材料相容性；组织工程

猪结肠脱细胞支架联合结肠癌HCT116细胞的体外共培养

In vitro co-culture of decellularized matrix of porcine colon with colon cancer HCT116 cells

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